專(zhuān)利名稱(chēng)：一種腰痛片的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腰痛片的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腰痛片記載于衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-1053-91，由鹽炒杜仲葉108g、鹽炒補(bǔ)骨脂81g、續(xù)斷81g、當(dāng)歸108g、炒白術(shù)81g、牛膝81g、肉桂27g、制乳香27g、制狗脊81g、赤芍43g、澤瀉54g、酒炒土鱉蟲(chóng)43g作為原料藥制成，能強(qiáng)腰補(bǔ)腎，活血止痛。用于腎虛腰痛，腰肌勞損。現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有腰痛片在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報(bào)道，而采用打粉和水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種腰痛片的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種腰痛片在制備抑制人腎癌細(xì)胞KETR-3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的一種腰痛片的制備方法，由鹽炒杜仲葉108g、鹽炒補(bǔ)骨脂81g、續(xù)斷81g、當(dāng)歸108g、炒白術(shù)81g、牛膝81g、肉桂27g、制乳香27g、制狗脊81g、赤芍43g、澤瀉54g、酒炒土鱉蟲(chóng)43g作為原料藥制成，所述的方法由下列步驟組成取當(dāng)歸、肉桂、制乳香，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l_3ml/g生藥·π η，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。上述一種腰痛片的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。 上述一種腰痛片的制備方法，所述微波萃取功率500W,每次萃取6分鐘。上述一種腰痛片的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時(shí)間160min。上述腰痛片在制備抑制人腎癌細(xì)胞KETR-3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中，腰痛片每片O. 5g，每次6片，一日3次，采用本發(fā)明制備成的腰痛片每片O. 5g，每次僅需3片，一日服用3次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過(guò)下述試驗(yàn)證明。試驗(yàn)一、不同方法制備的腰痛片中阿魏酸含量的比較
1、儀器及試藥本發(fā)明腰痛片按實(shí)施例3方法制備，使用815g原料藥，經(jīng)提取制成 1000片，每片重O. 5g。原腰痛片，按部頒標(biāo)準(zhǔn)方法制備，使用815g原料藥，經(jīng)提取制成1000 片，每片重O. 5g。Agilent 1200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。
2、方法
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取在60°C減壓干燥4小時(shí)的阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本發(fā)明腰痛片和原腰痛片，研細(xì)，混勻，取lg，精密稱(chēng)定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超聲處理10分鐘，離心，取上清液，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定， 即得。
3、結(jié)果
結(jié)果表明，本發(fā)明腰痛片中阿魏酸的含量為1. 12mg/片；而原腰痛片中阿魏酸的含量為O. 14mg/片，在服用量減少的情況下，阿魏酸含量有很大提高。
上述研究表明，采用本發(fā)明制備的腰痛片，有效成分含量高于部頒標(biāo)準(zhǔn)法制備的腰痛片。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
取鹽炒杜仲葉108g、鹽炒補(bǔ)骨脂81g、續(xù)斷81g、當(dāng)歸108g、炒白術(shù)81g、牛膝81g、 肉桂27g、制乳香27g、制狗脊81g、赤芍43g、澤瀉54g、酒炒土鱉蟲(chóng)43g，將當(dāng)歸、肉桂、制乳香，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為 4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥·π η，萃取時(shí)間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片， 每片重O. 5g。
經(jīng)檢測(cè)，成品中阿魏酸的含量為1. 15mg/片。
實(shí)施例2
取 鹽炒杜仲葉108g、鹽炒補(bǔ)骨脂81g、續(xù)斷81g、當(dāng)歸108g、炒白術(shù)81g、牛膝81g、 肉桂27g、制乳香27g、制狗脊81g、赤芍43g、澤瀉54g、酒炒土鱉蟲(chóng)43g，將當(dāng)歸、肉桂、制乳香，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%， 萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥·π η，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率 600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重 O. 5g。
經(jīng)檢測(cè)，成品中阿魏酸的含量為1. 09mg/片。
實(shí)施例3
取鹽炒杜仲葉108g、鹽炒補(bǔ)骨脂81g、續(xù)斷81g、當(dāng)歸108g、炒白術(shù)81g、牛膝81g、 肉桂27g、制乳香27g、制狗脊81g、赤芍43g、澤瀉54g、酒炒土鱉蟲(chóng)43g，將當(dāng)歸、肉桂、制乳香，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%， 萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥·π η，萃取時(shí)間160min，得超臨界萃取物， 備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率 500W，萃取2次，每次6分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重 O. 5g。
經(jīng)檢測(cè)，成品中阿魏酸的含量為1. 12mg/片。
實(shí)施例4 :腰痛片抑制KETR-3細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
I實(shí)驗(yàn)材料
1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
人腎癌細(xì)胞KETR-3細(xì)胞，南京正寬醫(yī)藥科技有限公司實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)， DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
1. 2實(shí)驗(yàn)藥物
研究藥物本發(fā)明腰痛片按實(shí)施例3方法制備。
藥液儲(chǔ)液稱(chēng)取IOOmg腰痛片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，O. 2 μ m濾器過(guò)濾，500 μ I doff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)O. 2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
1. 3實(shí)驗(yàn)試劑
DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419);NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號(hào)2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號(hào):2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號(hào)2010242)；Streptomycin SulfateCAMRESCO 公司批號(hào)2010382);無(wú)水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司批號(hào)080310182);MTT(Biosharp批號(hào):0793);PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；
1. 4實(shí)驗(yàn)器材
萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào)DM1L);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD 公司型號(hào)SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào)3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào)S/N 020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào)P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào)BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號(hào)MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào)DHG9123A);冰箱(西門(mén)子公司型號(hào)KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào)ΚΑ-1000) ;0. 2μπι濾器(MILLIP0RE型號(hào)SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
2實(shí)驗(yàn)方法
I) KETR-3 細(xì)胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml O. 25%胰蛋白酶-O. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個(gè)/ml。
2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入腰痛片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示
細(xì)胞增值抑制率(％)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)/對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
3統(tǒng)計(jì)處理
采用Microsoft Excel 2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以 mean+ S. D.表不。
4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)KETR-3細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0. 05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到 15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(Ρ〈0· 001)。
表I腰痛片對(duì)KETR-3細(xì)胞增殖抑制影響研究(I土、D)
-12 ；15, a= in l i* +
注與對(duì)照組比較，*P〈0.01 ;#Ρ〈0· 001
5實(shí)驗(yàn)結(jié)論
腰痛片可以抑制KETR-3細(xì)胞增殖，減少KETR-3細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)目，該作用呈劑量依賴(lài) 性。
權(quán)利要求
1.一種腰痛片的制備方法，由鹽炒杜仲葉108g、鹽炒補(bǔ)骨脂81g、續(xù)斷81g、當(dāng)歸108g、炒白術(shù)81g、牛膝81g、肉桂27g、制乳香27g、制狗脊81g、赤芍43g、澤瀉54g、酒炒土鱉蟲(chóng)43g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成取當(dāng)歸、肉桂、制乳香，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50。。，CO2流量l_3ml/g生藥· min，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種腰痛片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種腰痛片的制備方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種腰痛片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時(shí)間160min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種腰痛片在制備抑制人腎癌細(xì)胞KETR-3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腰痛片的制備方法，由鹽炒杜仲葉108g、鹽炒補(bǔ)骨脂81g、續(xù)斷81g、當(dāng)歸108g、炒白術(shù)81g、牛膝81g、肉桂27g、制乳香27g、制狗脊81g、赤芍43g、澤瀉54g、酒炒土鱉蟲(chóng)43g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得阿魏酸含量有很大提高，本發(fā)明還提供了腰痛片在制備抑制人腎癌細(xì)胞KETR-3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103028005SQ20121037842
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:卞毓平