專利名稱：致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑制備方法，特別是致病性嗜水氣單胞菌滅活疫 苗的制備方法，屬于微生物疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
嗜水氣單胞菌廣泛分布于近岸海水，河流湖泊，下水道廢水中，是一種 條件致病菌，可引起人和多種動物的敗血癥、腹瀉等疾病，在一定條件下會 引起暴發(fā)流行，近年來，我國常有因嗜水氣單胞菌引起許多水產(chǎn)動物發(fā)病或
大量死亡(陸承平，水產(chǎn)學(xué)報，1992， 16 (3))以及使人類致病的報道。褐 牙鲆是珍貴的經(jīng)濟(jì)魚類之一，目前在中國北方沿海地區(qū)大規(guī)模養(yǎng)殖，本發(fā)明 人從河北唐山的會達(dá)水產(chǎn)公司和普林海珍的發(fā)病褐牙鲆體內(nèi)均分離到致病 菌，經(jīng)生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定表明該菌為嗜水氣單胞菌，是導(dǎo)致牙 鲆腹水病和敗血癥的直接致病菌，感染了該菌的病魚，出現(xiàn)腹腔積水，腸積 水及出血等癥狀，該病極易傳染，嚴(yán)重時可導(dǎo)致大批牙鲆的死亡，嚴(yán)重危害 養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。多年以來，對于該病的防治主要依賴于抗生素的治療，雖然 有一定效果，但是容易產(chǎn)生耐藥性和造成體內(nèi)、河水環(huán)境的藥物殘留，威脅 人體的健康和安全。因此，尋找治療該病的安全有效的途徑成為業(yè)內(nèi)的共同 任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備方法，克 服了以往此類魚病使用抗生素治療所產(chǎn)生的體內(nèi)藥物殘留問題。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的免疫，是防治因嗜水氣單胞菌引起牙鲆腹水病 和敗血癥的一條重要途徑。本發(fā)明直接從病魚體內(nèi)分離致病菌，經(jīng)鑒定后以 該病原菌為抗原制備滅活疫苗。將該疫苗給健康魚注射后通過凝集試驗和間 接ELISA檢測免疫后的牙鲆體內(nèi)的血清抗體水平，從而可以測定疫苗的效果。
具體說本發(fā)明的致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備方法包括以下步
驟(l)通過PCR檢測將分離自患腹水病褐牙鲆體內(nèi)的致病性嗜水氣單胞菌 于普通LB培養(yǎng)基中搖培12~16小時，用分光光度計檢測OD值，達(dá)到0.6以 上或檢測菌濃度達(dá)到109CFU/mL; (2)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3% 0.4%甲醛溶液對 致病性嗜水氣單胞菌進(jìn)行滅活，于37'C滅活12小時，其間振搖2 3次；(3) 將所得滅活菌液于5000rpm離心10分鐘，收集菌體，用生理鹽水重懸后即 可得到致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗。
使用該疫苗免疫時采用滲透壓差的方法進(jìn)行浸泡免疫，主要激發(fā)魚體的 粘膜免疫。具體操作如下①將待免牙鲆依據(jù)生產(chǎn)條件分為若干組，每組20 尾，置于濃度為8"/。的NaCl溶液中，浸泡2分鐘；②將浸泡過的牙鲆撈出后 置于10倍稀釋的疫苗溶液中，浸泡3分鐘，依此類推；③一周之后以同樣方 法加強(qiáng)免疫一次。其余詞養(yǎng)條件與其他牙鲆一致。
將所制備疫苗腹腔注射于昆明小鼠，經(jīng)過安全性檢測后，試驗用的小鼠 一切正常，內(nèi)臟剖檢未見任何異常，初步證明該疫苗使用安全。將疫苗免疫 小鼠兩次，通過凝集實驗及間接ELISA檢測抗血清抗體滴度，在波長450nm 處檢測其分光光度，表明陽性孔發(fā)生了明顯的抗原抗體反應(yīng)，證明該疫苗具 有良好的免疫原性。第35天以最小致死劑量進(jìn)行攻毒，生理鹽水對照組小鼠 全部死亡，免疫過的小鼠免疫保護(hù)率達(dá)到80%。
本發(fā)明取得的有益效果是該疫苗制備方法操作快速簡便，所采用的試 劑無毒無副作用，且價廉易儲存，易于進(jìn)行大量制備。使用該方法制備的疫 苗免疫保護(hù)率達(dá)到80%,由于該疫苗為純生物制劑，因此無任何毒副作用， 不會對牙鲆的肉質(zhì)和周圍水體造成污染，可以從根本上遏制病原的傳播。為 大規(guī)模研制牙鲆滅活疫苗和科學(xué)防控牙鲆腹水病奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明。 實施例1 致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備 將通過PCR檢測的分離自患腹水病褐牙鲆體內(nèi)的致病性嗜水氣單胞菌接種 于普通LB培養(yǎng)基，置于搖床上，設(shè)置培養(yǎng)溫度為3(TC，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為160rpm
搖培12-16小時，用分光光度計檢測OD值達(dá)到0.6以上或檢測菌濃度達(dá)到 109 CFU/mL;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3% 0.4%的甲醛溶液對致病性嗜水氣單胞菌 進(jìn)行滅活，該混合液于37'C下恒溫滅活12小時，其間振搖2 3次；將滅活 過的菌液取lOOjil涂布于平板上，進(jìn)行無菌檢驗；取出后將所得滅活菌液置 于離心機(jī)上，轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心10分鐘，將上清液棄去，收集剩余菌體， 根據(jù)需要用適量生理鹽水重懸后即可得到致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗，放
置在4t:條件下保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2疫苗免疫實驗(1)
2006年4月，在唐山普林海珍水產(chǎn)養(yǎng)殖公司進(jìn)行小規(guī)模免疫實驗，隨 機(jī)抽取30尾平均體重為50g的褐牙鲆，平均分為三組，每組10尾，使用實 施例1制備的致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗進(jìn)行免疫試驗，具體方法如下 首先測定嗜水氣單胞菌最小致死劑量(MLD),測得牙鲆的最小致死劑量為1 X109CFU/mL;然后將制備的嗜水氣單胞菌滅活疫苗，采用腹腔注射方法進(jìn) 行免疫，第一組為生理鹽水對照組，第二組為不加強(qiáng)免疫組，第三組為加強(qiáng) 免疫組，每尾牙鲆注射所制備的疫苗250nl，飼養(yǎng)一周后，第三組加強(qiáng)免疫一 次，第二組繼續(xù)飼養(yǎng)；35天后按照最小致死劑量(MLD)對每尾牙解進(jìn)行活 菌攻毒實驗， 一周內(nèi)對照組褐牙鲆全部死亡，其余兩免疫組的免疫保護(hù)率分 別達(dá)到60%和80%。 實施例3疫苗免疫實驗(2)
依照上述方法于2006年5月，在唐山會達(dá)水產(chǎn)養(yǎng)殖公司進(jìn)行了小規(guī)模注 射免疫試驗，隨機(jī)抽取60尾平均體重為100g的褐牙鲆，共分為三組，第一 組為生理鹽水對照組，第二組為疫苗免疫組，第三組為疫苗加佐劑免疫組， 每尾牙鲆注射所制備的疫苗250fd,飼養(yǎng)一周后，同法免疫一次；35天后對 每尾牙鲆進(jìn)行活菌攻毒，按照最小致死劑量(MLD)進(jìn)行攻毒，每尾注射活菌 量為150nl， 一周內(nèi)對照組褐牙鲆全部死亡，其余兩組的免疫保護(hù)率分別達(dá)到 70%和80%。
實施例4疫苗免疫實驗(3)
在唐山十里海紫天養(yǎng)殖場進(jìn)行較大規(guī)模免疫試驗，對200尾牙鲆進(jìn)行免
疫,將牙鲆分為每20尾一組,每一組先在9%的高濃度NaCl溶液中浸泡2min， 再快速轉(zhuǎn)移至10倍稀釋的疫苗溶液中，浸泡3min,依此類推，將200尾牙 鲆全部進(jìn)行浸泡免疫， 一周后以同樣方法加強(qiáng)免疫一次。第35天時隨機(jī)抽取 20尾進(jìn)行針刺攻毒實驗，免疫保護(hù)率達(dá)到85%;該200尾受免魚發(fā)病率僅為 5%。
權(quán)利要求
1、一種致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)通過PCR檢測將分離自患腹水病褐牙鲆體內(nèi)的致病性嗜水氣單胞菌于普通LB培養(yǎng)基中搖培12～16小時，用分光光度計檢測OD值，達(dá)到0.6以上或檢測菌濃度達(dá)到109CFU/mL；(2)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％～0.4％甲醛溶液對致病性嗜水氣單胞菌進(jìn)行滅活，于37℃滅活12小時，其間振搖2～3次；(3)將所得滅活菌液于5000rpm離心10分鐘，收集菌體，用生理鹽水重懸后即可得到致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)將通過PCR檢測的分離自患腹水病褐牙鲆體內(nèi)的致病性嗜水氣單胞菌接種于普通LB培養(yǎng)基培養(yǎng)達(dá)到一定濃度；(2)用甲醛溶液對該菌進(jìn)行滅活；(3)離心培養(yǎng)物收集菌體，用生理鹽水重懸后得到致病性嗜水氣單胞菌滅活疫苗。該制備方法操作快速簡便，易于批量制備，所得疫苗為純生物制劑，無任何毒副作用，不會對牙鲆的肉質(zhì)和周圍水體造成污染。用該方法制備的疫苗免疫褐牙鲆，其免疫保護(hù)率達(dá)到80％，可以從根本上遏制病原的傳播。本發(fā)明為防治褐牙鲆魚類流行性腹水癥提供了新的途徑。
文檔編號A61K39/02GK101181635SQ20071018535
公開日2008年5月21日 申請日期2007年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日
發(fā)明者楠 李, 申紅旗, 趙寶華 申請人:河北師范大學(xué)