一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法
【專利摘要】一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，它涉及一種松茸活性物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明的方法為：一、原料預(yù)處理；二、超聲波輔助水提取；三、弱堿鹽溶液提??；四、醇溶液提??；五、合并超聲提取液、弱堿鹽溶液提取液和醇溶液提取液，經(jīng)過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸餾后，即得。本發(fā)明打破了松茸活性物質(zhì)利用率低的局限性，利用多種提取方式綜合提取，大大提高了松茸活性成分的得率，增加了松茸濃縮液的有效成分含量，提取的水溶性多糖、維生素C、黃酮、堿性蛋白質(zhì)、多酚和三萜等活性成分具有可以增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗疲勞的功效，更有利于人體吸收，并結(jié)合口服液使用簡(jiǎn)單、方便，便于保藏等優(yōu)勢(shì)，大大提高了松茸的利用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】_種鮮松昔活性物質(zhì)的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種松茸活性物質(zhì)的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 松茸作為一種珍貴稀有的食藥用真菌，其含有豐富的營養(yǎng)活性物質(zhì)，具有重要的 保健功能和藥用價(jià)值，其應(yīng)用已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注。松茸的商業(yè)價(jià)值，一直深受日本、美國 和歐洲等國家消費(fèi)者的青睞。由于松茸的生長、采集受季節(jié)、地域、氣候等因素的限制，難以 保鮮貯存，致使松茸價(jià)格昂貴，浮動(dòng)頻繁，國內(nèi)外只有極少數(shù)人能夠食用到，大多數(shù)人很難 品嘗到松茸制品，享受松茸制品的美味與保健作用。目前國內(nèi)外對(duì)松茸的研宄比較少，栽培 方面還僅限于人工促豐產(chǎn)技術(shù)，加工方面也只是簡(jiǎn)單的保鮮技術(shù)，市場(chǎng)上松茸加工產(chǎn)品較 少，國內(nèi)外尚無對(duì)松茸功能性有效成分提取與產(chǎn)品開發(fā)。
[0003] 進(jìn)行松茸功能性濃縮飲品開發(fā)，可以在實(shí)現(xiàn)松茸資源持續(xù)高效利用前提下，為松 茸保健品市場(chǎng)開拓新的思路。此外，作為前瞻性的基礎(chǔ)研宄，還可為今后陸續(xù)開發(fā)姬松茸、 靈芝等食用菌類功能性濃縮飲品提供依據(jù)。
[0004] 但受季節(jié)、地域、氣候等因素的限制，其難以保鮮貯存，導(dǎo)致大量活性物質(zhì)流失，營 養(yǎng)價(jià)值降低。松茸保鮮一度是世界性難題。如何在最大程度上保全松茸營養(yǎng)成分并可長期 儲(chǔ)存是亟待解決的問題，也是未來研宄的必然趨勢(shì)。更重要的是目前的方法不能將松茸等 外品和邊角料加以利用，不能減少資源的浪費(fèi)，變廢為寶，增收節(jié)支，為綜合有效利用松茸 資源創(chuàng)造新途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決上述存在的問題，而采超聲波輔助水提取、弱堿鹽溶液 提取、醇溶液提取，提取出松茸中營養(yǎng)和功能性成分，得到了一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方 法。
[0006] 本發(fā)明的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：
[0007] -、選擇新鮮、無病殘、無蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水；將松茸子實(shí)體進(jìn)行切 片處理；加入其20倍體積無菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有質(zhì)量百分含量為 0. 03%的檸檬酸、質(zhì)量百分含量為0. 02%正丁醇與質(zhì)量百分含量為0. 02%肉豆蔻酯的混 合溶液中，減壓浸漬IOmin后，加入質(zhì)量百分含量為0. 02% EDTA和質(zhì)量百分含量為0. 2% 檸檬酸鈉，然后搗碎松茸組織，再按體積比為I: I: (1?2)的比例加入6?7g/L的纖維素 酶、6?7g/L的果膠酶和6?7g/L的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)得松茸處理原料；其中，酶 解反應(yīng)條件為pH = 5、溫度為50°C、酶解時(shí)間為I. 5h、酶與底物濃度比為1:3. 3 ;
[0008] 二、超聲波輔助水提取：將步驟一得到的松茸處理原料置于20倍松茸處理原料 體積的水中進(jìn)行超聲提取，收集松茸超聲提取液和殘?jiān)?；其中，超聲處理?xiàng)l件為：聲波功率 5?150w，提取時(shí)間5?25min，超聲波工作時(shí)間1?5s，間隔時(shí)間1?5s ;
[0009] 三、弱堿鹽溶液提?。合虿襟E二收集的殘?jiān)屑尤?0倍殘?jiān)w積的弱堿溶液進(jìn)行 提取，其中，弱堿溶液含有質(zhì)量百分含量為0. 1?0. 5%的碳酸氫鈉溶液和質(zhì)量百分含量 為0. 5?2. 5%氯化鈉溶液，收集松茸弱堿鹽溶液提取液和殘?jiān)?；其中，提取時(shí)間為30? 150min，提取溫度為50?90°C ;
[0010] 四、醇溶液提取：將步驟三收集殘?jiān)糜?0倍殘?jiān)w積的體積百分含量為50? 90%的乙醇中，然后在水浴溫度為50?90°C的條件下提取30?150min，得松茸醇溶液提 取液；
[0011] 五、收集步驟二得到的松茸超聲提取液、步驟三得到的松茸弱堿鹽溶液提取液和 步驟四得到的松茸醇溶液提取液，混合后，用100目的尼龍66濾層過濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝 置以50°C、60r/min的條件對(duì)上述混合溶液進(jìn)行蒸餾濃縮，蒸餾濃縮至原混合溶液體積的 1/10,即完成所述的松茸活性物質(zhì)提取。
[0012] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0013] 本發(fā)明打破了松茸活性物質(zhì)利用率低的局限性，通過改變提取方式，增加了松茸 濃縮液的提取率，并結(jié)合口服液使用簡(jiǎn)單、方便，便于保藏等優(yōu)勢(shì)，大大提高了松茸的利用 價(jià)值與經(jīng)濟(jì)效益。
[0014] 目前，松茸的研宄大部分還只局限于對(duì)松茸單一成分的提取與利用，而忽略了其 他營養(yǎng)成分及各成分間的相互作用。普通的熱水浸提法、水煮醇沉法只能提取少量的營養(yǎng) 物質(zhì)，要將所有的營養(yǎng)成分提取出來是極其困難的，這對(duì)松茸的利用造成了浪費(fèi)。本發(fā)明為 了提高松茸的利用率及松茸整體營養(yǎng)價(jià)值，采用分步提取法對(duì)松茸中的成分進(jìn)行全面有效 的提取，既能最大限度的提取出松茸中的各種營養(yǎng)成分，又能保持營養(yǎng)價(jià)值不受損失，也有 利于松茸的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的超聲波輔助水提取的最佳工藝為：超聲波功率125w，提取時(shí)間lOmin，超 聲波工作時(shí)間4s，間隔時(shí)間Is ;弱堿鹽溶液提取的最佳工藝為：碳酸氫鈉濃度0. 3%，氯化 鈉濃度0. 5%，提取時(shí)間120min，提取溫度80°C;醇溶液提取的最佳工藝為：乙醇濃度80%， 提取時(shí)間30min，提取溫度70°C。在最佳工藝條件下測(cè)得的超聲波輔助水提取中松茸水溶 性多糖的得率為〇. 52g/100g，維生素 C的得率為3. 0mg/100g，黃酮的得率為7. lmg/100g ; 弱堿鹽溶液提取出的堿性蛋白質(zhì)的得率為I. 16g/100g ;醇溶液提取出的多酚和三萜的得 率分別為 I. 16mg/100g 和 0· 23g/100g。
[0016] 本發(fā)明對(duì)松茸濃縮口服液的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，及對(duì)其感觀、相對(duì)密度、pH值、衛(wèi)生學(xué) 指標(biāo)和營養(yǎng)成分含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，松茸濃縮口服液呈澄明的黃褐色液體，無渾濁 和沉淀，味甘，相對(duì)密度為I. l〇±〇. 05g/mL，pH值為7. 50±0. 05,每支裝量為10mL，棕色瓶 包裝，衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)符合標(biāo)準(zhǔn)，IOOmL中含有多糖86. 7±0. 2mg、維生素 C 0. 50±0. 04mg、黃酮 I. 18±0.04mg、蛋白質(zhì) 193.3±0.3mg、多酚 0· 19±0.02mg、三萜 38·3±0· lmg，檢測(cè)出 17 種 氨基酸，其品質(zhì)良好。
[0017] 以小鼠的免疫調(diào)節(jié)能力、抗氧化性及抗疲勞能力作為檢測(cè)指標(biāo)對(duì)本發(fā)明方法制備 的松茸濃縮口服液進(jìn)行檢測(cè)，以灌胃生理鹽水小鼠作為對(duì)照，檢驗(yàn)了灌胃松茸濃縮口服液 后小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況。結(jié)果表明：灌胃松茸濃縮口服液21d后免疫調(diào)節(jié)能力中胸 腺指數(shù)提高26%，脾臟指數(shù)提高9. 1%，血清IgG含量提高11%，巨噬細(xì)胞吞噬能力提高 51 %，與對(duì)照組相比差異顯著（P< 0.05);在抗氧化能力檢測(cè)中，試驗(yàn)組灌胃21d后MDA含 量降低57%，SOD含量提高11 %，與對(duì)照組相比差異顯著（P < 0. 05);在抗疲勞能力檢測(cè) 中，灌胃21d后，力竭游泳時(shí)間提高39%，無顯著性差異；血乳酸含量和血清尿素氮分別降 低了 29 %和49 %，與對(duì)照組相比差異顯著（P < 0. 05)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0019] 圖2為維生素 C標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0020] 圖3為黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0021] 圖4為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0022] 圖5為多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023] 圖6為三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】

【具體實(shí)施方式】 [0024] 一：本實(shí)施方式的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，它是按照以下 步驟進(jìn)彳丁的：
[0025] 一、選擇新鮮、無病殘、無蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水；將松茸子實(shí)體進(jìn)行切 片處理；加入其20倍體積無菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有質(zhì)量百分含量為 0. 03%的檸檬酸、質(zhì)量百分含量為0. 02%正丁醇與質(zhì)量百分含量為0. 02%肉豆蔻酯的混 合溶液中，減壓浸漬IOmin后，加入質(zhì)量百分含量為0. 02% EDTA和質(zhì)量百分含量為0. 2% 檸檬酸鈉，然后搗碎松茸組織，再按體積比為I: I: (1?2)的比例加入6?7g/L的纖維素 酶、6?7g/L的果膠酶和6?7g/L的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)得松茸處理原料；其中，酶 解反應(yīng)條件為pH = 5、溫度為50°C、酶解時(shí)間為I. 5h、酶與底物濃度比為1:3. 3 ;
[0026] 二、超聲波輔助水提取：將步驟一得到的松茸處理原料置于20倍松茸處理原料 體積的水中進(jìn)行超聲提取，收集松茸超聲提取液和殘?jiān)?；其中，超聲處理?xiàng)l件為：聲波功率 5?150w，提取時(shí)間5?25min，超聲波工作時(shí)間1?5s，間隔時(shí)間1?5s ;
[0027] 三、弱堿鹽溶液提?。合虿襟E二收集的殘?jiān)屑尤?0倍殘?jiān)w積的弱堿溶液進(jìn)行 提取，其中，弱堿溶液含有質(zhì)量百分含量為〇. 1?〇. 5%的碳酸氫鈉溶液和質(zhì)量百分含量 為0. 5?2. 5%氯化鈉溶液，收集松茸弱堿鹽溶液提取液和殘?jiān)?；其中，提取時(shí)間為30? 150min，提取溫度為50?90°C ;
[0028] 四、醇溶液提?。簩⒉襟E三收集殘?jiān)糜?0倍殘?jiān)w積的體積百分含量為50? 90%的乙醇中，然后在水浴溫度為50?90°C的條件下提取30?150min，得松茸醇溶液提 取液；
[0029] 五、收集步驟二得到的松茸超聲提取液、步驟三得到的松茸弱堿鹽溶液提取液和 步驟四得到的松茸醇溶液提取液，混合后，用100目的尼龍66濾層過濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝 置以50°C、60r/min的條件對(duì)上述混合溶液進(jìn)行蒸餾濃縮，蒸餾濃縮至原混合溶液體積的 1/10,即完成所述的松茸活性物質(zhì)提取。
[0030] 本實(shí)施方式超聲波輔助水提取中松茸水溶性多糖的得率為0. 52g/100g :維生素 C 的得率為3. 0mg/100g :黃酮的得率為7. lmg/100g ;
[0031] 弱堿鹽溶液提取出的堿性蛋白質(zhì)的得率為I. 16g/100g ;
[0032] 醇溶液提取出的多酚和三萜的得率分別為I. 16mg/100g和0. 23g/100g。

【具體實(shí)施方式】 [0033] 二：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟一中的按體積比 為1:1:1. 4的比例加入6. 8g/L的纖維素酶、6. 8g/L的果膠酶和6. 8g/L的木瓜蛋白酶進(jìn)行 酶解反應(yīng)。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0034] 三：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟二中超聲處理?xiàng)l 件為：聲波功率100?150w，提取時(shí)間5?lOmin，超聲波工作時(shí)間2?4s，間隔時(shí)間1? 3s。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0035] 四：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟二中超聲處理?xiàng)l 件為：聲波功率125w，提取時(shí)間lOmin，超聲波工作時(shí)間4s，間隔時(shí)間Is。其它與具體實(shí)施 方式一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0036] 五：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟三中弱堿溶液含 有質(zhì)量百分含量為〇. 3%的碳酸氫鈉溶液和質(zhì)量百分含量為0. 5%氯化鈉溶液。其它與具 體實(shí)施方式一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0037] 六：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟三中提取時(shí)間為 90?150min，提取溫度為70?90°C。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0038] 七：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟三中提取時(shí)間為 120min，提取溫度為80°C。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0039] 八：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟四中乙醇的體積 百分含量為80%。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0040] 九：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟四中在水浴溫度 為60?80°C的條件下提取30?90min。其它與一相同。
[0041]

【具體實(shí)施方式】十：本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是：步驟四中在水浴溫度 為70°C的條件下提取30min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0042] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)【具體實(shí)施方式】的組 合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
[0043] 通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：
[0044] 實(shí)施例一
[0045] 松茸中含有大量的營養(yǎng)及功能性成分，特別是新鮮松茸對(duì)人體健康有益，但是新 鮮松茸存在不易保藏、有效成分利用率低等缺點(diǎn)。
[0046] 針對(duì)上述問題，本實(shí)施例為了最大限度的提取出松茸中的營養(yǎng)物質(zhì)與功能性成 分，根據(jù)其性質(zhì)，采超聲波輔助水提取、弱堿鹽溶液提取、醇溶液提取，提取出松茸中營養(yǎng)和 功能性成分，同時(shí)考慮了提取工藝的復(fù)雜程度、穩(wěn)定性及生產(chǎn)成本，得到了鮮松茸濃活性物 質(zhì)的制備工藝。
[0047] 以下實(shí)施例所需松茸來源黑龍江省牡丹江市東寧縣的新鮮松茸。
[0048] 1、具體方法
[0049] 2、原材料預(yù)處理
[0050] 選擇新鮮、無病殘、無蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水。將松茸子實(shí)體進(jìn)行切片 處理；用電子天平稱量重量，加入20倍體積無菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有 0. 03%的檸檬酸、0. 02%正丁醇與0. 02%肉豆蔻酯的混合溶液中，減壓浸漬lOmin。加入 0. 02% EDTA、0. 2%檸檬酸鈉，用組織搗碎器將組織破壞。加入纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白 酶，按6. 8g/L加入進(jìn)行酶解反應(yīng)，三種酶的比例為I: I: I. 4。
[0051] 3、對(duì)預(yù)處理后的原料，以此進(jìn)行超聲波輔助水提取一弱堿鹽溶液提取一醇溶液提 ?。?br> [0052] -、超聲波輔助水提?。簩⒉襟E一得到的松茸處理原料置于水中進(jìn)行超聲提取 (松茸原料與水的用量比例關(guān)系是1:30)，收集松茸超聲提取液和殘?jiān)?；其中，超聲處理?xiàng)l 件為：聲波功率125w，提取時(shí)間lOmin，超聲波工作時(shí)間4s，間隔時(shí)間Is ;
[0053] 二、弱堿鹽溶液提?。合虿襟E二收集的殘?jiān)屑尤?0倍殘?jiān)w積的弱堿溶液進(jìn)行 提取，其中，弱堿溶液含有質(zhì)量百分含量為〇. 3%的碳酸氫鈉溶液和質(zhì)量百分含量為0. 5% 氯化鈉溶液，收集松茸弱堿鹽溶液提取液和殘?jiān)?；其中，提取時(shí)間為120min，提取溫度為 80 0C ；
[0054] 三、醇溶液提?。簩⒉襟E三收集殘?jiān)糜?0倍殘?jiān)w積的體積百分含量為80%的 乙醇中，在醇溶液的溫度為70°C的條件下提取30min，得松茸醇溶液提取液。
[0055] 對(duì)松茸經(jīng)超聲波輔助水提取一弱堿鹽溶液提取一醇溶液提取過程后，測(cè)得的超聲 波輔助水提取中松茸水溶性多糖的得率為〇. 52g/100g，維生素 C的得率為3. 0mg/100g，黃 酮的得率為7. lmg/100g ;弱堿鹽溶液提取出的堿性蛋白質(zhì)的得率為I. 16g/100g ;醇溶液提 取出的多酚和三萜的得率分別為I. 16mg/100g和0. 23g/100g。
[0056] 實(shí)施例二
[0057] 1、制備松茸濃縮口服液
[0058] (1)將新鮮松茸進(jìn)行原料預(yù)處理（同第2部分的原料預(yù)處理）；
[0059] (2)超聲波輔助水提?。簩⑸辖?jīng)預(yù)處理后的松茸在超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行超聲 提取，調(diào)節(jié)超聲功率125w、超聲時(shí)間10min、工作時(shí)間4s、間隔時(shí)間ls，用4000r/min的離心 機(jī)分離l〇min，得到提取液1和殘?jiān)? ;
[0060] (3)弱堿鹽溶液提取：將殘?jiān)?浸漬在松茸質(zhì)量20倍體積含有0. 3%碳酸氫鈉、 0. 5%氯化鈉溶液中，80°C恒溫提取120min。然后用4000r/min速度離心分離10min，得到 提取液2和殘?jiān)? ;
[0061 ] (4)乙醇溶液提?。簩?jiān)?浸漬在松茸質(zhì)量20倍體積含有80%乙醇溶液中70°C 恒溫水浴鍋中提取30min，得到提取液3 ;
[0062] (5)濃縮蒸餾：將三次提取液混合，然后進(jìn)行過濾，用100篩眼的尼龍66濾層過 濾。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置以50°C、60r/min對(duì)上述混合溶液進(jìn)行蒸餾濃縮，蒸餾濃縮至總體積 的1/10,滅菌灌裝。得到黃褐色澄清透明口服液。
[0063] 2、制得的松茸濃縮口服液進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)分析
[0064] 2. 1品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)
[0065] (1)感觀評(píng)價(jià)
[0066] 取3批松茸濃縮口服液，由10位專業(yè)人士對(duì)其色澤、香味及組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，取 平均值進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0067] (2)相對(duì)密度檢查
[0068] 分別取3批松茸濃縮口服液樣品用比重計(jì)測(cè)定其相對(duì)密度，每批樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。
[0069] (3) pH 值檢查
[0070] 分別取3批松茸濃縮口服液樣品，參照2010版國家藥典附錄W G pH值測(cè)定法，用 酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前用硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正，每批樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。
[0071] (4)衛(wèi)生學(xué)檢查
[0072] 參照《中國藥典》（2010版一部）附錄IG合劑的微生物限度有關(guān)規(guī)定，依據(jù)附MC 微生物限度檢測(cè)法所述步驟，分別對(duì)松茸濃縮口服液中細(xì)菌數(shù)、霉菌和大腸埃希菌數(shù)進(jìn)行 了檢測(cè)。
[0073] (5)營養(yǎng)成分含量測(cè)定
[0074] 1)多糖
[0075] (1)水溶性多糖的得率測(cè)定
[0076] ①葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0077] 采用苯酚硫酸法測(cè)定松茸多糖含量。準(zhǔn)確稱取葡糖標(biāo)準(zhǔn)品100mg，蒸餾水定容至 100mL，得到濃度為I. Omg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0. lmL、0. 2mL、0. 4mL、 0. 6mL、0. 8mL、I. OmL，補(bǔ)水至2. OmL。加入50g/L的苯酚溶液I. OmL，濃硫酸5. OmL，混勻，沸 水浴2min。冷卻后在495nm處測(cè)吸光值，以多糖濃度（mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD495) 為縱坐標(biāo)，如圖1所示。
[0078] ②水溶性多糖得率的計(jì)算
[0079] 取ImL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中 多糖的濃度，可計(jì)算：
[0080] 水溶性多糖得率=提取液中水溶性多糖質(zhì)量/松茸質(zhì)量X 100%。
[0081] 2)維生素 C
[0082] 維生素 C的得率
[0083] ①維生素 C標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0084] 精確稱取草酸6. 30g，EDTA0. 0584g，充分溶解后定容至100mL，準(zhǔn)確稱取干燥的維 生素 C 5mg，用草酸-EDTA 溶液定容至 500mL，分別吸取 0· 8mL、l. 2mL、l. 6mL、2. 0mL、2. 4mL、 2. 8mL、3. 2mL的標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液于50mL的容量瓶中，然后加人草酸-EDTA溶液，使總體積 達(dá)到10mL。再加入I. OmL的偏磷酸一醋酸溶液和5 %的硫酸2. OmL，搖勻加人4. OmL的鋁酸 銨，在705nm下測(cè)定吸光值，以維生素 C濃度（μ g/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD7tl5)為縱坐 標(biāo)，如圖2所示。
[0085] ②維生素 C得率的計(jì)算
[0086] 取ImL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中 維生素 C的濃度，可計(jì)算：
[0087] 維生素 C得率=提取液中維生素 C質(zhì)量/松茸質(zhì)量X 100%。
[0088] ③黃酮
[0089] 3)黃酮的得率
[0090] ①黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0091] 精確稱取20mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙醇溶液定容至100mL，得0. 2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn) 溶液，量取標(biāo)準(zhǔn)溶液 I. 0mL、3. 0mL、5. 0mL、7. 0mL、13. 0mL、17. 0mL、23. OmL。分別置于 IOOmL 容量瓶中，每個(gè)容量瓶中加入5%亞硝酸鈉溶液I. OmL，放置6min后，再分別加入10%硝酸 鋁溶液I. 0mL，靜置6min后分別加入4%氫氧化鈉溶液10mL，使用50%乙醇溶液定容，靜置 IOmin后，于508nm處測(cè)吸光值，以蘆丁濃度（μ g/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD5tl8)為縱坐 標(biāo)，如圖3所示。
[0092] ②黃酮得率的計(jì)算
[0093] 取ImL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中 黃酮的濃度，可計(jì)算：
[0094] 黃酮得率=提取液中黃酮質(zhì)量/松茸質(zhì)量X 100%。
[0095] 4)蛋白質(zhì)
[0096] 堿溶性蛋白質(zhì)的得率
[0097] ①蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0098] 首先將牛血清白蛋白用0. 15mol/mL的氯化鈉溶液配成I. Omg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶 液。再準(zhǔn)確稱取1〇〇呢考馬斯亮藍(lán)6-250，溶于5〇1^95%的乙醇后，加入12〇11^85%的磷 酸，用蒸餾水稀釋至1L。取6支試管分別加入I. Omg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0. lmL、0. 2mL、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL，然后用0. 15mol/mL氯化鈉溶液補(bǔ)充到lmL，最后個(gè)試管分別加 入5. OmL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑。每加完一管，立即在旋渦混合器上混勻。加完試劑2-5min 后，于595nm處測(cè)吸光值。以牛血清白蛋白濃度（mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD595)為縱 坐標(biāo)，如圖4所示。
[0099] ②堿溶性蛋白質(zhì)得率的計(jì)算
[0100] 取ImL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中 堿溶性蛋白質(zhì)的濃度，可計(jì)算：
[0101] 堿溶性蛋白質(zhì)得率=提取液中堿溶性蛋白質(zhì)量/松茸質(zhì)量X 1〇〇%。
[0102] 5)多酚
[0103] 多酚的得率
[0104] ①多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0105] 精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用水溶解并定容至250mL，得到0. lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn) 溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液〇. lmL、0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL于IOOmL容量瓶中，加 入ImL福林酷顯色劑，搖勾后再加入2mL15%碳酸鈉溶液，定容至100mL，室溫下反應(yīng)2h后 于760nm處測(cè)吸光值，以沒食子酸濃度（μ g/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD76tl)為縱坐標(biāo)，如 圖5所示。
[0106] ②多酚得率的計(jì)算
[0107] 取ImL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中 多酚的濃度，可計(jì)算
[0108] 多酚得率=提取液中多酚質(zhì)量/松茸質(zhì)量X 100%。
[0109] 6)三萜
[0110] 二貓得率的計(jì)算
[0111] ①三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0112] 精確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品I. 150mg，溶于IOmL無水乙醇中，得0. 115mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。 精確吸取 〇. lmL、0. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、I. OmL、I. 2mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于 IOmL 試管中，水浴蒸 干溶劑。分別向每支試管中加入5%香草醛-冰醋酸0. 5mL、高氯酸lmL，密封。60°C水浴加 熱15min，取出置于冰水中冷卻。再向每支試管中加入5mL冰醋酸溶液，搖勻。于548nm處 測(cè)吸光值，以熊果酸質(zhì)量（μg)為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD548)為縱坐標(biāo)，如圖6所示。
[0113] ②三萜得率的計(jì)算
[0114] 取ImL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中 多糖的濃度，可計(jì)算
[0115] 三萜得率=提取液中三萜質(zhì)量/松茸質(zhì)量X 100%。
[0116] ⑦氨基酸
[0117] 利用氨基酸分析儀測(cè)定。
[0118] 3、結(jié)果與分析
[0119] 3.1感觀評(píng)價(jià)
[0120] 口服液的感觀是消費(fèi)者對(duì)于口服液的第一認(rèn)識(shí)與評(píng)價(jià)，所以口服液的感觀直接影 響了其品質(zhì)的好壞，本試驗(yàn)由10位經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練人士對(duì)松茸濃縮口服液的感觀進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié) 果如表1所示。
[0121] 表1松茸濃縮口服液性狀感官評(píng)價(jià)
[0122]

【權(quán)利要求】
1. 一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行的： 一、 選擇新鮮、無病殘、無蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水；將松茸子實(shí)體進(jìn)行切片處 理；加入其20倍體積無菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有質(zhì)量百分含量為0. 03% 的檸檬酸、質(zhì)量百分含量為〇. 02%正丁醇與質(zhì)量百分含量為0. 02%肉豆蔻酯的混合溶液 中，減壓浸漬lOmin后，加入質(zhì)量百分含量為0. 02% EDTA和質(zhì)量百分含量為0. 2%朽1檬酸 鈉，然后搗碎松茸組織，再按體積比為1:1: (1?2)的比例加入6?7g/L的纖維素酶、6? 7g/L的果膠酶和6?7g/L的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)得松茸處理原料；其中，酶解反應(yīng)條 件為pH = 5、溫度為50°C、酶解時(shí)間為1. 5h、酶與底物濃度比為1:3. 3 ; 二、 超聲波輔助水提?。簩⒉襟E一得到的松茸處理原料置于20倍松茸處理原料體積 的水中進(jìn)行超聲提取，收集松茸超聲提取液和殘?jiān)?；其中，超聲處理?xiàng)l件為：聲波功率5? 150w，提取時(shí)間5?25min，超聲波工作時(shí)間1?5s，間隔時(shí)間1?5s ; 三、 弱堿鹽溶液提?。合虿襟E二收集的殘?jiān)屑尤?0倍殘?jiān)w積的弱堿溶液進(jìn)行提 取，其中，弱堿溶液含有質(zhì)量百分含量為〇. 1?〇. 5%的碳酸氫鈉溶液和質(zhì)量百分含量 為0. 5?2. 5%氯化鈉溶液，收集松茸弱堿鹽溶液提取液和殘?jiān)?；其中，提取時(shí)間為30? 150min，提取溫度為50?90°C ; 四、 醇溶液提?。簩⒉襟E三收集殘?jiān)糜?0倍殘?jiān)w積的體積百分含量為50?90% 的乙醇中，然后在水浴溫度為50?90°C的條件下提取30?150min，得松茸醇溶液提取液； 五、 收集步驟二得到的松茸超聲提取液、步驟三得到的松茸弱堿鹽溶液提取液和步驟 四得到的松茸醇溶液提取液，混合后，用100目的尼龍66濾層過濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置以 50°C、60r/min的條件對(duì)上述混合溶液進(jìn)行蒸餾濃縮，蒸餾濃縮至原混合溶液體積的1/10， 即完成所述的松茸活性物質(zhì)提取。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟一中的按 體積比為1:1:1. 4的比例加入6. 8g/L的纖維素酶、6. 8g/L的果膠酶和6. 8g/L的木瓜蛋白 酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟二中超聲 處理?xiàng)l件為：聲波功率100?150w，提取時(shí)間5?lOmin，超聲波工作時(shí)間2?4s，間隔時(shí) 間1?3s。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟二中超聲 處理?xiàng)l件為：聲波功率125w，提取時(shí)間lOmin，超聲波工作時(shí)間4s，間隔時(shí)間Is。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟三中弱堿 溶液含有質(zhì)量百分含量為〇. 3%的碳酸氫鈉溶液和質(zhì)量百分含量為0. 5%氯化鈉溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟三中提取 時(shí)間為90?150min，提取溫度為70?90°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟三中提取 時(shí)間為120min，提取溫度為80°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟四中乙醇 的體積百分含量為80%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟四中在水 浴溫度為60?80°C的條件下提取30?90min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鮮松茸活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟四中在 水浴溫度為70°c的條件下提取30min。
【文檔編號(hào)】A61P39/00GK104431995SQ201510018428
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2015年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月14日
【發(fā)明者】佟立君, 么宏偉, 雷虹, 付婷婷, 胡偉, 范永鵬, 馮磊, 謝晨陽, 趙鳳臣, 吳洪軍, 張學(xué)義 申請(qǐng)人:佟立君