專利名稱：包含聚亞烷基二醇的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物、其應(yīng)用及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物-寡聚體偶聯(lián)物，更具體涉及生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)激素已被用于生長(zhǎng)激素缺乏兒童的替代治療。生長(zhǎng)激素還被研究作為一種治療多種分解代謝病癥如燒傷、外科手術(shù)和吸收不良的助劑。生長(zhǎng)激素對(duì)鈣離子潴留和骨生成的積極作用也可以用于治療骨質(zhì)疏松和非愈合性骨折。
生長(zhǎng)激素可以通過(guò)肌內(nèi)或皮下注射給藥。在這些方法中，可以優(yōu)選皮下注射，因?yàn)樗欣谧晕医o藥。但是，這兩種方法由于導(dǎo)致可能與注射給藥有關(guān)的生理和/或心理創(chuàng)傷，特別是兒童的生理和/或心理創(chuàng)傷，因而可能不是最佳的方法。
已將藥學(xué)活性分子如蛋白質(zhì)和多肽與多分散的聚乙二醇的混合物或多分散的含有聚乙二醇的聚合物的混合物偶聯(lián)得到多分散的藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。例如，Ekwuribe的美國(guó)專利5,359,030提出將多肽如促生長(zhǎng)素抑制素、生長(zhǎng)激素和/或促生長(zhǎng)因子與多分散的聚乙二醇修飾的糖脂聚合物和多分散的聚乙二醇修飾的脂肪酸聚合物偶聯(lián)。由各種組合得到的多分散的聚合物的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選范圍在大約500至大約10,000道爾頓內(nèi)。
聚乙二醇(PEG)一般由堿催化的環(huán)氧乙烷的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)生產(chǎn)。所述反應(yīng)通過(guò)將環(huán)氧乙烷加到乙二醇，并以氫氧化鉀作為催化劑而引發(fā)。這種方法得到數(shù)均分子量在確定的分子量范圍之內(nèi)的多分散的聚乙二醇聚合物的混合物。例如，由Sigma-Aldrich of Milwaukee，Wisconsin提供的PEG產(chǎn)物是作為多分散的混合物得到的，例如PEG400(Mn380-420)、PEG 1,000(Mn950-1,050)、PEG 1,500(Mn1,400-1,600)和PEG 2,000(Mn1,900-2,200)。
期望得到非多分散的生長(zhǎng)激素-寡聚體偶聯(lián)物的混合物，其中所述寡聚體包含聚亞烷基二醇。
發(fā)明概述包含根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的聚亞烷基二醇的生長(zhǎng)激素-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可能表現(xiàn)出比多分散的類似的偶聯(lián)物的混合物更高的體內(nèi)活性，其中所述多分散的混合物具有與本發(fā)明的混合物相同的數(shù)均分子量。這種增高的活性可能導(dǎo)致較低的劑量要求。而且，包含根據(jù)本發(fā)明的聚亞烷基二醇的生長(zhǎng)激素-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以比多分散的類似的偶聯(lián)物的混合物更有效地在體外腸消化模型中存留。而且，包含根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的聚亞烷基二醇的生長(zhǎng)激素-寡聚體偶聯(lián)物的混合物還可能導(dǎo)致比多分散的類似的偶聯(lián)物的混合物更小的受試者間的差異。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供一種基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物。所述聚亞烷基二醇部分優(yōu)選具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基，并最優(yōu)選具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。所述聚亞烷基二醇部分優(yōu)選為聚丙二醇。所述寡聚體優(yōu)選還包含親脂部分。所述生長(zhǎng)激素藥物優(yōu)選為人生長(zhǎng)激素。寡聚體優(yōu)選與人生長(zhǎng)激素的氨基官能團(tuán)共價(jià)偶合。所述偶聯(lián)物優(yōu)選為兩親平衡，因而溶于水并能夠穿透生物膜。所述寡聚體可以包含通過(guò)不可水解的鍵與藥物共價(jià)偶合的第一聚亞烷基二醇部分和通過(guò)可水解的鍵與第一聚亞烷基二醇部分共價(jià)偶合的第二聚亞烷基二醇部分。所述混合物優(yōu)選為單分散的混合物，最優(yōu)選為完全單分散的混合物。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供一種基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，且所述的混合物的體內(nèi)活性大于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體內(nèi)活性。
本發(fā)明的進(jìn)一步的其它實(shí)施方案提供一種基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，且所述混合物體外活性大于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體外活性。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供一種基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，且與具有與所述基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，所述混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。
本發(fā)明的進(jìn)一步的其它實(shí)施方案提供一種基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，且所述混合物的受試者間的差異性小于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的受試者間的差異性。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，且所述混合物具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的的分子量分布。
本發(fā)明的進(jìn)一步的其它實(shí)施方案提供一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，且所述混合物的分散系數(shù)(DC)大于10,000，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數(shù)量；Ni為樣品中ith分子的數(shù)量；和Mi為ith分子的質(zhì)量。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包括與寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，并具有相同數(shù)量的聚亞烷基二醇亞基。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有下式
生長(zhǎng)激素藥物 其中B為鍵合部分；L為接頭部分；G、G′和G″為獨(dú)立選擇的間隔部分；R為親脂部分而R′為聚亞烷基二醇部分，或者R′為親脂部分而R為聚亞烷基二醇部分；T為末端部分；h、i、j、k、m和n獨(dú)立地為0或1，附帶條件是當(dāng)R為聚亞烷基二醇部分時(shí)，m為1；當(dāng)R′為聚亞烷基二醇部分時(shí)，n為1；和p為1至生長(zhǎng)激素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。
本發(fā)明還提供不同實(shí)施方案的混合物的合成方法。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的偶聯(lián)物的混合物的藥物組合物。還提供通過(guò)給需要治療的受試者施用有效量的這種藥物組合物而治療生長(zhǎng)激素缺乏的方法。
本發(fā)明還提供通過(guò)給動(dòng)物施用有效量的上述不同實(shí)施方案的偶聯(lián)物的混合物而加速動(dòng)物的生長(zhǎng)速率的方法。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體的偶聯(lián)物的混合物與常規(guī)的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體的偶聯(lián)物的混合物相比，可以增加體內(nèi)活性和/或降低受試者間的差異性和/或減少胰凝乳蛋白酶降解。
圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的包含聚乙二醇部分和脂肪酸部分的活化的聚合物的混合物的一般合成路線；圖2例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的mPEG的混合物的合成路線；圖3例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的mPEG7-己基寡聚體的混合物的合成路線；
圖4例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的mPEG7-辛基寡聚體的混合物的合成路線；圖5例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的PEG-癸基寡聚體的混合物的合成路線；圖6例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的硬脂酸酯-PEG6寡聚體的混合物的合成路線；圖7例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的硬脂酸酯-PEG8寡聚體的混合物的合成路線；圖8例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的PEG3寡聚體的混合物的合成路線；圖9例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的棕櫚酸酯-PEG3寡聚體的混合物的合成路線；圖10例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的活化的PEG6寡聚體的混合物的合成和人生長(zhǎng)激素與活化的PEG6寡聚體偶聯(lián)的路線；圖11例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的不同的丙二醇單體的合成路線；圖12例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的不同的丙二醇聚合物的合成路線；圖13例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的不同的丙二醇聚合物的合成路線；圖14為使用2當(dāng)量的活化的MPEG6寡聚體和5當(dāng)量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯(lián)反應(yīng)的HPLC痕跡(HPLC梯度50％-90％乙腈，30分鐘)；圖15為使用30當(dāng)量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯(lián)反應(yīng)的HPLC痕跡(HPLC梯度0％-95％乙腈，20分鐘)；圖16為使用2當(dāng)量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯(lián)反應(yīng)的MALDI光譜；圖17為使用5當(dāng)量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯(lián)反應(yīng)的HPLC痕跡(HPLC梯度50％-70％乙腈，30分鐘)；圖18為來(lái)自圖17所示的部分純化的餾分B的MALDI光譜；圖19為來(lái)自圖17所示的部分純化的餾分C的MALDI光譜；圖20為來(lái)自圖17所示的部分純化的餾分D和E的MALDI光譜；
圖21為來(lái)自圖17所示的部分純化的餾分E的電噴霧光譜；圖22為來(lái)自使用30當(dāng)量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)混合物的電噴霧光譜；圖23為人生長(zhǎng)激素與圖9的活化的寡聚體的偶聯(lián)反應(yīng)的HPLC痕跡；圖24為使用1當(dāng)量的人生長(zhǎng)激素和2當(dāng)量的圖9的活化的寡聚體的偶聯(lián)反應(yīng)的的HPLC痕跡；圖25為使用1當(dāng)量的人生長(zhǎng)激素和5當(dāng)量的圖8的活化的寡聚體的偶聯(lián)反應(yīng)的的HPLC痕跡；圖26為對(duì)應(yīng)于圖25的偶聯(lián)HPLC痕跡的峰的左半部分的餾分的MALDI光譜；圖27為對(duì)應(yīng)于圖25的偶聯(lián)HPLC痕跡的峰的右半部分的餾分的MALDI光譜；圖28為使用1當(dāng)量的人生激素和9當(dāng)量的圖8的活化的寡聚體的偶聯(lián)反應(yīng)的HPLC痕跡；圖29例示的柱形圖表明通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的混合物的螢蟲(chóng)素酶試驗(yàn)測(cè)得的與人生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)品的活性相比的活性，它們僅供比較目的而不形成本發(fā)明的部分；和圖30例示的柱形圖表明通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的混合物的螢蟲(chóng)素酶試驗(yàn)測(cè)得的與人生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)品的活性相比的活性，它們僅供比較目的而不形成本發(fā)明的部分。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述現(xiàn)在將根據(jù)這里所述的優(yōu)選的實(shí)施方案描述本發(fā)明。但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到這些實(shí)施方案用于例示本發(fā)明的目的，而不被理解為對(duì)由權(quán)利要求定義的本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行限定。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“非多分散的”用于描述具有與Ekwuribe的美國(guó)專利5,359,030所述的多分散的混合物形成對(duì)比的分散度的化合物的混合物。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“基本上單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少大約95％的化合物具有相同的分子量。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中大約100％的化合物具有相同的分子量。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“基本上完全單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少大約95％的化合物具有相同的分子量和具有相同的分子結(jié)構(gòu)。因此，基本上完全單分散的混合物為基本上單分散的混合物，但是基本上單分散的混合物不一定是基本上完全單分散的混合物。
這里所述的術(shù)語(yǔ)“完全單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中大約100％的化合物具有相同的分子量和具有相同的分子結(jié)構(gòu)。因此，完全單分散的混合物為單分散的混合物，但單分散的混合物不一定為完全單分散的混合物。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“重均分子量”定義為混合物中確定的分子的重量分?jǐn)?shù)與混合物中各分子的分子質(zhì)量的乘積。“重均分子量”以符號(hào)Mw表示。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“數(shù)均分子量”定義混合物的總重量除以混合物中分子數(shù)量，并由符號(hào)Mn表示。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“分散系數(shù)”(DC)由下式定義DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數(shù)量；Ni為樣品中ith分子的數(shù)量；和Mi為ith分子的質(zhì)量。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“受試者內(nèi)的差異性”意指在不同的時(shí)間施用相同劑量的藥物組合物時(shí)同一受試者內(nèi)存在的活性差異。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“受試者間的差異性”意指在給每名受試者施用相同劑量的藥物或藥劑時(shí)兩名或多名受試者之間的活性差異。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素藥物”意指具有生長(zhǎng)激素肽的全部或某些生物活性的藥物。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素肽”意指人生長(zhǎng)激素、人生長(zhǎng)激素-釋放激素、動(dòng)物生長(zhǎng)激素或動(dòng)物生長(zhǎng)激素-釋放激素，其中任一種可以由天然、合成或基因工程來(lái)源獲得。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素肽類似物”意指其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸已被取代但保留了生長(zhǎng)激素肽的某些和全部的活性的生長(zhǎng)激素肽。對(duì)類似物的描述方法是將取代氨基酸和取代位置記錄為一個(gè)上標(biāo)和跟在其后的關(guān)于生長(zhǎng)激素的描述。例如，“Pro41生長(zhǎng)激素，人”意指通常在人生長(zhǎng)激素分子的41位發(fā)現(xiàn)的氨基酸被脯氨酸取代。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以通過(guò)不同的方法得到生長(zhǎng)激素類似物。例如生長(zhǎng)激素結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以被其它氨基酸取代同時(shí)不明顯地喪失與結(jié)構(gòu)如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合部位的相互結(jié)合能力。生長(zhǎng)激素的相互作用能力和性質(zhì)決定了它的生物功能活性，可以在氨基酸序列上完成某些氨基酸序列取代，但仍保持具有類似性能的多肽。
在進(jìn)行這種取代過(guò)程中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。在本技術(shù)中一般認(rèn)識(shí)到賦予多肽相互作用的生物功能的親水氨基酸指數(shù)的重要性。已知氨基酸的相對(duì)親水特征影響所得的多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而決定多肽與其它分子如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。根據(jù)疏水性和電荷特征為每種氨基酸指定如下的親水指數(shù)異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯基丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、門(mén)冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，某些氨基酸可以被其它具有類似的親水指數(shù)或分?jǐn)?shù)的氨基酸取代，并仍然得到具有類似生物活性的多肽，即仍獲得生物功能等同的多肽。在完成這些改變過(guò)程中，優(yōu)選親水指數(shù)相互在±2范圍之內(nèi)的氨基酸的取代，特別優(yōu)選親水指數(shù)相互在±1范圍之內(nèi)的氨基酸的取代，更特別優(yōu)選親水指數(shù)相互在±0.5范圍之內(nèi)的氨基酸的取代。
在本技術(shù)中還認(rèn)識(shí)到類似的氨基酸的取代可以根據(jù)親水性而有效地完成。美國(guó)專利4,554,101認(rèn)為蛋白質(zhì)的最大的局部平均親水性由其相鄰的氨基酸的親水性決定，與蛋白質(zhì)的生物性能有關(guān)。如美國(guó)專利4,554,101詳述，對(duì)氨基酸殘基賦予以下的親水性值精氨酸(+3.0)、賴氨酸(±3.0)、門(mén)冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯基丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，氨基酸可以被另一種具有類似的親水值的氨基酸取代，并仍然獲得生物學(xué)等同，特別是免疫學(xué)等同的多肽。在這些改變中，優(yōu)選親水值彼此在±2范圍之內(nèi)的氨基酸取代，特別優(yōu)選親水值彼此在±1范圍之內(nèi)的氨基酸取代，更特別優(yōu)選親水值彼此在±0.5范圍之內(nèi)的氨基酸取代。
因此如以上所述，氨基酸取代一般基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、尺寸等?？紤]前述的多個(gè)特征的例舉性取代(即可能相互交換但不顯著的改變多肽的生物活性的氨基酸)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，例如它包括精氨酸和賴氨酸、谷氨酸和門(mén)冬氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺、和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素肽片斷”意指在生長(zhǎng)激素中發(fā)現(xiàn)的保持生長(zhǎng)激素多肽的某些或全部活性的氨基酸序列的片斷。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素肽片斷類似物”意指在生長(zhǎng)激素肽上發(fā)現(xiàn)并保留所述生長(zhǎng)激素多肽的某些或全部的活性的氨基酸序列的節(jié)段，其中該節(jié)段中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸已被取代。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“聚亞烷基二醇”指直鏈或支鏈聚亞烷基二醇聚合物。術(shù)語(yǔ)“聚亞烷基二醇亞基”指單一的聚亞烷基二醇單位。例如，聚乙二醇亞基為-(CH2CH2O)-。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“親脂性”意指溶于脂質(zhì)的能力和/或穿透生物膜、與生物膜相互作用和/或橫穿生物膜的能力，而術(shù)語(yǔ)“親脂部分”或“親脂體”意指親脂性的部分和/或在與另一種化學(xué)實(shí)體結(jié)合時(shí)增加這種化學(xué)實(shí)體的親油性的部分。親脂性部分的實(shí)例包括但不限于烷基、脂肪酸、脂肪酸酯、膽甾醇基、金剛烷基等。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”指取代或未取代的具有1-5個(gè)碳原子的烷基部分。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“高級(jí)烷基”指取代或未取代的具有6或更多個(gè)碳原子的烷基部分。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物-寡聚體偶聯(lián)物。所述單分散的混合物中的每個(gè)生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物。優(yōu)選所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯(lián)物的混合物具有相同的分子量。更優(yōu)選所述混合物為單分散的混合物。甚至更優(yōu)選所述混合物為基本上完全單分散的混合物。進(jìn)一步更優(yōu)選所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯(lián)物具有相同的分子量和具有相同的分子結(jié)構(gòu)。最優(yōu)選所述混合物為完全單分散的混合物。
所述的生長(zhǎng)激素藥物優(yōu)選為人生長(zhǎng)激素。但是，應(yīng)理解生長(zhǎng)激素藥物可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的生長(zhǎng)激素藥物，例如它包括生長(zhǎng)激素肽、生長(zhǎng)激素肽類似物、生長(zhǎng)激素肽片斷和生長(zhǎng)激素肽片斷類似物。生長(zhǎng)激素肽包括但不限于生長(zhǎng)激素，人(hGH)；生長(zhǎng)激素，豬；生長(zhǎng)激素，牛；生長(zhǎng)激素，雞；生長(zhǎng)激素，大鼠；生長(zhǎng)激素，小鼠；生長(zhǎng)激素，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，人；生長(zhǎng)激素pro-釋放因子，人；生長(zhǎng)激素釋放因子，小鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，大鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，牛；生長(zhǎng)激素釋放因子，豬；和生長(zhǎng)激素釋放因子，雞。生長(zhǎng)激素肽類似物可以如上述通過(guò)取代生長(zhǎng)激素肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到。生長(zhǎng)激素肽片斷包括但不限于生長(zhǎng)激素1-43，人；生長(zhǎng)激素6-13；生長(zhǎng)激素釋放因子1-37，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長(zhǎng)激素釋放六肽)；和生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長(zhǎng)激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr’，D-Arg2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺；[His’，Nle27]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-32，酰胺；生長(zhǎng)激素釋放肽-6([His’，Lys6]-GHRP)；和[D-Lys3]-GHRP-6。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知所述的寡聚體可以是包含聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優(yōu)選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基。更優(yōu)選所述聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個(gè)聚亞烷基二醇亞基。最優(yōu)選所述寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。所述寡聚體的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選為低級(jí)烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亞烷基二醇部分為更優(yōu)選為具有均一結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分。具有均一結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分實(shí)例如下 這種均一的聚丙二醇結(jié)構(gòu)可以描述為僅具有一個(gè)與聚丙二醇鏈中的每個(gè)氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現(xiàn)出親脂和親水特征，因而可以用于在不使用親脂聚合物部分的情況下提供兩親型生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長(zhǎng)激素藥物的偶合可以得到對(duì)酶，例如在腸中發(fā)現(xiàn)的胰島素和胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力提高的生長(zhǎng)激素藥物(例如人生長(zhǎng)激素)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇優(yōu)選如圖11-13合成，現(xiàn)在將對(duì)其進(jìn)行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體54。所述伯醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員理的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化試劑如Ac2O。優(yōu)選所述伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應(yīng)的伯醇封端劑，例如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。仲醇延長(zhǎng)單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長(zhǎng)單體54可以與仲醇封端劑反應(yīng)得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯?；衔?6可以與B1解封劑反應(yīng)除去封端部分B，并得到伯醇延長(zhǎng)單體57。所述B1解封劑可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑。當(dāng)通過(guò)形成酯將伯醇封端時(shí)，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當(dāng)使用甲硅烷基氯將伯醇封端時(shí)，B1解封劑優(yōu)選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長(zhǎng)單體54和仲醇延長(zhǎng)單體57封端。仲醇延長(zhǎng)單體54可以與封端劑反應(yīng)得到化合物59。所述封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷?；衔?9可以與上述的B1解封劑反應(yīng)得到伯醇封端單體60。
伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與封端劑反應(yīng)得到化合物62。封端劑可以是如上述的不同的封端劑。化合物62可以與B2解封劑反應(yīng)以除去封端部分B2并得到仲醇封端單體63。B2解封劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實(shí)施方案表示封端單體的合成，但應(yīng)理解可以進(jìn)行類似的反應(yīng)得到封端聚合物。
一般地，鏈延長(zhǎng)可以通過(guò)伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物如伯醇延長(zhǎng)單體57與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55反應(yīng)而進(jìn)行，以得到不同的均一的聚丙烯鏈；或者通過(guò)仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物如仲醇延長(zhǎng)單體54與仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58反應(yīng)而進(jìn)行。
例如，在圖13中，伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55與伯醇延長(zhǎng)單體57得到二聚物化合物65?？蛇x擇地，仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長(zhǎng)單體54反應(yīng)得到二聚物化合物65。二聚物化合物65上的B1封端部分可以使用上述的B1解封劑除去以得到伯醇延長(zhǎng)二聚物66。伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67?？蛇x擇地，二聚物化合物65上的B2封端部分可以使用上述的B2解封劑除去以得到仲醇延長(zhǎng)二聚物69。仲醇延長(zhǎng)二聚物69可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，鏈延長(zhǎng)過(guò)程可以重復(fù)進(jìn)行以得到不同的其它鏈長(zhǎng)度。例如如圖13所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70反應(yīng)得到四聚物化合物72。如圖13進(jìn)一步所示，普通鏈延長(zhǎng)反應(yīng)路線包括伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物73與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯74反應(yīng)得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍各為0-1000，或者更優(yōu)選m和n各為0-50。雖然圖13所示的實(shí)施方案表示伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物與伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)，應(yīng)該理解類似的反應(yīng)可以使用仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物和仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯完成。
伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物71。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，B1封端部分可以除去，而所得的封端的伯醇延長(zhǎng)三聚物可以與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)以延長(zhǎng)封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物68。B2封端部分可以如上述除去，而所得的封端的仲醇延長(zhǎng)三聚物可以與仲醇延長(zhǎng)鏈節(jié)甲磺酸酯反應(yīng)以延封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應(yīng)得到三聚物，應(yīng)該理解封端過(guò)程可以在均一的聚丙二醇部分的合成的任何點(diǎn)上進(jìn)行，或者可選擇地，可以得到不被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實(shí)施方案表示通過(guò)用封端單體的合成而進(jìn)行的聚丁烯寡聚體的封端，應(yīng)該理解本發(fā)明的聚丁烯寡聚體可以使用如以上圖11所述的封端劑直接封端(即不加入封端單體)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法與生長(zhǎng)激素藥物，親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，所述方法包括但不限于這里關(guān)于聚乙二醇部分所述的方法。
所述寡聚體可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它部分，包括但不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。寡聚體中的不同部分彼此通過(guò)可水解或不可水解的鍵共價(jià)偶合。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過(guò)醚鍵偶合或具有相同的烷基結(jié)構(gòu)的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個(gè)聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是不同的部分，如果它們通過(guò)除了醚鍵之外的鍵偶合或者如果它們具有不同的烷基結(jié)構(gòu)的話。例如，以下部分 是具有4個(gè)聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個(gè)聚乙二醇亞基的親水部分。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的寡聚體包含聚亞烷基二醇部分，且不進(jìn)一步包含親水部分。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親脂部分。所述親脂部分優(yōu)選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)所述親脂部分為烷基部分時(shí)，它優(yōu)選為直鏈、飽和或不飽和的具有1-28個(gè)碳原子的烷基部分。更優(yōu)選，所述烷基部分具有2-12個(gè)碳原子。當(dāng)親脂部分為脂肪酸部分時(shí)，它優(yōu)選為天然的直鏈、飽和或不飽、具有2-18個(gè)碳原子的脂肪酸部分。更優(yōu)選，所述脂肪酸部分具有3-14個(gè)碳原子。最優(yōu)選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個(gè)碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的間隔部分。例如，間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長(zhǎng)激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或者用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優(yōu)選糖，膽固醇和甘油部分。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)用于將寡聚體與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物偶合的接頭部分。接頭部分優(yōu)選選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)處在不與生長(zhǎng)激素藥物偶合的寡聚體的一個(gè)或多個(gè)末端的末端部分。所述末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選為低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基部分。最優(yōu)選所述末端部分為甲基或甲氧基。雖然末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，應(yīng)該理解末端部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。在某些實(shí)施方案中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合。可水解的偶合可以提供用作前藥的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。在某些情況下，例如其中的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物不具有活性(即所述偶聯(lián)物缺乏通過(guò)生長(zhǎng)激素藥物的主要作用機(jī)制影響身體的能力)，可水解的偶合可能提供延時(shí)釋放或控釋效果，在一個(gè)或多個(gè)寡聚體從它們各自的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物上裂解得到活性藥物時(shí)在確定的時(shí)間內(nèi)施用生長(zhǎng)激素藥物。在其它實(shí)施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合。當(dāng)期望生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物在血流中進(jìn)行長(zhǎng)期，優(yōu)選至少2小時(shí)的循環(huán)時(shí)，可以優(yōu)選使用不可水解的鍵。當(dāng)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合時(shí)，所述寡聚體還包含一個(gè)或多個(gè)用于將寡聚體與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合的鍵合部分。鍵合部分優(yōu)選選自共價(jià)鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。寡聚體上的多于一個(gè)的部分可以與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。
雖然所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合，但應(yīng)該理解所述寡聚體可以與生長(zhǎng)激素藥物非共價(jià)偶合形成非共價(jià)偶聯(lián)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，非共價(jià)偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質(zhì)體包囊。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，寡聚體可以被適宜地構(gòu)造、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇的方式進(jìn)行非共價(jià)偶聯(lián)的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由不同的化合物衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非價(jià)偶合(復(fù)合)。所得的復(fù)合物優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價(jià)偶聯(lián)的復(fù)合物。由這種復(fù)合作用得到的產(chǎn)品優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個(gè)寡聚體(即多個(gè)寡聚體)可以與生長(zhǎng)激素藥物偶合。多數(shù)的寡聚體優(yōu)選相同。但是，應(yīng)該理解多數(shù)寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數(shù)寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當(dāng)多個(gè)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合時(shí)，可以優(yōu)選將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合和將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有不可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合?？蛇x擇地，所有將多數(shù)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而快速地從生長(zhǎng)激素藥物上除去和一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而緩慢地從生長(zhǎng)激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長(zhǎng)激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。例如，親核羥基官能團(tuán)可以見(jiàn)于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團(tuán)可以見(jiàn)于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個(gè)或多個(gè)多肽的N-末端。當(dāng)寡聚體與一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)激素多肽的N-末端偶合時(shí)，所述偶合優(yōu)選形成仲胺。例如，當(dāng)所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素時(shí)，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團(tuán)偶合。
基本上單分散的本發(fā)明的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以通過(guò)不同的方法合成。例如，通過(guò)以下方法合成基本上單分散的羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物使基本上單分散的羧酸的混合物與基本上單分散的聚乙二醇的混合物在足以得到基本上單分散的寡聚體的混合物的條件下反應(yīng)。然后將所述基本上單分散的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長(zhǎng)激素藥物反應(yīng)得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個(gè)實(shí)施方案如圖3所示，并如以下的實(shí)施例11-18所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖4所示并如以下的實(shí)施例19-24所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的進(jìn)一步的另一個(gè)實(shí)施方案如圖5所示，并如以下的實(shí)施例25-29所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖6所示，并如以下的實(shí)施例30-31所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖7所示，并如以下的實(shí)施例32-37所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的進(jìn)一步的另一個(gè)實(shí)施方案如圖8所示，并如以下的實(shí)施例38所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖9所示，并如以下的實(shí)施例39所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖10所示，并如以下的實(shí)施例40所述。
所述的基本上單分散的活化的寡聚體的混合物可以與基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物在足以得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的條件下反應(yīng)。在以下的實(shí)施例40-42中描述了合成的實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以控制反應(yīng)條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使通過(guò)基本上單分散的活化的寡聚體的混合物與基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物的反應(yīng)而得到的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物為基本上單分散的混合物。例如，可以通過(guò)將反應(yīng)溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制在賴氨酸的氨基官能團(tuán)處的偶聯(lián)。
可選擇地，例如所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以利用HPLC分離(separated和solated)得到基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物-寡聚體偶聯(lián)物，例如一、二或三偶聯(lián)物?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的分離的偶聯(lián)物的偶聯(lián)程度(例如分離的分子為一、二或三偶聯(lián)物)，這些技術(shù)包括但不限于質(zhì)譜?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)(例如所述寡聚體位于人生長(zhǎng)激素一偶聯(lián)物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術(shù)包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內(nèi)肽酶切割。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，生長(zhǎng)激素藥物上的一個(gè)或多個(gè)作用部位可以通過(guò)所述生長(zhǎng)激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應(yīng)而被封端。例如在所述的生長(zhǎng)激素藥物為多肽并期望形成不飽和的在一個(gè)或多個(gè)多肽N-末端具有寡聚體的偶聯(lián)物(即其中并非所有的親核殘基發(fā)生偶聯(lián)的偶聯(lián)物)時(shí)，優(yōu)選這種方法。在這種封端之后，可以使基本上單分散的封端的生長(zhǎng)激素藥物的混合物與基本上單分散的活化的寡聚體的混合物反應(yīng)得到具有與一個(gè)或多個(gè)親核殘基偶合的寡聚體和具有與其它親核殘基偶合的封端部分的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在偶聯(lián)反應(yīng)之后，可以將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物解封。如果需要的話，隨后可以如上述分離生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物得到基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物-寡聚體偶聯(lián)物。可選擇地，可以在解封之前分離所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。
與常規(guī)混合物的性能相比，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有改善的性能。例如，基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物-寡聚體偶聯(lián)物優(yōu)選體內(nèi)活性大于多分散的具有與所述的基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體內(nèi)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，基本上單分散的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以由不同的方法測(cè)定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lam pe，CONTEMPORARY POLYMERCHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物寡聚體偶聯(lián)物優(yōu)選體外活性大于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體外活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，基本上單分散的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以由不同的方法測(cè)定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，特定混合物的體外活性可以通過(guò)不同的方法測(cè)定。優(yōu)選使用從Molecular Devices Corporation ofSunnyvale，California商購(gòu)得到的Cytosensor微生理機(jī)能測(cè)定儀測(cè)定體外活性。所述微生理機(jī)能測(cè)定儀監(jiān)測(cè)對(duì)被加到在Transwell(Corning，Inc.，Acton，Massachusetts)中培養(yǎng)的細(xì)胞的藥物作出反應(yīng)而發(fā)生的細(xì)胞外酸化速率的細(xì)微變化。這種反應(yīng)與研究的分子的活性成比例。
作為進(jìn)一步的另一個(gè)實(shí)例，與具有與所述基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力相比，基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物-寡聚體偶聯(lián)物優(yōu)選對(duì)胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力增大。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，基本上單分散的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物-寡聚體偶聯(lián)物的受試者間的差異性小于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的受試者間的差異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，基本上單分散的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以是由不同的方法測(cè)定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，受試者間的差異性可以通過(guò)不同的方法測(cè)定。受試者間的差異性優(yōu)選如下計(jì)算。測(cè)定每名受試者的劑量反應(yīng)曲線下的面積(AUC)(即劑量反應(yīng)曲線和基線值之間的面積)。通過(guò)計(jì)算每名受試者的AUC的總數(shù)并用該總數(shù)除以受試者數(shù)量而確定所有受試者的平均AUC。然后對(duì)每名受試者測(cè)定受試者的AUC與平均AUC之間的差別的絕對(duì)值。隨后計(jì)算所得的差異的絕對(duì)值的總數(shù)得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較大的受試者間的差異性。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有二個(gè)或更多個(gè)上述的改善的性能。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有三個(gè)或更多個(gè)上述的改善的性能。最優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有所有四個(gè)上述的改善的性能。
進(jìn)一步的其它的根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案提供具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的偶聯(lián)物的混合物。所述混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物。所述標(biāo)準(zhǔn)偏差優(yōu)選為小于大約14道爾頓，更優(yōu)選小于大約11道爾頓。所述分子量分布可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)定，所述的方法包括但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版1991)所述的凝膠滲透色譜法。分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差則可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的統(tǒng)計(jì)方法測(cè)定。
所述生長(zhǎng)激素藥物優(yōu)選為人生長(zhǎng)激素。但是，應(yīng)該理解所述生長(zhǎng)激素藥物可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的生長(zhǎng)激素藥物，例如它包括生長(zhǎng)激素肽、生長(zhǎng)激素肽類似物、生長(zhǎng)激素肽片斷和生長(zhǎng)激素肽片斷類似物。生長(zhǎng)激素肽包括但不限于生長(zhǎng)激素，人(hGH)；生長(zhǎng)激素，豬；生長(zhǎng)激素，牛；生長(zhǎng)激素，雞；生長(zhǎng)激素，大鼠；生長(zhǎng)激素，小鼠；生長(zhǎng)激素，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，人；生長(zhǎng)激素pro-釋放因子，人；生長(zhǎng)激素釋放因子，小鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，大鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，牛；生長(zhǎng)激素釋放因子，豬；和生長(zhǎng)激素釋放因子，雞。生長(zhǎng)激素肽類似物可以如上述通過(guò)取代生長(zhǎng)激素肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到。生長(zhǎng)激素肽片斷包括但不限于生長(zhǎng)激素1-43，人；生長(zhǎng)激素6-13；生長(zhǎng)激素釋放因子1-37，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長(zhǎng)激素釋放六肽)；和生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長(zhǎng)激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-32，酰胺；生長(zhǎng)激素釋放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述寡聚體可以是包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優(yōu)選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基。更優(yōu)選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個(gè)聚亞烷基二醇亞基。最優(yōu)選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選為低級(jí)烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述的聚亞烷基二醇部分更優(yōu)選具有均一的結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分。具有均一的結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分的實(shí)例如下 這種均一的聚丙二醇結(jié)構(gòu)可以描述為僅具有一個(gè)與聚丙二醇鏈上的每個(gè)氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可能表現(xiàn)出親脂和親水特征，因而用于在不使用親脂聚合物部分的情況下得到兩親型生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。而且聚丙二醇部分的仲醇部分與生長(zhǎng)激素藥物的偶合可以得到對(duì)酶如腸中發(fā)現(xiàn)的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶導(dǎo)致的降解的抵抗力增大的生長(zhǎng)激素藥物(例如人生長(zhǎng)激素)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇優(yōu)選如圖11-13所示合成，現(xiàn)在將對(duì)此進(jìn)行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體54。所述伯醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化劑如Ac2O。優(yōu)選所述的伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應(yīng)的伯醇封端劑，例如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延長(zhǎng)單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長(zhǎng)單體54可以與仲醇封端劑反應(yīng)得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯。化合物56可以與B1解封劑反應(yīng)以除去封端部分B1并得到伯醇延長(zhǎng)單體57。所述B1解封劑可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑。當(dāng)通過(guò)成酯將所述伯醇封端時(shí)，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當(dāng)使用甲硅烷基氯將伯醇封端時(shí)，B1解封劑優(yōu)選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長(zhǎng)單體54和仲醇延長(zhǎng)單體57封端。仲醇延長(zhǎng)單體54可以與封端劑反應(yīng)得到化合物59。所述封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷?；衔?9可以與上述的B1解封劑反應(yīng)得到伯醇封端單體60。伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與封端劑反應(yīng)得到化合物62。所述封端劑可以是如上述的不同的封端劑?；衔?2可以與B2解封劑反應(yīng)以除去封端部分B2和得到仲醇封端單體63。所述B2解封劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。所述仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實(shí)施方案表示封端單體的合成，應(yīng)該理解可以進(jìn)行類似的反應(yīng)以得到封端聚合物。
一般地，鏈延長(zhǎng)可以通過(guò)以下方法進(jìn)行使伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物如伯醇延長(zhǎng)單體57與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55反應(yīng)得到不同的均一的聚丙烯鏈，或者使仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物如仲醇延長(zhǎng)單體54與仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58反應(yīng)。
例如，在圖13中，伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55與伯醇延長(zhǎng)單體57反應(yīng)得到二聚物化合物65?？蛇x擇地，仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長(zhǎng)單體54反應(yīng)得到二聚物化合物65?？梢允褂蒙鲜龅腂1解封劑除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延長(zhǎng)二聚物66。伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67?？蛇x擇地，可以使用上述的B2解封劑除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延長(zhǎng)二聚物69。仲醇延長(zhǎng)二聚物69可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，鏈延長(zhǎng)過(guò)程可以重復(fù)進(jìn)行以得到不同的其它鏈長(zhǎng)度。例如如圖13所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70反應(yīng)得到四聚物化合物72。如圖13進(jìn)一步顯示，一般的鏈延長(zhǎng)反應(yīng)路線包括伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物73與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯74反應(yīng)得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍可以是0-1000，或者更優(yōu)選m和n各自為0-50。雖然圖13所示的實(shí)施方案表示伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物與伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯，但應(yīng)該理解可以使用仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物和仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯完成類似的反應(yīng)。
伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物71。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延長(zhǎng)三聚物可以與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)以延長(zhǎng)封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物68?？梢匀缫陨纤龀ニ龅腂2封端部分，且所得的封端的仲醇延長(zhǎng)三聚物可以與仲醇延長(zhǎng)鏈節(jié)甲磺酸酯反以延長(zhǎng)封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應(yīng)得到三聚物，但應(yīng)該理解封端過(guò)程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何點(diǎn)進(jìn)行，或者可選擇地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實(shí)施方案表示通過(guò)使用封端單體進(jìn)行合成而將聚丁烯寡聚體封端，應(yīng)該理解本發(fā)明的聚丁烯寡聚體可以是使用以上圖11所述的封端劑而進(jìn)行直接封端(即不加入封端單體)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法與生長(zhǎng)激素藥物、親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，這些方法包括但不限于這里關(guān)于聚乙二醇部分所述的方法。
所述寡聚體可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它部分，包括不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。所述寡聚體中的不同的部分通過(guò)可水解或不可水解的鍵與另一寡聚體共價(jià)偶合。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過(guò)醚鍵偶合并具有相同的烷基結(jié)構(gòu)的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個(gè)聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分認(rèn)為是不同的部分，如果它們與除了醚鍵之外的鍵偶合或者它們具有不同的烷基結(jié)構(gòu)。例如，以下部分 是具有4個(gè)乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個(gè)聚乙二醇亞基的親水部分。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的寡聚體的的實(shí)施方案包含聚亞烷基二醇部分，并不進(jìn)一步包含親水部分。
所述的寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親脂部分。所述的親脂部分優(yōu)選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)所述的親脂部分為烷基部分時(shí)，優(yōu)選直鏈、飽和或不飽和具有1-28個(gè)，更優(yōu)選具有具有2-12個(gè)碳原子的碳原子的烷基部分。當(dāng)所述的親脂部分為脂肪酸部分時(shí)，優(yōu)選天然的脂肪酸是直鏈、天然脂肪酸部分，具有2-18個(gè)碳原子。更優(yōu)選，所述脂肪酸部分具有3-14個(gè)碳原子。最優(yōu)選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個(gè)碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的間隔部分。例如間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長(zhǎng)激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優(yōu)選自糖、膽固醇和甘油部分。
所述的寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)用于將寡聚體與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物偶合。優(yōu)選接頭部分選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)處在不與生長(zhǎng)激素藥物偶合的寡聚體的末端的末端部分。所述末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基部分。最優(yōu)選所述的末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，但應(yīng)該理解所述的末端部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。在某些實(shí)施方案中，利用可水解的鍵(酯或碳酸酯鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合?？伤獾呐己峡梢缘玫接米髑八幍纳L(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。例如在某些實(shí)施方案中，其中所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物無(wú)活性(即所述偶聯(lián)物缺乏通過(guò)生長(zhǎng)激素藥物的主要作用機(jī)理而影響效果的能力)，可水解的偶合可以用于延時(shí)釋放或控釋效果。在一個(gè)或多個(gè)寡聚體從它們的各自的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物上裂解得到活性藥物時(shí)，可以在確定的時(shí)間內(nèi)施用生長(zhǎng)激素藥物。在其它實(shí)施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合。當(dāng)期望使生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物在血流中進(jìn)行長(zhǎng)期，優(yōu)選至少2小時(shí)的循環(huán)時(shí)，可以優(yōu)選使用不可水解的鍵。當(dāng)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合時(shí)，所述寡聚體還包含一個(gè)或多個(gè)用于與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物的寡聚體共價(jià)偶合的鍵合部分。鍵合部分優(yōu)選選自共價(jià)鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚體上多于1個(gè)部分可以與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。
雖然所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合，但應(yīng)該理解所述寡聚體可以與生長(zhǎng)激素藥物非共價(jià)偶合形成非共價(jià)偶聯(lián)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，非共價(jià)偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質(zhì)體包囊。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，寡聚體可以被適宜構(gòu)建、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇地方式進(jìn)行非共價(jià)偶聯(lián)的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由不同的化合物的衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非共價(jià)偶合(復(fù)合)。所得的復(fù)合物優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價(jià)偶聯(lián)的復(fù)合物。由這種復(fù)合作用得到的產(chǎn)品優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個(gè)寡聚體(即多個(gè)寡聚體)可以與生長(zhǎng)激素藥物偶合。多數(shù)的寡聚體優(yōu)選相同。但是，應(yīng)該理解多數(shù)寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數(shù)寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當(dāng)多個(gè)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合時(shí)，可以優(yōu)選將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合和將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有不可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合?？蛇x擇地，所有將多數(shù)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而快速地從生長(zhǎng)激素藥物上除去和一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而緩慢地從生長(zhǎng)激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長(zhǎng)激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。例如，親核羥基官能團(tuán)可以見(jiàn)于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團(tuán)可以見(jiàn)于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個(gè)或多個(gè)多肽的N-末端。當(dāng)寡聚體與一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)激素多肽的N-末端偶合時(shí)，所述偶合優(yōu)選形成仲胺。例如，當(dāng)所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素時(shí)，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團(tuán)偶合。
具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以是由不同的方法合成。例如，通過(guò)以下方法合成具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布并由羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物使具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的羧酸的混合物與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的聚乙二醇的混合物在足以得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的寡聚體的混合物接觸。然后將具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長(zhǎng)激素藥物反應(yīng)得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。
用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個(gè)實(shí)施方案如圖3所示，并如以下實(shí)施例11-18所述。用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖4所示，并如以下實(shí)施例19-24所述。用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的進(jìn)一步的另一個(gè)實(shí)施方案如圖5所示，并如以下的實(shí)施例25-29所述。用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖6所示，并如以下的實(shí)施例30-31所述。用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖7所示，并如以下的實(shí)施例32-37所述。用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖8所示，并如下以下的實(shí)施例38所述。用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖9所示，并如以下的實(shí)施例39所述。用于得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖10所示，并如以下實(shí)施例40所述。
使所述的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物的混合物在足以得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的條件下反應(yīng)。合成實(shí)例如以下實(shí)施例40-42所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以控制反應(yīng)條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使由具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物和具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物的混合物反應(yīng)得到的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物是具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的混合物。例如，可以通過(guò)將反應(yīng)溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制在賴氨酸的氨基官能團(tuán)上的偶聯(lián)?？蛇x擇地，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以利用HPLC分離(separated和isolated)得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物，例如一、二或三偶聯(lián)物?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的分離的偶聯(lián)物的偶聯(lián)程度(例如所分離的分子為一、二或三偶聯(lián)物)，這些技術(shù)包括但不限于質(zhì)譜?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)(例如所述寡聚體處在人生長(zhǎng)激素一偶聯(lián)物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術(shù)包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內(nèi)肽酶切割。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如可以通過(guò)使生長(zhǎng)激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應(yīng)而將生長(zhǎng)激素藥物上的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)部位封端。例如在所述的生長(zhǎng)激素藥物為多肽并期望形成在多肽的一個(gè)或多個(gè)N-末端具有一個(gè)或多個(gè)寡聚體的不飽和的偶聯(lián)物(即并非所有的親核殘基被偶聯(lián))時(shí)可以優(yōu)選這種方法。在進(jìn)行這種封端之后，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的封端的生長(zhǎng)激素藥物的混合物可以與具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物反應(yīng)得到具有與一個(gè)或多個(gè)親核殘基偶合的寡聚體和具有與其它親核殘基偶合的封端部分的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在偶聯(lián)反應(yīng)之后可以將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物解封。如果需要的話，然后可以如上述分離所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物得到具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物?？蛇x擇地，可以在解封之前分離所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有比常規(guī)混合物改善的性能。例如，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選的體內(nèi)活性大于具有與具備標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體內(nèi)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以由不同的方法測(cè)定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選體外活性大于具有與具備標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體外活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，所述的方法包括但不限于體積排阻色譜法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以通過(guò)不同的方法測(cè)定特定混合物的體外活性。優(yōu)選使用從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購(gòu)的Cytosensort微生理機(jī)能測(cè)定儀測(cè)定體外活性。所述微生理機(jī)能測(cè)定儀監(jiān)測(cè)對(duì)被加到在Transwell中培養(yǎng)的細(xì)胞中的藥物作出反應(yīng)而發(fā)生的細(xì)胞外酸化速率的細(xì)微變化。這種反應(yīng)與研究的分子的活性成比例。
作為另一個(gè)實(shí)例，當(dāng)與具有與具備標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，具有具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其受試者間的差異性小于具有與具備標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的受試者間的差異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法測(cè)定受試者間的差異性。優(yōu)選如下計(jì)算受試者間的差異性。測(cè)定每名受試者的劑量反應(yīng)曲線下的面積(AUC)(即劑量反應(yīng)曲線和基線值之間的面積)。所有受試者的平均AUC通過(guò)計(jì)算每名受試者的AUC并將此總和除去受試者的數(shù)量來(lái)確定。然后對(duì)每名受試者測(cè)定受試者的AUC和平均AUC之間的差異的絕對(duì)值。然后計(jì)算所得的差異的絕對(duì)值的總和得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較高的受試者間的差異性。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有二種或更多種上述的改善性能。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有三種或更多種上述的改善的性能。最優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有所有上述的改善性能。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，且所述混合物的分散系數(shù)(DC)大于10,000，其中
DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1NNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數(shù)量；Ni為樣品中ith分子的數(shù)量；和Mi為ith分子的質(zhì)量。
所述偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其分散系數(shù)大于100,000。更優(yōu)選，所述偶聯(lián)物的混合物的分散系數(shù)大于500,000，并最優(yōu)選其分散系數(shù)大于10,000,000。變量n、Ni和Mi可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法測(cè)定，這些方法包括但不限于以下實(shí)施例44所述的方法。
所述的生長(zhǎng)激素藥物優(yōu)選為人生長(zhǎng)激素。但是，應(yīng)該理解所述的生長(zhǎng)激素藥物可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的生長(zhǎng)激素藥物，例如它包括生長(zhǎng)激素肽、生長(zhǎng)激素肽類似物、生長(zhǎng)激素肽片斷和生長(zhǎng)激素肽片斷類似物。生長(zhǎng)激素肽包括但不限于生長(zhǎng)激素，人(hGH)；生長(zhǎng)激素，豬；生長(zhǎng)激素，牛；生長(zhǎng)激素，雞；生長(zhǎng)激素，大鼠；生長(zhǎng)激素，小鼠；生長(zhǎng)激素，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，人；生長(zhǎng)激素pro-釋放因子，人；生長(zhǎng)激素釋放因子，小鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，大鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，牛；生長(zhǎng)激素釋放因子，豬；和生長(zhǎng)激素釋放因子，雞。可以如上述通過(guò)取代生長(zhǎng)激素肽上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到生長(zhǎng)激素肽類似物。生長(zhǎng)激素肽片斷包括但不限于生長(zhǎng)激素1-43，人；生長(zhǎng)激素6-13；生長(zhǎng)激素釋放因子1-37，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長(zhǎng)激素釋放六肽)；和生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長(zhǎng)激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-32，酰胺；生長(zhǎng)激素釋放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述的寡聚體可以是包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優(yōu)選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基。更優(yōu)選，所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個(gè)聚亞烷基二醇亞基。最優(yōu)選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選為低級(jí)烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亞烷基二醇部分更優(yōu)選為具有均一結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分。具有均一的結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分的一個(gè)實(shí)例如下 此均一的聚丙二醇結(jié)構(gòu)可以描述為僅具有一個(gè)與聚丙二醇鏈上的每個(gè)氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現(xiàn)出親脂和親水特征，因而用于在不使用親脂聚合物部分的情況下得到兩親型生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長(zhǎng)激素藥物偶合可得到對(duì)酶如腸中發(fā)現(xiàn)的胰島素和胰凝乳蛋白酶導(dǎo)致的降解的抵抗力增大的生長(zhǎng)激素藥物(例如人生長(zhǎng)激素)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇優(yōu)選如圖11-13所示合成，現(xiàn)在將對(duì)其進(jìn)行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體54。所述伯醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化劑如AC2O。優(yōu)選所述的伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應(yīng)的伯醇封端劑，例如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延長(zhǎng)單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長(zhǎng)單體54可以與仲醇封端劑反應(yīng)得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯?；衔?6可以與B1解封劑反應(yīng)以除去封端部分B1并得到伯醇延長(zhǎng)單體57。所述B1解封劑可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑。當(dāng)通過(guò)成酯將所述伯醇封端時(shí)，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當(dāng)使用甲硅烷基氯將伯醇封端時(shí)，B1解封劑優(yōu)選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長(zhǎng)單體54和仲醇延長(zhǎng)單體57封端。仲醇延長(zhǎng)單體54可以與封端劑反應(yīng)得到化合物59。所述封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷?；衔?9可以與上述的B1解封劑反應(yīng)得到伯醇封端單體60。伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與封端劑反應(yīng)得到化合物62。所述封端劑可以是如上述的不同的封端劑?；衔?2可以與B2解封劑反應(yīng)以除去封端部分B2和得到仲醇封端單體63。所述B2解封劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。所述仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實(shí)施方案表示封端單體的合成，應(yīng)該理解可以進(jìn)行類似的反應(yīng)以得到封端聚合物。
一般地，鏈延長(zhǎng)可以通過(guò)以下方法進(jìn)行使伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物如伯醇延長(zhǎng)單體57與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55反應(yīng)得到不同的均一的聚丙烯鏈，或者使仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物如仲醇延長(zhǎng)單體54與仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58反應(yīng)。
例如在圖13中，伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55與伯醇延長(zhǎng)單體57反應(yīng)得到二聚物化合物65?？蛇x擇地，仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長(zhǎng)單體54反應(yīng)得到二聚物化合物65。可以使用上述的B1解封劑除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延長(zhǎng)二聚物66。伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67。可選擇地，可以使用上述的B2解封劑除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延長(zhǎng)二聚物69。仲醇延長(zhǎng)二聚物69可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，鏈延長(zhǎng)過(guò)程可以重復(fù)進(jìn)行以得到不同的其它鏈長(zhǎng)度。例如如圖13所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70反應(yīng)得到四聚物化合物72。如圖13進(jìn)一步顯示，一般的鏈延長(zhǎng)反應(yīng)路線包括伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物73與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯74反應(yīng)得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍可以是0-1000，或者更優(yōu)選m和n各自為0-50。雖然圖13所示的實(shí)施方案表示伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物與伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯，但應(yīng)該理解可以使用仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物和仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯完成類似的反應(yīng)。
伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物71。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延長(zhǎng)三聚物可以與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)以延長(zhǎng)封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物68?？梢匀缫陨纤龀ニ龅腂2封端部分，且所得的封端的仲醇延長(zhǎng)三聚物可以與仲醇延長(zhǎng)鏈節(jié)甲磺酸酯反以延長(zhǎng)封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應(yīng)得到三聚物，但應(yīng)該理解封端過(guò)程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何點(diǎn)進(jìn)行，或者可選擇地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實(shí)施方案表示通過(guò)使用封端單體進(jìn)行合成而將聚丁烯寡聚體封端，應(yīng)該理解本發(fā)明的聚丁烯寡聚體可以是使用以上圖11所述的封端劑而進(jìn)行直接封端(即不加入封端單體)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法與生長(zhǎng)激素藥物、親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，這些方法包括但不限于這里關(guān)于聚乙二醇部分所述的方法。
所述的寡聚體可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它部分，包括不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。所述寡聚體中的不同的部分通過(guò)可水解或不可水解的鍵與另一寡聚體共價(jià)偶合。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過(guò)醚鍵偶合并具有相同的烷基結(jié)構(gòu)的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個(gè)聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分認(rèn)為是不同的部分，如果它們與除了醚鍵之外的鍵偶合或者它們具有不同的烷基結(jié)構(gòu)。例如，以下部分 是具有4個(gè)乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個(gè)聚乙二醇亞基的親水部分。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的寡聚體的的實(shí)施方案包含聚亞烷基二醇部分，并不進(jìn)一步包含親水部分。
所述的寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親脂部分。所述的親脂部分優(yōu)選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)所述的親脂部分為烷基部分時(shí)，優(yōu)選直鏈、飽和或不飽和具有1-28個(gè)，更優(yōu)選具有具有2-12個(gè)碳原子的碳原子的烷基部分。當(dāng)所述的親脂部分為脂肪酸部分時(shí)，優(yōu)選天然的脂肪酸是直鏈、天然脂肪酸部分，具有2-18個(gè)碳原子。更優(yōu)選，所述脂肪酸部分具有3-14個(gè)碳原子。最優(yōu)選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個(gè)碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的間隔部分。例如間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長(zhǎng)激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優(yōu)選自糖、膽固醇和甘油部分。
所述的寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)用于將寡聚體與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物偶合。優(yōu)選接頭部分選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)處在不與生長(zhǎng)激素藥物偶合的寡聚體的末端的末端部分。所述末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基部分。最優(yōu)選所述的末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，但應(yīng)該理解所述的末端部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。在某些實(shí)施方案中，利用可水解的鍵(酯或碳酸酯鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合?？伤獾呐己峡梢缘玫接米髑八幍纳L(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。例如在某些實(shí)施方案中，其中所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物無(wú)活性(即所述偶聯(lián)物缺乏通過(guò)生長(zhǎng)激素藥物的主要作用機(jī)理而影響效果的能力)，可水解的偶合可以用于延時(shí)釋放或控釋效果。在一個(gè)或多個(gè)寡聚體從它們的各自的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物上裂解得到活性藥物時(shí)，可以在確定的時(shí)間內(nèi)施用生長(zhǎng)激素藥物。在其它實(shí)施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合。當(dāng)期望使生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物在血流中進(jìn)行長(zhǎng)期，優(yōu)選至少2小時(shí)的循環(huán)時(shí)，可以優(yōu)選使用不可水解的鍵。當(dāng)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合時(shí)，所述寡聚體還包含一個(gè)或多個(gè)用于與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物的寡聚體共價(jià)偶合的鍵合部分。鍵合部分優(yōu)選選自共價(jià)鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚體上多于1個(gè)部分可以與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。
雖然所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合，但應(yīng)該理解所述寡聚體可以與生長(zhǎng)激素藥物非共價(jià)偶合形成非共價(jià)偶聯(lián)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，非共價(jià)偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質(zhì)體包囊。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，寡聚體可以被適宜構(gòu)建、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇地方式進(jìn)行非共價(jià)偶聯(lián)的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由不同的化合物的衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非共價(jià)偶合(復(fù)合)。所得的復(fù)合物優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價(jià)偶聯(lián)的復(fù)合物。由這種復(fù)合作用得到的產(chǎn)品優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個(gè)寡聚體(即多個(gè)寡聚體)可以與生長(zhǎng)激素藥物偶合。多數(shù)的寡聚體優(yōu)選相同。但是，應(yīng)該理解多數(shù)寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數(shù)寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當(dāng)多個(gè)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合時(shí)，可以優(yōu)選將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合和將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有不可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合?？蛇x擇地，所有將多數(shù)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而快速地從生長(zhǎng)激素藥物上除去和一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而緩慢地從生長(zhǎng)激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長(zhǎng)激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。例如，親核羥基官能團(tuán)可以見(jiàn)于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團(tuán)可以見(jiàn)于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個(gè)或多個(gè)多肽的N-末端。當(dāng)寡聚體與一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)激素多肽的N-末端偶合時(shí)，所述偶合優(yōu)選形成仲胺。例如，當(dāng)所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素時(shí)，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團(tuán)偶合。
可以由不同的方法合成分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。例如，通過(guò)以下方法合成由羧酸和聚乙二醇組成的分散系數(shù)大于10,000的寡聚體的混合物使分散系數(shù)大于10,000的羧酸的混合物與分散系數(shù)大于10,000的聚乙二醇的混合物在足以得到分散系數(shù)大于10,000的寡聚體的混合物的條件下接觸。然后將分散系數(shù)大于10,000的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長(zhǎng)激素藥物反應(yīng)得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個(gè)實(shí)施方案如圖3所示，并如以下的實(shí)施例11-18所述。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖4所示，并如以下的實(shí)施例19-24所述。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖5所示，并如以下的實(shí)施例25-29所述。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖6所示，并如以下實(shí)施例30-31所述。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖7所示，并如以下的實(shí)施例32-37所述。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖8所示，并如以下的實(shí)施例38所述。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖9所示，并如以下的實(shí)施例39所述。用于得到分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖10所示，并如以下的實(shí)施例40所述。
將分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物與分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物的混合物在足以得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的條件下反應(yīng)。合成實(shí)例如以下實(shí)施例40-42所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以控制反應(yīng)條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使由分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物和分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物的混合物反應(yīng)得到的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物是分散系數(shù)大于10,000的混合物。例如，可以通過(guò)將反應(yīng)溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制在賴氨酸的氨基官能團(tuán)上的偶聯(lián)。可選擇地，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以利用HPLC分離(separated和isolated)得到分散系數(shù)大于10,000的一、二或三偶聯(lián)物?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的分離的偶聯(lián)物的偶聯(lián)程度(例如所分離的分子為一、二或三偶聯(lián)物)，這些技術(shù)包括但不限于質(zhì)譜。可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)(例如所述寡聚體處在人生長(zhǎng)激素一偶聯(lián)物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術(shù)包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內(nèi)肽酶切割。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如可以通過(guò)使生長(zhǎng)激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應(yīng)而將生長(zhǎng)激素藥物上的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)部位封端。例如在所述的生長(zhǎng)激素藥物為多肽并期望形成在多肽的一個(gè)或多個(gè)N-末端具有一個(gè)或多個(gè)寡聚體的不飽和的偶聯(lián)物(即并非所有的親核殘基被偶聯(lián))時(shí)可以優(yōu)選這種方法。在進(jìn)行這種封端之后，分散系數(shù)大于10,000的封端的生長(zhǎng)激素藥物的混合物可以與分散系數(shù)大于10,000的活化的寡聚體的混合物反應(yīng)得到具有與一個(gè)或多個(gè)親核殘基偶合的寡聚體和具有與其它親核殘基偶合的封端部分的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在偶聯(lián)反應(yīng)之后可以將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物解封。如果需要的話，然后可以如上述分離所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物得到分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。可選擇地，可以在解封之前分離所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有比常規(guī)混合物改善的性能。例如，分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其體內(nèi)活性大于具有與分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體內(nèi)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以通過(guò)不同的方法測(cè)定分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARYPOLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其體外活性大于具有與分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體外活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以通過(guò)不同的方法測(cè)定分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以通過(guò)不同的方法測(cè)定特定的混合物的體外活性。優(yōu)選使用從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購(gòu)的Cytosensort微生理機(jī)能測(cè)定儀測(cè)定體外活性。所述微生理機(jī)能測(cè)定儀監(jiān)測(cè)對(duì)被加到在Transwell中培養(yǎng)的細(xì)胞的藥物作出反應(yīng)而發(fā)生的細(xì)胞外酸化速率的細(xì)微變化。這種反應(yīng)與研究的分子的活性成比例。
作為另一個(gè)實(shí)例，當(dāng)與具有與分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比時(shí)，分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其受試者間的差異性小于具有與分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的受試者間的差異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法測(cè)定受試者間的差異性。優(yōu)選如下計(jì)算受試者間的差異性。測(cè)定每名受試者的劑量反應(yīng)曲線下的面積(AUC)(即劑量反應(yīng)曲線和基線值之間的面積)。所有受試者的平均AUC通過(guò)計(jì)算每名受試者的AUC并將此總和除去受試者的數(shù)量來(lái)確定。然后對(duì)每名受試者測(cè)定受試者的AUC和平均AUC之間的差異的絕對(duì)值。然后計(jì)算所得的差異的絕對(duì)值的總和得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較高的受試者間的差異性。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有二種或更多種上述的改善性能。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有三種或更多種上述的改善性能。最優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分散系數(shù)大于10,000的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有所有4種上述的改善性能。
根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，在偶聯(lián)物的混合物中，每個(gè)偶聯(lián)物包括與寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物并具有相同數(shù)量的聚亞烷基二醇亞基。
所述的生長(zhǎng)激素藥物優(yōu)選為人生長(zhǎng)激素。但是，應(yīng)該理解所述的生長(zhǎng)激素藥物可以選自不同的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物，例如它包括但不限于生長(zhǎng)激素肽、生長(zhǎng)激素肽類似物、生長(zhǎng)激素肽片斷和生長(zhǎng)激素肽片斷類似物。生長(zhǎng)激素肽包括但不限于生長(zhǎng)激素，人(hGH)；生長(zhǎng)激素，豬；生長(zhǎng)激素，牛；生長(zhǎng)激素，雞；生長(zhǎng)激素，大鼠；生長(zhǎng)激素，小鼠；生長(zhǎng)激素，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，人；生長(zhǎng)激素pro-釋放因子，人；生長(zhǎng)激素釋放因子，小鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，大鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，牛；生長(zhǎng)激素釋放因子，豬；和生長(zhǎng)激素釋放因子，雞。生長(zhǎng)激素肽類似物可以如上述通過(guò)取代生長(zhǎng)激素肽上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到。生長(zhǎng)激素肽片斷包括但不限于生長(zhǎng)激素1-43，人；生長(zhǎng)激素6-13；生長(zhǎng)激素釋放因子1-37，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長(zhǎng)激素釋放六肽)；和生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長(zhǎng)激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-32，酰胺；生長(zhǎng)激素釋放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述的寡聚體可以是包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優(yōu)選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基。更優(yōu)選，所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個(gè)聚亞烷基二醇亞基。最優(yōu)選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選為低級(jí)烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亞烷基二醇部分更優(yōu)選為具有均一結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分。具有均一的結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分的一個(gè)實(shí)例如下 此均一的聚丙二醇結(jié)構(gòu)可以描述為僅具有一個(gè)與聚丙二醇鏈上的每個(gè)氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現(xiàn)出親脂和親水特征，因而用于在不使用親脂聚合物部分的情況下得到兩親型生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長(zhǎng)激素藥物偶合可得到對(duì)酶如腸中發(fā)現(xiàn)的胰島素和胰凝乳蛋白酶導(dǎo)致的降解的抵抗力增大的生長(zhǎng)激素藥物(例如人生長(zhǎng)激素)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇優(yōu)選如圖11-13所示合成，現(xiàn)在將對(duì)其進(jìn)行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體54。所述伯醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化劑如AC2O。優(yōu)選所述的伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應(yīng)的伯醇封端劑，例如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延長(zhǎng)單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長(zhǎng)單體54可以與仲醇封端劑反應(yīng)得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯?；衔?6可以與B1解封劑反應(yīng)以除去封端部分B1并得到伯醇延長(zhǎng)單體57。所述B1解封劑可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑。當(dāng)通過(guò)成酯將所述伯醇封端時(shí)，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當(dāng)使用甲硅烷基氯將伯醇封端時(shí)，B1解封劑優(yōu)選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長(zhǎng)單體54和仲醇延長(zhǎng)單體57封端。仲醇延長(zhǎng)單體54可以與封端劑反應(yīng)得到化合物59。所述封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷?；衔?9可以與上述的B1解封劑反應(yīng)得到伯醇封端單體60。伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與封端劑反應(yīng)得到化合物62。所述封端劑可以是如上述的不同的封端劑?；衔?2可以與B2解封劑反應(yīng)以除去封端部分B2和得到仲醇封端單體63。所述B2解封劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。所述仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實(shí)施方案表示封端單體的合成，應(yīng)該理解可以進(jìn)行類似的反應(yīng)以得到封端聚合物。
一般地，鏈延長(zhǎng)可以通過(guò)以下方法進(jìn)行使伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物如伯醇延長(zhǎng)單體57與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55反應(yīng)得到不同的均一的聚丙烯鏈，或者使仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物如仲醇延長(zhǎng)單體54與仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58反應(yīng)。
例如在圖13中，伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55與伯醇延長(zhǎng)單體57反應(yīng)得到二聚物化合物65?？蛇x擇地，仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長(zhǎng)單體54反應(yīng)得到二聚物化合物65?？梢允褂蒙鲜龅腂1解封劑除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延長(zhǎng)二聚物66。伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67?？蛇x擇地，可以使用上述的B2解封劑除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延長(zhǎng)二聚物69。仲醇延長(zhǎng)二聚物69可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，鏈延長(zhǎng)過(guò)程可以重復(fù)進(jìn)行以得到不同的其它鏈長(zhǎng)度。例如如圖13所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70反應(yīng)得到四聚物化合物72。如圖13進(jìn)一步顯示，一般的鏈延長(zhǎng)反應(yīng)路線包括伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物73與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯74反應(yīng)得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍可以是0-1000，或者更優(yōu)選m和n各自為0-50。雖然圖13所示的實(shí)施方案表示伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物與伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯，但應(yīng)該理解可以使用仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物和仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯完成類似的反應(yīng)。
伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物71。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延長(zhǎng)三聚物可以與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)以延長(zhǎng)封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或者仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物68。可以如以上所述除去所述的B2封端部分，且所得的封端的仲醇延長(zhǎng)三聚物可以與仲醇延長(zhǎng)鏈節(jié)甲磺酸酯反以延長(zhǎng)封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應(yīng)得到三聚物，但應(yīng)該理解封端過(guò)程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何點(diǎn)進(jìn)行，或者可選擇地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實(shí)施方案表示通過(guò)使用封端單體進(jìn)行合成而將聚丁烯寡聚體封端，應(yīng)該理解本發(fā)明的聚丁烯寡聚體可以是使用以上圖11所述的封端劑而進(jìn)行直接封端(即不加入封端單體)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法與生長(zhǎng)激素藥物、親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，這些方法包括但不限于這里關(guān)于聚乙二醇部分所述的方法。
所述的寡聚體可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它部分，包括不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。所述寡聚體中的不同的部分通過(guò)可水解或不可水解的鍵與另一寡聚體共價(jià)偶合。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過(guò)醚鍵偶合并具有相同的烷基結(jié)構(gòu)的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個(gè)聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分認(rèn)為是不同的部分，如果它們與除了醚鍵之外的鍵偶合或者它們具有不同的烷基結(jié)構(gòu)。例如，以下部分 是具有4個(gè)乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個(gè)聚乙二醇亞基的親水部分。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的寡聚體的的實(shí)施方案包含聚亞烷基二醇部分，并不進(jìn)一步包含親水部分。
所述的寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親脂部分。所述的親脂部分優(yōu)選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)所述的親脂部分為烷基部分時(shí)，優(yōu)選直鏈、飽和或不飽和具有1-28個(gè)，更優(yōu)選具有具有2-12個(gè)碳原子的碳原子的烷基部分。當(dāng)所述的親脂部分為脂肪酸部分時(shí)，優(yōu)選天然的脂肪酸是直鏈、天然脂肪酸部分，具有2-18個(gè)碳原子。更優(yōu)選，所述脂肪酸部分具有3-14個(gè)碳原子。最優(yōu)選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個(gè)碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的間隔部分。例如間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長(zhǎng)激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優(yōu)選自糖、膽固醇和甘油部分。
所述的寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)用于將寡聚體與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物偶合。優(yōu)選接頭部分選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個(gè)或多個(gè)處在不與生長(zhǎng)激素藥物偶合的寡聚體的末端的末端部分。所述末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基部分。最優(yōu)選所述的末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，但應(yīng)該理解所述的末端部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。在某些實(shí)施方案中，利用可水解的鍵(酯或碳酸酯鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合?？伤獾呐己峡梢缘玫接米髑八幍纳L(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。例如在某些實(shí)施方案中，其中所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物無(wú)活性(即所述偶聯(lián)物缺乏通過(guò)生長(zhǎng)激素藥物的主要作用機(jī)理而影響效果的能力)，可水解的偶合可以用于延時(shí)釋放或控釋效果。在一個(gè)或多個(gè)寡聚體從它們的各自的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物上裂解得到活性藥物時(shí)，可以在確定的時(shí)間內(nèi)施用生長(zhǎng)激素藥物。在其它實(shí)施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合。當(dāng)期望使生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物在血流中進(jìn)行長(zhǎng)期，優(yōu)選至少2小時(shí)的循環(huán)時(shí)，可以優(yōu)選使用不可水解的鍵。當(dāng)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合時(shí)，所述寡聚體還包含一個(gè)或多個(gè)用于與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物的寡聚體共價(jià)偶合的鍵合部分。鍵合部分優(yōu)選選自共價(jià)鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚體上多于1個(gè)部分可以與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。
雖然所述寡聚體優(yōu)選與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合，但應(yīng)該理解所述寡聚體可以與生長(zhǎng)激素藥物非共價(jià)偶合形成非共價(jià)偶聯(lián)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，非共價(jià)偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質(zhì)體包囊。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，寡聚體可以被適宜構(gòu)建、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇地方式進(jìn)行非共價(jià)偶聯(lián)的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由不同的化合物的衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非共價(jià)偶合(復(fù)合)。所得的復(fù)合物優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的其它實(shí)施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價(jià)偶聯(lián)的復(fù)合物。由這種復(fù)合作用得到的產(chǎn)品優(yōu)選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個(gè)寡聚體(即多個(gè)寡聚體)可以與生長(zhǎng)激素藥物偶合。多數(shù)的寡聚體優(yōu)選相同。但是，應(yīng)該理解多數(shù)寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數(shù)寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當(dāng)多個(gè)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合時(shí)，可以優(yōu)選將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合和將一個(gè)或多個(gè)寡聚體與具有不可水解的鍵的生長(zhǎng)激素藥物偶合?？蛇x擇地，所有將多數(shù)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而快速地從生長(zhǎng)激素藥物上除去和一個(gè)或多個(gè)寡聚體通過(guò)在體內(nèi)水解而緩慢地從生長(zhǎng)激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長(zhǎng)激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。例如，親核羥基官能團(tuán)可以見(jiàn)于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團(tuán)可以見(jiàn)于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個(gè)或多個(gè)多肽的N-末端。當(dāng)寡聚體與一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)激素多肽的N-末端偶合時(shí)，所述偶合優(yōu)選形成仲胺。例如，當(dāng)所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素時(shí)，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團(tuán)偶合。
可以通過(guò)不同的方法合成其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的生長(zhǎng)激素藥物寡聚體偶聯(lián)物的混合物。例如，通過(guò)以下方法合成羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物，其中所述混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基使羧酸的混合物與其中的每個(gè)聚乙二醇分子具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的聚乙二醇的混合物在足以得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的寡聚體的混合物的條件下接觸。然后將其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的混合物中的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長(zhǎng)激素藥物得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物反應(yīng)。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個(gè)實(shí)施方案如圖3所示，并如以下的實(shí)施例11-18所述。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖4所示，并如以下的實(shí)施例19-24所述。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖5所示，并如以下的實(shí)施例25-29所述。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖6所示，并如以下的實(shí)施例30-31所述。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖7所示，并如以下的實(shí)施例32-37所述。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖8所示，并如以下的實(shí)施例38所述。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖9所示，并如以下的實(shí)施例39所述。用于得到其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖10所示，并如以下的實(shí)施例40所述。
所述的其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物與生長(zhǎng)激素藥物的混合物在足以得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的條件下反應(yīng)。合成的實(shí)例如以下實(shí)施例40-42所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以控制反應(yīng)條件(例如所選擇的摩爾比，溶劑混合物和/或pH)以使由其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物和生長(zhǎng)激素藥物的混合物反應(yīng)得到的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物是其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的偶聯(lián)物的混合物。例如，可以通過(guò)將反應(yīng)溶液的pH保持在賴氨酸的pKa下以下而抑制賴氨酸的氨基官能團(tuán)處的偶聯(lián)?？蛇x擇地，可以利用HPLC分離(separated和isolated)生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物，例如一、二或三偶聯(lián)物，其中所述混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的分離的偶聯(lián)物的偶聯(lián)程度(例如所分離的分子為一、二或三偶聯(lián)物)，這些技術(shù)包括但不限于質(zhì)譜?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)(例如所述寡聚體處在人生長(zhǎng)激素一偶聯(lián)物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術(shù)包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內(nèi)肽酶切割。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如可以通過(guò)使生長(zhǎng)激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應(yīng)而將生長(zhǎng)激素藥物上的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)部位封端。例如在所述的生長(zhǎng)激素藥物為多肽并期望形成在多肽的一個(gè)或多個(gè)N-末端具有一個(gè)或多個(gè)寡聚體的不飽和的偶聯(lián)物(即并非所有的親核殘基被偶聯(lián))時(shí)可以優(yōu)選這種方法。在進(jìn)行這種封端之后，可以使封端的生長(zhǎng)激素藥物的混合物與其中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物反應(yīng)得到具有與一個(gè)或多個(gè)親核殘基偶合的寡聚體和具有與親核殘基偶合的封端部分的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在偶聯(lián)反應(yīng)之后可以將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物解封。如果需要的話，然后可以如上述分離所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物得到所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)。可選擇地，可以在解封之前分離所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)優(yōu)選具有比常規(guī)的混合物改善的性能。例如，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)優(yōu)選其體內(nèi)活性大于具有與所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體內(nèi)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)施例，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)優(yōu)選其體外活性大于具有與所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體外活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以通過(guò)不同的方法測(cè)定特定的混合物的體外活性。優(yōu)選使用從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購(gòu)的Cytosensort微生理機(jī)能測(cè)定儀測(cè)定體外活性。所述微生理機(jī)能測(cè)定儀監(jiān)測(cè)對(duì)被加到在Transwell中培養(yǎng)的細(xì)胞的藥物作出反應(yīng)而發(fā)生的細(xì)胞外酸化速率的細(xì)微變化。這種反應(yīng)與研究的分子的活性成比例。
作為另一個(gè)實(shí)例，同具有與生長(zhǎng)激素藥物寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)相同數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力相比，根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)對(duì)胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力增大。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)的受試者間的差異性小于具有與生長(zhǎng)激素藥物寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)相同數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的受試者間的差異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法測(cè)定受試者間的差異性。優(yōu)選如下計(jì)算受試者間的差異性。測(cè)定每名受試者的劑量反應(yīng)曲線下的面積(AUC)(即劑量反應(yīng)曲線和基線值之間的面積)。所有受試者的平均AUC通過(guò)計(jì)算每名受試者的AUC并將此總和除去受試者的數(shù)量來(lái)確定。然后對(duì)每名受試者測(cè)定受試者的AUC和平均AUC之間的差異的絕對(duì)值。然后計(jì)算所得的差異的絕對(duì)值的總和得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較高的受試者間的差異性。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)優(yōu)選具有二種或更多種以上所述的改善性能。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)具有三個(gè)或更多個(gè)上述的改善性能。最優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)寡聚體具有相同數(shù)量的聚乙二醇亞基)具有所有上述的的改善性能。
根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案得到一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有下式生長(zhǎng)激素藥物 其中其中B為鍵合部分；L為接頭部分；G、G′和G″為獨(dú)立選擇的間隔部分；R為親脂部分而R′為聚亞烷基二醇部分，或者R′為親脂部分而R為聚亞烷基二醇部分；T為末端部分；h、i、j、k、m和n獨(dú)立地為0或1，附帶條件是當(dāng)R為聚亞烷基二醇部分時(shí)，m為1；當(dāng)R′為聚亞烷基二醇部分時(shí)，n為1；和p為1至生長(zhǎng)激素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。
所述的生長(zhǎng)激素藥物優(yōu)選為人生長(zhǎng)激素。但是，應(yīng)該理解所述的生長(zhǎng)激素藥物可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的生長(zhǎng)激素藥物，例如它包括但不限于生長(zhǎng)激素肽、生長(zhǎng)激素肽類似物、生長(zhǎng)激素肽片斷和生長(zhǎng)激素肽片斷類似物。生長(zhǎng)激素肽包括但不限于生長(zhǎng)激素，人(hGH)；生長(zhǎng)激素，豬；生長(zhǎng)激素，牛；生長(zhǎng)激素，雞；生長(zhǎng)激素，大鼠；生長(zhǎng)激素，小鼠；生長(zhǎng)激素，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，人；生長(zhǎng)激素pro-釋放因子，人；生長(zhǎng)激素釋放因子，小鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，綿羊；生長(zhǎng)激素釋放因子，大鼠；生長(zhǎng)激素釋放因子，牛；生長(zhǎng)激素釋放因子，豬；和生長(zhǎng)激素釋放因子，雞。可以如上述通過(guò)取代生長(zhǎng)激素肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到生長(zhǎng)激素肽類似物。生長(zhǎng)激素肽片斷包括但不限于生長(zhǎng)激素1-43，人；生長(zhǎng)激素6-13；生長(zhǎng)激素釋放因子1-37，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長(zhǎng)激素釋放六肽)；和生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長(zhǎng)激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr’，D-Arg2]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-29，酰胺；[His’，Nle27]-生長(zhǎng)激素釋放因子1-32，酰胺；生長(zhǎng)激素釋放肽-6([His’，Lys6]-GHRP)；和[D-Lys3]-GHRP-6。
根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方案，R或R′為聚亞烷基部分。所述的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基。更優(yōu)選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個(gè)聚亞烷基二醇亞基。最優(yōu)選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選為低級(jí)烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述的聚亞烷基二醇部分更優(yōu)選為具有均一的結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分。具有均一的結(jié)構(gòu)的聚丙二醇部分的實(shí)例如下 這種均一的聚丙二醇結(jié)構(gòu)可以描述為僅具有一個(gè)與聚丙二醇鏈中的每個(gè)氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現(xiàn)出親脂和親水特征，因而可以用于在不使用親脂聚合物部分的情況下提供兩親型生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物(即m+n之和為1)。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長(zhǎng)激素藥物的偶合可以得到對(duì)酶，例如在腸中發(fā)現(xiàn)的胰島素和胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力提高的生長(zhǎng)激素藥物(例如人生長(zhǎng)激素)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇優(yōu)選如圖11-13合成，現(xiàn)在將對(duì)其進(jìn)行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體54。所述伯醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員理的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化試劑如Ac2O。優(yōu)選所述伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應(yīng)的伯醇封端劑，例如叔丁基聯(lián)苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。仲醇延長(zhǎng)單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長(zhǎng)單體54可以與仲醇封端劑反應(yīng)得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯。化合物56可以與B1解封劑反應(yīng)除去封端部分B，并得到伯醇延長(zhǎng)單體57。所述B1解封劑可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑。當(dāng)通過(guò)形成酯將伯醇封端時(shí)，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當(dāng)使用甲硅烷基氯將伯醇封端時(shí)，B1解封劑優(yōu)選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長(zhǎng)單體54和仲醇延長(zhǎng)單體57封端。仲醇延長(zhǎng)單體54可以與封端劑反應(yīng)得到化合物59。所述封端劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷。化合物59可以與上述的B1解封劑反應(yīng)得到伯醇封端單體60。
伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長(zhǎng)單體57可以與封端劑反應(yīng)得到化合物62。封端劑可以是如上述的不同的封端劑?；衔?2可以與B2解封劑反應(yīng)以除去封端部分B2并得到仲醇封端單體63。B2解封劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實(shí)施方案表示封端單體的合成，但應(yīng)理解可以進(jìn)行類似的反應(yīng)得到封端聚合物。
一般地，鏈延長(zhǎng)可以通過(guò)伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物如伯醇延長(zhǎng)單體57與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55反應(yīng)而進(jìn)行，以得到不同的均一的聚丙烯鏈；或者通過(guò)仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物如仲醇延長(zhǎng)單體54與仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58反應(yīng)而進(jìn)行。
例如，在圖13中，伯醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯55與伯醇延長(zhǎng)單體57得到二聚物化合物65?？蛇x擇地，仲醇延長(zhǎng)單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長(zhǎng)單體54反應(yīng)得到二聚物化合物65。二聚物化合物65上的B1封端部分可以使用上述的B1解封劑除去以得到伯醇延長(zhǎng)二聚物66。伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67?？蛇x擇地，二聚物化合物65上的B2封端部分可以使用上述的B2解封劑除去以得到仲醇延長(zhǎng)二聚物69。仲醇延長(zhǎng)二聚物69可以與甲基磺酰氯反應(yīng)得到伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，鏈延長(zhǎng)過(guò)程可以重復(fù)進(jìn)行以得到不同的其它鏈長(zhǎng)度。例如如圖13所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物66可以與伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70反應(yīng)得到四聚物化合物72。如圖13進(jìn)一步所示，普通鏈延長(zhǎng)反應(yīng)路線包括伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物73與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯74反應(yīng)得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍各為0-1000，或者更優(yōu)選m和n各為0-50。雖然圖13所示的實(shí)施方案表示伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物與伯醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)，應(yīng)該理解類似的反應(yīng)可以使用仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物和仲醇延長(zhǎng)單體和/或聚合物甲磺酸酯完成。
伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物71。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，B1封端部分可以除去，而所得的封端的伯醇延長(zhǎng)三聚物可以與伯醇延長(zhǎng)單體或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)以延長(zhǎng)封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端或仲醇延長(zhǎng)單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應(yīng)得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長(zhǎng)二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應(yīng)得到封端的(capped/blocked)伯醇延長(zhǎng)三聚物68。B2封端部分可以如上述除去，而所得的封端的仲醇延長(zhǎng)三聚物可以與仲醇延長(zhǎng)鏈節(jié)甲磺酸酯反應(yīng)以延封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應(yīng)得到三聚物，應(yīng)該理解封端過(guò)程可以在均一的聚丙二醇部分的合成的任何點(diǎn)上進(jìn)行，或者可選擇地，可以得到不被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實(shí)施方案表示通過(guò)用封端單體的合成而進(jìn)行的聚丁烯寡聚體的封端，應(yīng)該理解本發(fā)明的聚丁烯寡聚體可以使用如以上圖11所述的封端劑直接封端(即不加入封端單體)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的方法與生長(zhǎng)激素藥物，親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，所述方法包括但不限于這里關(guān)于聚乙二醇部分所述的方法。
根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方案，R或R′為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親脂部分。所述親脂部分優(yōu)選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)所述親脂部分為烷基部分時(shí)，它優(yōu)選為直鏈、飽和或不飽和的具有1-28個(gè)碳原子的烷基部分。更優(yōu)選，所述烷基部分具有2-12個(gè)碳原子。當(dāng)親脂部分為脂肪酸部分時(shí)，它優(yōu)選為天然的直鏈、飽和或不飽、具有2-18個(gè)碳原子的脂肪酸部分。更優(yōu)選，所述脂肪酸部分具有3-14個(gè)碳原子。最優(yōu)選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個(gè)碳原子。
根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方案，間隔部分G、G′和G″是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的間隔部分。間隔部分優(yōu)選選自糖、膽固醇和甘油部分。優(yōu)選這些實(shí)施方案的寡聚體不包括間隔部分(即i、j和k優(yōu)選為0)。
根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方案，接頭部分L可以用于將所述的寡聚體與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物偶合。接頭部分優(yōu)選選自烷基和脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方案，所述的末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選為低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基部分。最優(yōu)選所述末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述的末端部分優(yōu)選為烷基或烷氧基部分，但應(yīng)該理解所述的末端部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方案，由式A的結(jié)構(gòu)的方括號(hào)部分表示的寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合。在某些實(shí)施方案中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合?？伤獾呐己峡梢缘玫接米髑八幍纳L(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。在某些情況下，例如在其中的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物不具有活性(即所述偶聯(lián)物缺乏通過(guò)生長(zhǎng)激素藥物的主要作用機(jī)理影響身體的能力)的情況下，可水解的偶合可以提供延時(shí)釋放或控釋效果，在一個(gè)或多個(gè)寡聚體從它們各自的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物上裂解得到活性藥物時(shí)在確定的時(shí)間內(nèi)施用生長(zhǎng)激素藥物。在其它實(shí)施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體偶合。當(dāng)期望生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物在血流中進(jìn)行長(zhǎng)期，優(yōu)選至少2小時(shí)的循環(huán)時(shí)，可以優(yōu)選使用不可水解的鍵。當(dāng)寡聚體與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合時(shí)，所述寡聚體還包含一個(gè)或多個(gè)用于將寡聚體與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合的鍵合部分。鍵合部分優(yōu)選選自共價(jià)鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。
變量p為1至生長(zhǎng)激素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。當(dāng)p大于1小時(shí)，多于一個(gè)寡聚體(即多個(gè)寡聚體)與藥物偶合。根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方案，所述的多數(shù)寡聚體相同。
所述寡聚體可以在藥物的不同的親核殘基處與生長(zhǎng)激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)。例如，親核羥基官能團(tuán)可以見(jiàn)于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團(tuán)可以見(jiàn)于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或多肽的一個(gè)或多個(gè)N-末端。當(dāng)寡聚體與一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)激素多肽的N-末端偶合時(shí)，所述的偶合優(yōu)選形成仲胺。例如當(dāng)所述的生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素時(shí)，所述的寡聚體可以與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168、和/或Lys172的氨基官能團(tuán)偶合。
生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物(其中混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu))可以由不同的方法合成。例如通過(guò)以下方法合成羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物使羧酸的混合物與聚乙二醇的混合物在足以得到寡聚體的混合物的條件下接觸。然后將所述的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長(zhǎng)激素藥物反應(yīng)得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物。
用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個(gè)實(shí)施方案如圖3所示，并如以下的實(shí)施例11-18所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物如圖4所示，并如以下的實(shí)施例19-24所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖5所示，并如以下實(shí)施例25-29所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖6所示，并如以下實(shí)施例30-31所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖7所示，并如以下實(shí)施例32-37所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖8所示，并如以下實(shí)施例38所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖9所示，并如以下實(shí)施例39所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個(gè)實(shí)施方案如圖10所示，并如以下實(shí)施例40所述。
使其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物與其中的每個(gè)藥物具有相同的分子量的生長(zhǎng)激素藥物的混合物在足以得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的條件下反應(yīng)。合成實(shí)施例如以下的實(shí)施例40-42所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以控制反應(yīng)條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使由其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物與生長(zhǎng)激素的混合物反應(yīng)得到的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物反應(yīng)得到的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物是其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的偶聯(lián)物的混合物。例如，可以通過(guò)將反應(yīng)溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制賴氨酸的氨基官能團(tuán)處的偶聯(lián)?？蛇x擇地，可以利用HPLC分離(separated和isolated)所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物，例如一、二或三偶聯(lián)物，其中混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的分離的偶聯(lián)物的偶聯(lián)程度(例如所述分離的分子為一、二或三偶聯(lián)物)，所述技術(shù)包括但不限于質(zhì)譜?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的技術(shù)測(cè)定和/或檢驗(yàn)特定的偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)(例如所述寡聚體位于人生長(zhǎng)激素一偶聯(lián)物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術(shù)包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內(nèi)肽酶切割。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，生長(zhǎng)激素藥物上的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)部位可以通過(guò)生長(zhǎng)激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應(yīng)而封端。例如可以在所述的生長(zhǎng)激素藥物為多肽并期望形成具有在肽的一個(gè)或多個(gè)N-末端的寡聚體的不飽和的偶聯(lián)物(即并非所有的親核殘基發(fā)生偶聯(lián)的偶聯(lián)物)時(shí)，優(yōu)選這種方法。在這種封端之后，封端的生長(zhǎng)激素藥物的混合物可以與其中的每個(gè)寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體結(jié)構(gòu)的活化的寡聚體的混合物反應(yīng)得到具有與一個(gè)或多個(gè)親核殘基偶合的寡聚體和具有與親核殘基偶合的封端部分的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在偶聯(lián)反應(yīng)之后，可以將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物解封。如果需要的話，隨后可以如上述分離生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物得到生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物，其中所述混合物中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)?？蛇x擇地，所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以是在解封之前分離。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，其中每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有比常規(guī)的混合物改善的性能。例如，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其體內(nèi)活性大于具有與其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體內(nèi)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARYPOLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其體外活性大于具有與其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的體外活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，特定的混合物的體外活性可以由不同的方法測(cè)定。優(yōu)選使用可從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購(gòu)得到的Cytosensort微生理機(jī)能測(cè)定儀測(cè)定體外活性。所述微生理機(jī)能測(cè)定儀監(jiān)測(cè)對(duì)被加到在Transwell中培養(yǎng)的細(xì)胞的藥物作出反應(yīng)而發(fā)生的細(xì)胞外酸化速率的細(xì)微變化。這種反應(yīng)與研究的分子的活性成比例。
作為另一個(gè)實(shí)例，在同具有與其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選對(duì)胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個(gè)實(shí)例，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選其受試者間的差異性小于具有與其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物相同的數(shù)均分子量的多分散的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的受試者間的差異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，其中的每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的數(shù)均分子量和多分散的混合物的數(shù)均分子量可以通過(guò)不同的方法測(cè)定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法測(cè)定受試者間的差異性。所述受試者間的差異性優(yōu)選如下測(cè)定。測(cè)定每名受試者的劑量反應(yīng)曲線下的面積(AUC)(即劑量反應(yīng)曲線和基線值之間的面積)。通過(guò)計(jì)算每名受試者的AUC的總數(shù)并用該總數(shù)除以受試者數(shù)量而確定所有受試者的平均AUC。然后對(duì)每名受試者測(cè)定受試者的AUC與平均AUC之間的差別的絕對(duì)值。隨后計(jì)算所得的差異的絕對(duì)值的總數(shù)得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較大的受試者間的差異性。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，其中每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物優(yōu)選具有二種或更多種上述的改善性能。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，其中每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有三種或更多種上述的改善的性能。最優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，其中每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有式A的結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物具有上述的改善的性能。
本發(fā)明還提供包含根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的偶聯(lián)物的混合物的藥物組合物。上述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物可以根據(jù)已知的技術(shù)制備用于在藥學(xué)載體中給藥。例如參見(jiàn)Remington，The Scienceand Practiceof Pharmacy(第9版，1995)。在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的藥物組合物的制備中，一般將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物與藥學(xué)上可接受的載體混合。當(dāng)然所述的載體在與藥物組合物中的任何其它成分相容的含義上是可接受的，并不應(yīng)對(duì)患者有傷害。所述的載體可以是固體或液體，或者同為固體和液體，并優(yōu)選與所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物制成單元?jiǎng)┬?，例如可能包含大約0.01或0.5wt％至大約95％或99wt％的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的片劑。所述的藥物組合物可以通過(guò)任何已知的藥學(xué)技術(shù)制備，這些藥學(xué)技術(shù)包括但不限于混合組分，所述組分任選包括一種或多種輔助成分。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的藥物組合物包括適用于以下的藥物組合物口、直腸、局部、吸入(例如通過(guò)氣溶膠)、頰(例如舌下)、陰道、腸胃外(例如皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(即皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和透皮給藥，但在任何既定的情況下的最適宜的途徑取決于所治療的癥狀的性質(zhì)與嚴(yán)重程度和所使用的特定的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的性質(zhì)。
適于口服的藥物組合物可以以下形式存在獨(dú)立的單元，如膠囊、扁囊劑、錠劑或片劑，各包含預(yù)定量的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物；散劑或顆粒劑；在水或非水液體中的溶液或懸浮液；或者水包油型或油包水型乳液。這種制劑可以通過(guò)任何適宜的藥學(xué)方法制備，所述方法包括將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物和適宜的載體(可以包含一個(gè)或多個(gè)上述的輔助成分)締合的步驟。一般地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的藥物組合物通過(guò)以下方法制備均一和緊密地混合生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物和液體或細(xì)分的固體載體，或者液體和細(xì)分的固體，然后如果需要的話將所得的混合物成形。例如，可以通過(guò)以下方法制備片劑將包含生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物和任選的一個(gè)或多個(gè)輔助成分的粉末或顆粒壓制或模制。壓制片可以通過(guò)在適宜的機(jī)器中將混合物壓制成任選混有粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性/分散劑的自由流動(dòng)形式，如散劑或顆粒。模制片可以通過(guò)在適宜的機(jī)器中模制用惰性液體粘合劑濕潤(rùn)的粉末化合物。
適于頰(舌下)給藥的藥物組合物包括含有在調(diào)味堿，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的糖錠；和包含在惰性堿如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的錠劑。
適于腸胃外給藥的根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的藥物組合物包含生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的無(wú)菌水和非水注射液，所述制劑優(yōu)選與目標(biāo)受者的血液等滲。這些制劑可以包含抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和使組合物與目標(biāo)受者的血液等滲的溶質(zhì)。水和非水無(wú)菌懸浮液可以包含懸浮劑和增稠劑。所述組合物可以存在于單元?jiǎng)┝亢投鄤┝咳萜?，例如密閉的安瓿和小瓶，并可以在僅要求使用前立即加入無(wú)菌液體載體如鹽水和注射用水的冷凍干燥的(凍干的)條件下儲(chǔ)存?？梢杂汕笆龇N類的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備臨時(shí)注射溶液和懸浮液。例如，可以得到在密閉容器中的包含生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的可注射、穩(wěn)定無(wú)菌組合物的單元?jiǎng)┬汀１景l(fā)明提供能夠與適宜的藥學(xué)上可接受的載體重組形成適于注射至受者的液體組合物的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的凍干物形式。所述的單元?jiǎng)┬鸵话惆蠹s10mg至大約10克的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。
當(dāng)所述的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物基本上不溶于水時(shí)，可以使用足量的生理學(xué)上可接受的乳化劑乳化在含水載體中的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。一種這樣的有用的乳化劑為磷脂酰膽堿。
適于直腸給藥的藥物組合物優(yōu)選作為單元?jiǎng)┝克▌┐嬖?。這些組合物可以通過(guò)以下方法制備將生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物與一種或多種常規(guī)固體載體如可可油混合，然后將所得的混合物成型。
適于皮膚局部應(yīng)用的藥物組合物優(yōu)選為藥膏、乳膏、洗液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油的形式?？梢允褂玫妮d體包括凡士林油、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增強(qiáng)劑和其二種或更多種的組合。
適于直腸給藥的藥物組合物可以作為適于與受者的表皮保持長(zhǎng)期緊密接觸的獨(dú)立的貼劑存在。適于透皮給藥的組合物還可以通過(guò)離子電滲法(例如參見(jiàn)Pharmaceutical Research 3(6)318(1986))遞送，且一般采用任選的生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的緩沖水溶液的形式。適宜的制劑包含檸檬酸鹽或二\三緩沖液(pH 6)或乙醇/水，并包含0.1-0.2M活性成分。
本發(fā)明還提供通過(guò)施用有效量的這種藥物組合物而治療需要這種治療的受試者的生長(zhǎng)激素缺乏的方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的任何生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的有效量在一定程度上將隨不同的混合物、患者而變，并取決于因素如患者的年齡和癥狀與遞送途徑。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)藥代動(dòng)力學(xué)方法確定這種劑量。作為一種一般性的建議，大約0.1至大約50mg/kg的劑量具有療效，其中所有的重量基于生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物的重量計(jì)算。較高水平時(shí)的毒性考慮可能將靜脈內(nèi)劑量限定到較低的水平，如至多大約10mg/kg，其中所述的重量基于活性堿的重量計(jì)算。大約10mg/kg至大約50mg/kg的劑量可以用于口服。一般地，大約0.5mg/kg至5mg/kg的劑量可以用于肌內(nèi)注射。給藥頻率一般為每天一、二或三次或控制癥狀所需的給藥頻率?？蛇x擇地，所述的藥物-寡聚體偶聯(lián)物可以通過(guò)連續(xù)地灌輸而施用。治療的持續(xù)時(shí)間取決于所治療的生長(zhǎng)激素缺乏的類型。
加速動(dòng)物的生長(zhǎng)速率的方法包括給動(dòng)物施用有效量的根據(jù)上述的不同的實(shí)施方案的偶聯(lián)物的混合物。當(dāng)然，生長(zhǎng)激素的有效量取決于進(jìn)行給藥的動(dòng)物，并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)確定。
本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的偶聯(lián)物的混合物的合成方法。雖然以下的合成路線實(shí)施方案涉及基本上單分散的混合物的合成，但可以使用類似的合成路線合成根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的其它生長(zhǎng)激素藥物-寡聚體偶聯(lián)物的混合物。
如反應(yīng)1所示提供基本上單分散的包含聚乙二醇部分的聚合物的混合物1(I) (II)(III)R1為H或親脂部分。R1優(yōu)選為H、烷基、芳基烷基、芳香部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯、膽甾醇基或金剛烷基。R1更優(yōu)選為H、低級(jí)烷基或芳香部分。R1為最優(yōu)選H、甲基或芐基。
在式I中，n為1-25。優(yōu)選n為1-6。
X+為陽(yáng)離子。優(yōu)選X+為化合物如強(qiáng)堿中的任何陽(yáng)離子，能夠?qū)EG上的羥基部分離子。陽(yáng)離子的實(shí)例包括但不限于鈉離子、鉀離子、鋰離子、銫離子和鉈離子。
R2為H或親脂部分。R2優(yōu)選為直鏈或支鏈烷基、芳基烷基、芳香部分、脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。R2更優(yōu)選為低級(jí)烷基、芐基、具有1-24個(gè)碳原子的脂肪酸部分或具有1-24個(gè)碳原子的脂肪酸部分的酯。R2最優(yōu)選為甲基、具有1-18個(gè)碳原子的脂肪酸部分或具有1-18個(gè)碳原子的脂肪酸部分的乙酯。
在式II中，m為1-25。優(yōu)選m為1-6。
M為甲磺酸酯部分(即CH3S(O2)-)。
如反應(yīng)1所示，具有式I的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物與具有式II的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物反應(yīng)得到包含聚乙二醇部分并具有式III的結(jié)構(gòu)的混合物。所述的具有式I的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優(yōu)選式I的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選式I的化合物的混合物為單分散的混合物。所述的式II的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優(yōu)選式II的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選式II的化合物的混合物為單分散的混合物。所述的式III的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優(yōu)選式III的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選，式III的化合物的混合物為單分散的混合物。
反應(yīng)1優(yōu)選在大約0℃至40℃下進(jìn)行，更優(yōu)選在大約15℃至大約35℃下進(jìn)行，最優(yōu)選在室溫(大約25℃)下進(jìn)行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，反應(yīng)1可以進(jìn)行不同的時(shí)間。反應(yīng)1優(yōu)選進(jìn)行大約0.25、0.5或0.75小時(shí)至大約2、4或8小時(shí)。
反應(yīng)1優(yōu)選在質(zhì)子惰性溶劑中進(jìn)行，例如所述質(zhì)子惰性溶劑包括但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、六甲基磷三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、四氫萘、十氫萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它們的混合物。更優(yōu)選所述為DMF、DMA或甲苯。
式I的化合物與式II的化合物的摩爾比優(yōu)選大于大約1∶1。更優(yōu)選所述的摩爾比為至少大約2∶1。通過(guò)提供過(guò)量的式I的化合物可以確保基本上所有式II的化合物發(fā)生反應(yīng)，從而有助于回收下述的式III的化合物。
式I的化合物優(yōu)選如反應(yīng)2所示制備能將式IV的PEG2子化的化合物(IV)(I)R1和X+如上述，且所述的式IV的化合物的混合物基本上是單分散的；優(yōu)選式IV的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量；更優(yōu)選式IV的化合物的混合物為單分散的混合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知能夠?qū)⑹絀V的化合物的PEG部分的羥基部分離子的不同的化合物。能夠?qū)⒘u基部分離子化的化合物優(yōu)選為強(qiáng)堿。更優(yōu)選能夠?qū)⒘u基離子化的化合物選自氫化鈉、氫化鉀、叔丁醇鈉、叔丁醇鉀、丁基鋰(BuLi)和二異丙基胺鋰。能夠?qū)⒘u基部分離子化的化合物更優(yōu)選為氫化鈉。
能夠?qū)⑹絀V的化合物的PEG部分上的羥基部分離子化的化合物與式IV的化合物的摩爾比優(yōu)選為至少大約1∶1，更優(yōu)選為至少大約2∶1。確信通過(guò)提供過(guò)量的能夠?qū)⒘u基部分離子化的化合物，基本上所有的式IV的化合物發(fā)生反應(yīng)得到式I的化合物。因此可以避免在式IV的化合物和式I的化合物在反應(yīng)產(chǎn)物混合物中同時(shí)存在時(shí)可能發(fā)生的分離困難。
反應(yīng)2優(yōu)選在大約0℃至大約40℃下進(jìn)行，更優(yōu)選在大約0℃至大約35℃下進(jìn)行，最優(yōu)選在大約0℃至室溫(大約25℃)下進(jìn)行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知反應(yīng)2可以進(jìn)行不同的時(shí)間。反應(yīng)2優(yōu)選進(jìn)行大約0.25、0.5或0.75小時(shí)和大約2、4或8小時(shí)的時(shí)間。
反應(yīng)2優(yōu)選在質(zhì)子惰性溶劑中完成，所述質(zhì)子惰性溶劑包括但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、六甲基磷三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、氯仿、四氫萘、十氫萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它們的混合物。更優(yōu)選所述的溶劑為DMF、二氯甲烷或甲苯。
式II的化合物優(yōu)選如反應(yīng)3所示制備 R2和Ms如上述，而式V的化合物作為基本上單分散的式V的化合物的混合物存在；優(yōu)選式V的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量；更優(yōu)選式V的化合物的混合物為單分散的混合物。
Q為鹵化物，優(yōu)選氯化物或氟化物。
CH3S(O2)Q為甲基磺酰鹵化物。所述甲基磺酰鹵化物優(yōu)選為甲基磺酰氯或甲烷磺酰基氟化物。更優(yōu)選，所述的甲基磺酰鹵化物為甲基磺酰氯。
甲基磺?；u化物與式V的化合物的摩爾比優(yōu)選大于大約1∶1，更優(yōu)選至少大約2∶1。確信通過(guò)提供過(guò)量的甲基磺?；u化物，基本上所有的式V的化合物發(fā)生反應(yīng)得到式II的化合物。因此可以避免在式V的化合物和式II的化合物在反應(yīng)產(chǎn)物混合物中同時(shí)存在時(shí)可能發(fā)生的分離困難。
反應(yīng)3優(yōu)選在大約0℃至大約40℃下進(jìn)行，更優(yōu)選在大約0℃至大約35℃下進(jìn)行，最優(yōu)選在大約0℃至室溫(大約25℃)下進(jìn)行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知反應(yīng)3可以進(jìn)行不同的時(shí)間。反應(yīng)2優(yōu)選進(jìn)行大約0.25、0.5或0.75小時(shí)和大約2、4或8小時(shí)的時(shí)間。
反應(yīng)3優(yōu)選在脂肪胺存在下完成，所述脂肪胺包括但不限于一甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、一乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、一異丙基胺、二異丙基胺、一正丁基胺、二正丁基胺、三正丁基胺、一環(huán)己基胺、二環(huán)己基胺或它們的混合物。更優(yōu)選，所述脂肪胺為叔胺如三乙基胺。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，不同的基本上單分散的式V的化合物的混合物可以商購(gòu)得到。例如，當(dāng)R2為H或甲基時(shí)，式V的化合物分別為PEG或mPEG化合物，并可以從Aldrich of Milwaukee，Wisconsin；Fluka of Switzerland和/或TC1 America of Portland，Oregon商購(gòu)得到。
當(dāng)R2為親脂部分如高級(jí)烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、膽甾醇基或金剛烷基時(shí)，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法得到式V的化合物。式V的化合物優(yōu)選如下得到4(VI) (VII) (VIII)R3(OC2H4)m-OR2→H(OC2H4)m-OR25(VIII) (V)R2為親脂部分，優(yōu)選高級(jí)烷基、脂肪酸酯、膽甾醇基或金剛烷基，更優(yōu)選脂肪酸的低級(jí)烷基酯，最優(yōu)選具有1-18個(gè)碳原子的脂肪酸的乙酯。
R3為H、芐基、三苯甲基、四氫吡喃或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它醇保護(hù)基。
X2+為以上關(guān)于X+所述的陽(yáng)離子。
m的值如上述。
關(guān)于反應(yīng)4，使式VI的化合物混合物與式VII的化合物的混合物在類似于關(guān)于反應(yīng)1所述的條件下進(jìn)行反應(yīng)。式V式VI的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優(yōu)選式VI的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選式VI的化合物的混合物為單分散的混合物。式VII的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優(yōu)選式VII的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選，式VII的化合物的混合物為單分散的混合物。
關(guān)于反應(yīng)5，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法將式VIII的化合物水解以將R3部分轉(zhuǎn)化為醇。當(dāng)R3為芐基或三苯甲基時(shí)，所述的水解優(yōu)選利用H2在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的鈀-碳催化劑存在下進(jìn)行。當(dāng)然當(dāng)R3為H時(shí)，反應(yīng)5沒(méi)有必要。
式VI的化合物可以商購(gòu)得到，或者如以上關(guān)于反應(yīng)3所述得到。式VII的化合物可以如以上關(guān)于反應(yīng)2所述得到。
基本上單分散的包含PEG部分并具有式III的結(jié)構(gòu)的聚合物的混合物還可以與其它基本上單分散的包含PEG部分的聚合物反應(yīng)以延長(zhǎng)PEG鏈。例如可以使用以下路線 7(IX) (X) (XI)Ms、m和n如以上關(guān)于反應(yīng)1所述；p與n和m類似，而X2+與如以上關(guān)于反應(yīng)1所述的X+類似。Q如以上關(guān)于反應(yīng)3所述。R2如以上關(guān)于反應(yīng)1所述，并優(yōu)選為低級(jí)烷基。R1為H。反應(yīng)6優(yōu)選以類似于關(guān)于反應(yīng)3所述的方式進(jìn)行。反應(yīng)7優(yōu)選在類似于關(guān)于反應(yīng)1所述的方式進(jìn)行。優(yōu)選式III的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選式III的化合物的混合物為單分散的混合物。式X的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優(yōu)選混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選式X的化合物的混合物為單分散的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法由圖1所示的路線表示，現(xiàn)在將其進(jìn)行詳述。含有基本上單分散的聚乙二醇的寡聚體的合成起始于基本上單分散的聚乙二醇的一芐基醚(1)的制備。使過(guò)量的可商購(gòu)得到的基本上單分散的聚乙二醇與芐基氯在如Coudert等人所述的氫氧化鈉水溶液存在下反應(yīng)(Synthetic Communications，16(1)19-26(1986))。然后通過(guò)加入NaH制備1的鈉鹽，并使此鈉鹽與由羥基鏈烷酸(2)的酯合成的甲磺酸酯反應(yīng)。通過(guò)催化氫化將甲磺酸酯的取代產(chǎn)物(3)脫芐基化以得到醇(4)。這種醇的甲磺酸酯(5)可以通過(guò)加入甲基磺氯制備，并用作與基本上單分散的聚乙二醇衍生物的一甲醚的鈉鹽進(jìn)行的反應(yīng)中的親電子試劑，從而將寡聚體的聚乙二醇部分延長(zhǎng)至目標(biāo)長(zhǎng)度，得到延長(zhǎng)的酯(6)?？梢栽趬A水溶液中將酯水解成酸(7)，并通過(guò)與碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化成活化的酯(8)。雖然使用N-羥基琥珀酰亞胺將圖1所示的寡聚體活化，但應(yīng)該理解可以用其它不同的試劑活化本發(fā)明的寡聚體，包括但不限于活性氯甲酸苯基酯如氯甲酸對(duì)硝基苯基酯、氯甲酸苯基酯、氯甲酸3，4-苯基酯、二氯甲酸苯基酯和二氯甲酸3，4-苯基酯；tresylation和縮醛形成。
進(jìn)一步參照?qǐng)D1，q為1-24。優(yōu)選q為1-18，且q更優(yōu)選為4-16。R4為能夠經(jīng)過(guò)水解得到羧酸的部分。R4優(yōu)選為低級(jí)烷基，并更優(yōu)選為乙基。變量n和m如以上關(guān)于反應(yīng)1所述。
用于這里所述的方法的所有原料可以商購(gòu)得到或可以由本技術(shù)中已知的方法使用可商購(gòu)得到的原料制備。
現(xiàn)在參照以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳述。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到這些實(shí)施例的目的在于例示本發(fā)明的方面，而不是對(duì)權(quán)利要求定義的范圍進(jìn)行限定。
實(shí)施例實(shí)施例1-10除非另外特指，實(shí)施例1-10的反應(yīng)在氮?dú)夥障率褂么艛嚢柰瓿?。“加工”意指用有機(jī)溶劑萃取，用飽和NaCl溶液洗滌有機(jī)相，干燥(MgSO4)，并蒸發(fā)(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)。用預(yù)涂布硅膠60 F-254的Merck玻璃板進(jìn)行薄層色譜處理，并用碘液將斑點(diǎn)可視化。所有的質(zhì)譜由Macromolecular Resources Colorado State University，CO測(cè)定，并以級(jí)數(shù)m/z(相對(duì)強(qiáng)度)報(bào)道。由Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN進(jìn)行元素分析和熔點(diǎn)測(cè)定。實(shí)施例1-10指圖2所示的路線。
實(shí)施例18-甲氧基-1-(甲基磺?；?氧-3，6-二氧雜辛烷(9)在冰浴上冷卻在無(wú)水二氯甲烷(50mL)中的非多分散的三乙二醇一甲基醚分子(4.00mL，4.19g，25.5mmol)和三乙基胺(4.26mL，3.09g，30.6mmol)的溶液，并將其放置在氮?dú)夥障隆奶砑勇┒返渭釉跓o(wú)水二氯甲烷(20mL)中的甲基磺酰氯(2.37mL，3.51g，30.6mmol)的溶液。在完成氯化物加入后10分鐘，從冰浴中移出反應(yīng)混合物，并使其達(dá)到室溫。將混合物再攪拌1小時(shí)，此時(shí)TLC(CHCl3和15％MeOH作為洗脫劑)表明未殘留三乙二醇一甲基醚。
用另外75mL二氯甲烷稀釋反應(yīng)混合物，并用飽和NaHCO3、水和鹽水連續(xù)洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)物，過(guò)濾并真空濃縮得到非多分散的化合物9的混合物，為一種橙清的油(5.31g，86％)。
實(shí)施例2乙二醇一甲基醚(10)(m＝4，5，6)在N2氣氛下往在無(wú)水DMF(25.7mL)中的非多分散的化合物11(35.7mmol)的攪拌溶液分部分加入在礦物油中的60％NaH的分散體，并將混合物于室溫下攪拌1小時(shí)。往此鹽12中一次性加入在無(wú)水DMF(4ml)中的非多分散的甲磺酸酯9(23.36)的溶液，并將混合物于室溫下攪拌3.5小時(shí)。通過(guò)TLC(12％CH3OH-CHCl3)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)混合物用等量的1N HCl稀釋，用乙酸乙酯(2×20ml)萃取并棄去。萃取水溶液并加工得到非多分散的聚合物10(82-84％產(chǎn)率)。
實(shí)施例33，6，9，12，15，18，21-七氧雜二十二醇(10)(m＝4)油；Rf0.46(甲醇∶氯仿＝3∶22)；MS m/z計(jì)算值C15H32O8340.21(M++1)，實(shí)測(cè)值341.2。
實(shí)施例43，6，9，12，15，18，21，24-八氧雜二十五醇(10)(m＝5)油；Rf0.43(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計(jì)算值C17H36O9384.24(M++1)，實(shí)測(cè)值385.3。
實(shí)施例53，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧雜二十八醇(10)(m＝6)油；Rf0.42(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計(jì)算值C19H40O10428.26(M++1)，實(shí)測(cè)值429.3。
實(shí)施例620-甲氧基-1-(甲基磺?；?氧-3，6，9，12，15，18-六氧雜二十烷(14)由醇13(m＝4)和關(guān)于9所述的甲基磺酰氯以定量產(chǎn)率得到非多分散的化合物14，為一種油；Rf0.4(乙酸乙酯∶乙腈＝1∶5)；MS m/z計(jì)算值C17H37O10433.21(M++1)，實(shí)測(cè)值433.469。
實(shí)施例7乙二醇一甲基醚(15)(m＝3，4，5)使用以上關(guān)于化合物10所述的方法由二醇制備非多分散的化合15。
實(shí)施例83，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧雜二十一醇(15)(m＝3)油；Rf0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計(jì)算值C21H44O11472.29(M++1)，實(shí)測(cè)值472.29。
實(shí)施例93，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧雜四二十三烷醇(15)(m＝4)油；Rf0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計(jì)算值C23H48O12516.31(M++1)，實(shí)測(cè)值516.31。
實(shí)施例103，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十二氧雜七二十三烷醇(15)(m＝5)油；Rf0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計(jì)算值C25H52O13560.67(M++1)，實(shí)測(cè)值560.67。
實(shí)施例11-18指圖3所示的路線。
實(shí)施例11六乙二醇一芐基醚(16)將通過(guò)把3.99g(100mmol)NaOH溶于水而制備的氫氧化鈉水溶液緩慢加到非多分散的六乙二醇(28.175g，25mL，100mmol)。加入芐基氯(3.9g，30.8mmol，3.54ml)，并將反應(yīng)混合物攪拌在100℃下加熱18小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻，用鹽水(250ml)稀釋，并用二氯甲烷(200ml×2)萃取。用鹽水將合并的有機(jī)層洗滌一次，用Na2SO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮到一種深褐色的油。通過(guò)快速色譜法(硅膠，梯度洗脫乙酸乙酯至9/1乙酸乙酯/甲醇)純化粗產(chǎn)物混合物得到8.099g(70％)非多分散的16，為一種黃色的油。
實(shí)施例126-甲基磺酰氧基己酸乙酯(17)在冰浴中冷卻在無(wú)水二氯甲烷(75ml)中的非多分散的6-羥基己酸乙酯(50.76mL，50.41g，227mmol)的溶液，并將其置于氮?dú)夥障隆＜尤肴一?34.43mL，24.99g，247mmol)。由添加漏斗滴加在無(wú)水二氯甲烷(75ml)中的甲基磺酰氯(19.15mL，28.3g，247mmol)的溶液。將混合物攪拌3.5小時(shí)，并使其在冰浴熔化時(shí)緩慢地到達(dá)室溫。用硅膠過(guò)濾混合物，連續(xù)地用水、飽和NaHCO3、水和鹽水冼滌濾液。用Na2SO4干燥有機(jī)物，過(guò)濾并真空濃縮至一種淺黃色的油。最后通過(guò)快速色譜法(硅膠，1/1己烷/乙酸乙酯)純化粗產(chǎn)物得到非多分散的產(chǎn)物(46.13g，85％)，為一種澄清的無(wú)色油。FAB MSm/z239(M+H)，193(M-C2H5O)。
實(shí)施例136-12-[2-(2-12-[2-(2-芐氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(18)將氫化鈉(3.225g或60％油懸浮液，80.6mmol)懸浮在80ml無(wú)水甲苯，放置在氮?dú)夥障虏⒃诒≈欣鋮s。將在80ml無(wú)水甲苯中的非多分散的醇16(27.3g，73.3mmol)的溶液加到NaH懸浮液。將混合物于0℃下攪拌30分鐘，使其冷卻至室溫，并再攪拌5小時(shí)，在此期望混合物變?yōu)槌吻宓暮稚芤?。將?0ml無(wú)水甲苯中的非多分散的甲磺酸酯17(19.21g，80.6mmol)加到NaH/醇混合物，并將合并的溶液于室溫下攪拌3天。用50ml甲醇終止反應(yīng)混合物的反應(yīng)，用堿性氧化鋁過(guò)濾。將濾液真空濃縮，并用快速色譜法(硅膠，梯度洗脫3/1乙酸乙酯/己烷至乙酸乙酯)純化得到非多分散的產(chǎn)物，為一種淺黃色油(16.52g，44％)。FAB MSm/e 515(M+H)。
實(shí)施例146-{2-[2-(2-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(19)將非多分散的芐基醚18(1.03g，2.0mmol)溶于25ml乙醇。往此溶液加入270mg 10％Pd/C，將混合物置于氫氣氛下并攪拌4小時(shí)，此時(shí)TLC表明原料完全消失。用C鹽545過(guò)濾反應(yīng)混合物以除去催化劑，并將濾液真空濃縮得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(0.67g，79％)。FAB MSm/e 425(M+H)，447(M+Na)。
實(shí)施例156-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲基磺酰基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(20)將非多分散的醇19(0.835g，1.97mmol)溶于3.5ml無(wú)水二氯甲烷并將其放置在氮?dú)夥障?。加入三乙基?0.301mL，0.219g，2.16mmol)，并在冰浴中冷凍混合物。2分鐘后，加入甲烷磺酰氯(0.16mL，0.248g，2.16mmol)。將混合物于0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌2小時(shí)。用硅膠過(guò)濾反應(yīng)混合物以除去三乙基氯化銨，并連續(xù)地用水、飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌濾液。用Na2SO4干燥有機(jī)物，過(guò)濾并真空濃縮。用柱色譜法(硅膠，9/1乙酸乙酯/甲醇)純化殘余物得到非多分散的化合物，為一種澄清的油(0.819g，83％)。FAB MSm/e 503(M+H)。
實(shí)施例166-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸乙酯(21)在N2氣氛下將NaH(88mg 60％在油中懸浮液，2.2mmol)懸浮在無(wú)水甲苯(3ml)中，并冷卻至0℃。加入已通過(guò)與甲苯共沸蒸餾而干燥的非多分散的二乙二醇一甲基醚(0.26mL，0.26g，2.2mmol)。將反應(yīng)混合物緩慢加熱至室溫，并攪拌4小時(shí)，在此期間混濁的灰色懸浮液變?yōu)槌吻宓狞S色，然后變成褐色。加入在2.5ml無(wú)水甲苯中的甲磺酸酯20(0.50g，1.0mmol)。
室溫下攪拌過(guò)夜后，加入2ml甲醇終止反應(yīng)，用硅膠過(guò)濾所得的溶液。將濾液真空濃縮，F(xiàn)AB MSm/e 499(M+H)，521(M+Na)。再通過(guò)制備色譜法(硅膠，19/3氯仿/甲醇)進(jìn)行純化得到非多分散的產(chǎn)物，為一種澄清的黃色油(0.302g 57％)。FAB MSm/z 527(M+H)，549(M+Na)。
實(shí)施例176-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸(22)將非多分散的酯21(0.25g，0.46mmol)在0.71ml 1N NaOH中攪拌18小時(shí)。18小時(shí)后，將混合物真空濃縮以除去醇，并將殘余物溶于另10ml水。用2N HCl將水溶液酸化至pH 2，并將產(chǎn)物萃取至二氯甲烷(30ml×2)。然后用鹽水(25ml×2)洗滌合并的有機(jī)物，用Na2SO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種黃色的油(0.147g，62％)。FAB MSm/z 499(M+H)，521(M+Na)。
實(shí)施例186-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(23)
將非多分散的酸22(0.209g，0.42mmol)溶于4ml無(wú)水二氯甲烷，并在N2氣氛下將其加到包含NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)(57.8mg，0.502mmol)和EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽)(98.0mg，0.502mmol)的無(wú)水燒瓶。將溶液于室溫下攪拌過(guò)夜，用硅膠過(guò)濾以除去過(guò)量的試劑，并在EDC中形成脲。將濾液真空濃縮得到非多分散的產(chǎn)物，為一種深黃色油(O.235g，94％)。FAB MSm/e 596(M+H)，618(M+Na)。
實(shí)施例19-24指圖4所示的路線。
實(shí)施例19三乙二醇一甲基醚的甲磺酸酯(24)往在冰浴中冷卻至0℃的CH2Cl2(100mL)的溶液加入非多分散的三乙二醇一甲基醚(25g，0.15mol)。然后加入三乙基胺(29.5mL，0.22mol)，并將溶液在0℃下攪拌15分鐘，隨后滴加甲基磺酰氯(13.8mL，0.18mol，溶于20mLCH2Cl2)。將反應(yīng)混合物于0℃下攪拌30分鐘，將其加熱至室溫，然后攪拌2小時(shí)。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)過(guò)濾粗反應(yīng)混合物，然后用H2O(300mL)、5％NaHCO3(300mL)、H2O(300mL)、飽和NaCl(300mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干。然后將油于真空管中放置2小時(shí)以確保干燥，并得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種黃色的油(29.15g，80％產(chǎn)率)。
實(shí)施例20七乙二醇一甲基醚(25)往在THF(1L)中的非多分散的四乙二醇(51.5g，0.27mol)的溶液加入叔丁醇鉀(14.8g，0.13mol，少部分～30分鐘)。然后將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)，隨后滴加溶于THF(90mL)的24(29.15g，0.12mol)，并將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)過(guò)濾粗反應(yīng)混合物并蒸發(fā)至干。然后將油溶于HCl(250mL，1N)，并用乙酸乙酯(250mL)洗滌以除去過(guò)量的24?？赡苄枰郊拥囊宜嵋阴?125mL)洗滌以除去殘余的24。重復(fù)地用CH2Cl2(125mL體積)洗滌含水相直至已從含水相中除去大部分的25。第一萃取物包含24、25和雙偶合的副產(chǎn)物，并應(yīng)該用HCl(125mL，1N)反萃取。合并有機(jī)層，并蒸發(fā)至干。然后將所得的油溶于CH2Cl2(100mL)，并重復(fù)地用H2O(50mL體積)洗滌直至除去25。合并含水餾分，總體積500mL，并加入NaCl直至溶液變混濁，然后用CH2Cl2(2×500mL)洗滌。合并有機(jī)層，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種油(16.9g，41％產(chǎn)率)。期望重復(fù)純化方法中的一個(gè)或多個(gè)步驟以確保高純度。
實(shí)施例218-溴辛酸酯(26)往在乙醇(100mL)中的8-溴辛酸(5.0g，22mmol)的溶液加入H2SO4(0.36mL，7.5mmol)，將反應(yīng)物加熱回流，并攪拌3小時(shí)。將粗反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并用H2O(100mL)、飽和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、無(wú)水MgSO4洗滌，并蒸發(fā)至干得到一種澄清的油(5.5g，98％產(chǎn)率)。
實(shí)施例22合成MPEG7-C8酯(27)往在醚(90mL)中的非多分散的化合物25(3.0g，8.8mmol)的溶液加入叔丁醇鉀(1.2g，9.6mmol)，并將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。然后滴加溶于醚(10mL)的非多分散的化合物26(2.4g，9.6mmol)，并將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)將粗反應(yīng)混合物過(guò)濾并蒸發(fā)至干。將所得的油溶于乙酸乙酯并用H2O(2×200mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干。進(jìn)行柱色譜處理(硅膠，乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，并得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(0.843g，19％產(chǎn)率)。
實(shí)施例23MPEG7-C8酸(28)往非多分散的化合物27(0.70g，1.4mmol)的油中加入1N NaOH(2.0mL)，并將反應(yīng)混合物攪拌4小時(shí)。將粗反應(yīng)混合物濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和并用CH2Cl2(2×50mL)洗滌。合并有機(jī)層，用飽和NaCl洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(0.35g，53％產(chǎn)率)。
實(shí)施例24活化MPEG7-C8酸(29)將非多分散的mPEG7-C8-酸28(0.31g，0.64mmol)溶于3ml無(wú)水二氯甲烷，然后加入在無(wú)水二氯甲烷中的N-羥基琥珀酰亞胺(0.079g，0.69mmol)和EDCI-HCl(135.6mg，0.71mmol)的溶液。將反應(yīng)物攪拌數(shù)小時(shí)，然后用1N HCl、水洗滌，用MgSO4干燥，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)柱色譜法純化粗產(chǎn)物，濃縮得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油，并真空干燥。
實(shí)施例25-29指圖5所示的路線。
實(shí)施例2510-羥基癸酸酯(30)往在乙醇(100mL)中的非多分散的10-羥基癸酸(5.0g，26.5mmol)的溶液加入H2SO4(0.43mL，8.8mmol)，將反應(yīng)物加熱回流并攪拌3小時(shí)。將粗反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并用H2O(100mL)、飽和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(6.9g，98％產(chǎn)率)。
實(shí)施例2610-羥基癸酸酯的甲磺酸酯(31)往CH2Cl2的溶液(27mL)加入非多分散的10-羥基癸酸酯30(5.6g，26mmol)，并在冰浴中冷卻至0℃。然后加入三乙基胺(5mL，37mmol)，并將反應(yīng)混合物于0℃下攪拌15分鐘。然后加入溶于CH2Cl2(3mL)的甲基磺酰氯(2.7mL，24mmol)，并將混合物于0℃下攪拌30分鐘，除去冰浴，并將反應(yīng)物于室溫下再攪拌2小時(shí)。用C鹽(用CH2Cl2，80mL洗滌)過(guò)濾粗反應(yīng)混合物，并用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、飽和NaCl(100mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種微黃色的油(7.42g，97％產(chǎn)率)。
實(shí)施例27MPEG7-C10酯(32)
往在四氫呋喃(100mL)中的非多分散的七乙二醇一甲基醚25(2.5g，7.3mmol)的溶液加入氫化鈉(0.194g，8.1mmol)，并將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。滴加溶于四氫呋喃(10mL)的非多分散的10-羥基癸酸酯31(2.4g，8.1mmol)的甲磺酸酯，并將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)過(guò)濾反應(yīng)混合物，并蒸發(fā)至干。將得到的油溶于乙酸乙酯，并用H2O(2×200mL)洗滌，用MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，色譜處理(硅膠，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，色譜處理(硅膠，乙酸乙酯)得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(0.570g，15％產(chǎn)率)。
實(shí)施例28MPEG7-C10酸(33)往非多分散的mPEG7-C10酯32(0.570g，1.1mmol)的油中加入1NNaOH(1.6mL)，并將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。將粗反應(yīng)混合物濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和，并用CH2Cl2(2×50mL)洗滌。合并有機(jī)層，用飽和NaCl(2×50mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(0.340g，62％產(chǎn)率)。
實(shí)施例29活化MPEG7-C10酸(34)使用類似于以上在實(shí)施例24中所述的方法將非多分散的酸33活化。
實(shí)施例30和31指圖6所示的路線。
實(shí)施例30合成C18(PEG6)寡聚體(36)將非多分散的硬脂酰氯35(0.7g，2.31mmol)緩慢加到在苯中的PEG6(5g，17.7mmol)和吡啶(0.97g，12.4mmol)的混合物。將反應(yīng)混合物攪拌數(shù)小時(shí)(～5)。反應(yīng)后使用乙酸乙酯/甲醇作為顯色溶劑進(jìn)行TLC處理。然后用水洗滌反應(yīng)混合物，用MgSO4干燥，濃縮并真空干燥。通過(guò)FABMS分析純化的非多分散的化合物36m/e 549/M+H。
實(shí)施例31活化C18(PEG6)寡聚體在以下兩步中完成非多散的C18(PEG6)寡聚體的活化1)將非多分散的硬脂?；?PEG6 36(0.8g，1.46mmol)溶于甲苯，并將其加到光氣溶液(10mL，20％，在甲苯中)，用冰浴進(jìn)行冷卻。將反應(yīng)混合物于0℃下攪拌1小時(shí)，然后于室溫下攪拌3小時(shí)。隨后蒸餾掉光氣和甲苯，并用P2O5將殘余的非多分散的硬脂?；鵓EG6氯甲酸酯37干燥過(guò)夜。
2)往在無(wú)水二氯甲烷中的非多分散的硬脂?；鵓EG6氯甲酸酯36(0.78g，1.27mmol)和TEA(128mg，1.27mmol)的溶液加入在二氯甲烷中的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)，然后用水洗滌，用MgSO4干燥，過(guò)濾，濃縮并真空干燥得到非多分散的活化的C18(PEG6)寡聚體38。
實(shí)施例32-37指圖7所示的路線。
實(shí)施例32四乙二醇一芐基醚(39)往非多分散的四乙二醇(19.4g，0.10mol)的油加入NaOH溶液(4.0g，在4.0mL中)，并將反應(yīng)物攪拌15分鐘。然后加入芐基氯(3.54mL，30.8mmol)，并將反應(yīng)混合物加熱至100℃，并攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用飽和NaCl(250mL)稀釋，并用CH2Cl2(2×200mL)洗滌。合并有機(jī)層，用飽和NaCl洗滌，用MgSO4干燥，并進(jìn)行色譜處理(硅膠，乙酸乙酯)得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種黃色的油(6.21g，71％產(chǎn)率)。
實(shí)施例33四乙二醇一芐基醚的甲磺酸酯(40)往CH2Cl2的溶液(20mL)加入非多分散的四乙二醇一芐基醚39(6.21g，22mmol)，并在冰浴中冷卻至0℃。然后加入三乙基胺(3.2mL，24mmol)，并將反應(yīng)混合物于0℃下攪拌15分鐘。然后加入溶于CH2Cl2(2mL)的甲基磺酰氯(1.7mL，24mmol)，并將反應(yīng)混合物于0℃下攪拌30分鐘，除去冰浴，并將反應(yīng)物于室溫下再攪拌2小時(shí)。用C鹽(用CH2Cl2，80mL洗滌)過(guò)濾粗反應(yīng)混合物，用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、飽和NaCl(100mL)洗滌濾液，并用MgSO4干燥。用含有活性碳(10g)的襯墊色譜處理所得的黃色的油得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(7.10g，89％產(chǎn)率)。
實(shí)施例34八乙二醇一芐基醚(41)往含有氫化鈉(0.43g，18mmol)的四氫呋喃(140mL)的溶液滴加在四氫呋喃(10mL)中的非多分散的四乙二醇(3.5g，18mmol)的溶液，并將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。然后滴加溶于四氫呋喃(10mL)的非多分散的四乙二醇一芐基醚的甲磺酸酯40(6.0g，16.5mmol)，將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。用C鹽(用CH2Cl2，250mL洗滌)過(guò)濾粗反應(yīng)混合物，用C鹽(用CH2Cl2，250mL洗滌)過(guò)濾粗反應(yīng)產(chǎn)物，并用H2O洗滌濾液，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干。對(duì)所得的油進(jìn)行色譜處理(硅膠，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)和色譜處理(硅膠，氯仿/甲醇，25∶1)得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的油(2.62g，34％產(chǎn)率)。
實(shí)施例35合成硬脂酸酯PEG8-芐基(43)往非多分散的八乙二醇一芐基醚41(0.998g，2.07mmol)和吡啶(163.9mg，2.07mmol)的攪拌和冷卻的溶液中加入在苯中的非多分散的硬脂酰氯42(627.7mg，2.07mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜(18小時(shí))。第二天用水洗滌反應(yīng)混合物，用MgSO4干燥，濃縮并真空干燥。然后用快速硅膠柱色譜處理粗產(chǎn)物，使用10％甲醇/90％氯仿為洗脫劑。合并含有產(chǎn)物的餾分，濃縮并真空干燥得到非多分散的標(biāo)題化合物。
實(shí)施例36硬脂酸酯-PEG8-芐基的水解往非多分散的硬脂酸酯-PEG8-Bzl43(0.854g，1.138mmol)的甲醇溶液加入Pd/C(10％)(鈀，10％wt，擔(dān)載在活性碳上)。將反應(yīng)混合物在氫氣氛下攪拌過(guò)夜(18小時(shí))。然后將溶液過(guò)濾，濃縮并通過(guò)快速柱色譜法使用10％甲醇/90％氯仿進(jìn)行純化，收集Rf＝0.6的餾分，濃縮并干燥得以非多分散的酸44。
實(shí)施例37活化C18(PEG8)寡聚體如關(guān)于以上實(shí)施例31中的硬脂酸酯-PEG6所述對(duì)非多分散的硬脂酸酯-PEG8寡聚體進(jìn)行兩步活化得到非多分散的活化的C18(PEG8)寡聚體45。
實(shí)施例38合成活化的三乙二醇一甲基寡聚體以下的描述指圖8所示的路線。在N2氣氛下將含有20％的光氣(100mL，大約18.7g，189mmol光氣)的甲苯溶液冷卻至0℃。將非多分散的mTEG(三乙二醇，一甲基醚，7.8g，47.5mmol)溶于25mL無(wú)水乙酸乙酯，并將其加到冷卻的光氣溶液。將混合物于0℃下攪拌1小時(shí)，然后將其加熱至室溫，并再攪拌2.5小時(shí)。通過(guò)真空蒸餾法除去殘余的光氣、乙酸乙酯和甲苯，以留下非多分散的mTEG氯甲酸酯46，為一種澄清的油殘余物。
將非多分散的殘余物46溶于加入TEA(三乙基胺，6.62mL，47.5mmol)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，5.8g，50.4mmol)的50mL無(wú)水二氯甲烷。將混合物于室溫和無(wú)水氣壓下攪拌20小時(shí)，在此期間出現(xiàn)大量白色沉淀。將混合物過(guò)濾除去沉淀，并真空濃縮。在二氯甲烷中加工所得的油47，并用冷的去離子洗滌二次，用1N HCl洗滌二次，并用鹽水洗滌一次。用MgSO4干燥有機(jī)物，過(guò)濾并濃縮得到非多分散的標(biāo)題化合物，為一種澄清的淺黃色油。如果需要的話，還可以通過(guò)快速硅膠色譜法，使用EtOAc作為洗脫劑純化NHS酯。
實(shí)施例39合成活化的棕櫚酸酯-TEG寡聚體以下的描述指圖9所示的路線。將非多分散的棕櫚酸酐(5g；10mmol)溶于無(wú)水THF(20mL)，并在室溫下攪拌。往攪拌的溶液加入3mol過(guò)量的吡啶，然后加入非多分散的三乙二醇(1.4mL)。將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)(用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行；乙酸乙酯-氯仿；3∶7)。
在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，除去THF，將產(chǎn)物與10％H2SO4酸混合，并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。連續(xù)地用水、鹽水洗滌合并的萃取物，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)得到非多分散的產(chǎn)物48。
將在DMF(～10mL)中的N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(3mmol)的溶液加到在10mL無(wú)水DMF中的非多分散的產(chǎn)物48(1mmol)的溶液，同時(shí)進(jìn)行攪拌。將氫化鈉(3mmol)緩慢地加到反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物攪拌數(shù)小時(shí)(例如5小時(shí))。加入二乙醚以沉淀活化的寡聚體。此過(guò)程重復(fù)3次，并在最后干燥產(chǎn)物。
實(shí)施例40用活化的六乙二醇一甲基寡聚體合成人生長(zhǎng)激素-寡聚體偶聯(lián)物以下的描述指圖10所示的路線。與以上實(shí)施例38中的非多分散的三乙二醇類似地制備非多分散的活化的六乙二醇一甲基醚。在N2氣氛下和在冰/鹽水浴中冷卻在甲苯中的20％光氣的溶液(35mL，6.66g，67.4mmol光氣)。將非多分散的六乙二醇50(1.85mL，2.0g，6.74mmol)溶于5mL無(wú)水EtOAc，并通過(guò)注射器加到光氣溶液。將反應(yīng)混合物在冰浴中保持?jǐn)嚢?小時(shí)，移出并再在室溫下攪拌2.5小時(shí)。通過(guò)真空蒸餾除去光氣、EtOAc和甲苯，余下非多分散的化合物51，為一種澄清的油殘余物。
將非多分散的殘余物51溶于20mL無(wú)水二氯甲烷，并放置在無(wú)水惰性氣氛下。加入三乙基胺(0.94mL，0.68g，6.7mmol)，然后加入NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，0.82g，7.1mmol)，并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。用硅膠將混合物過(guò)濾以除去白色沉淀物，并真空濃縮。將殘余物回收于二氯甲烷，用冷水洗滌二次，用1N HCl洗滌一次并用鹽水洗滌一次。有機(jī)物用Na2SO4干燥，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)快速色譜法(硅膠，EtOAc)完成最終的純化得到UV活性非多分散的NHS酯52。
將根據(jù)購(gòu)自Serono of Randolph，Massachusetts的商品名為SaizenTM的人生長(zhǎng)激素(生長(zhǎng)激素(rDNA來(lái)源)用于注射)溶于DMSO，以使hGH濃度為0.58mmol。加入TEA(278當(dāng)量)并將溶液攪拌大約10分鐘。加入2當(dāng)量、5當(dāng)量或30當(dāng)量來(lái)自在無(wú)水THF中的0.2M活化的寡聚體的溶液的非多分散的活化的六乙二醇52。將反應(yīng)物于室溫下攪拌45分鐘至1小時(shí)。用在600μl 0.1％在水中的TFA終止各反應(yīng)混合物的等分試樣的反應(yīng)。在圖14中顯示2個(gè)聚合物當(dāng)量和5個(gè)聚合物當(dāng)量的反應(yīng)混合物與未偶聯(lián)的hGH的HPLC的比較。圖15顯示30個(gè)聚合物當(dāng)量反應(yīng)的HPLC分析。
通過(guò)分析HPLC，采用反相C18柱和水/乙腈梯度純化進(jìn)行質(zhì)譜分析的偶聯(lián)物的樣品。收集來(lái)自2當(dāng)量反應(yīng)混合物的全部峰，濃縮并用MALDI質(zhì)譜分析。這種材料的質(zhì)譜表明一偶聯(lián)、二偶聯(lián)、三偶聯(lián)和四偶聯(lián)的hGH和某些殘余的未反應(yīng)的hGH的質(zhì)譜(圖16)。如圖17所示，根據(jù)極性初步純化5當(dāng)量的反應(yīng)混合物。濃縮的餾分的MALDI質(zhì)譜(圖18、圖19和圖20)表明蛋白質(zhì)的偶聯(lián)水平隨保留時(shí)間而增大。餾分E的電噴霧質(zhì)譜，圖21得到的結(jié)果與六偶聯(lián)的hGH的存在相符。收集來(lái)自30個(gè)聚合物當(dāng)量的反應(yīng)混合物的全部峰并濃縮。電噴霧質(zhì)譜色析，圖22顯示十或更高偶聯(lián)的物質(zhì)。
類似的方法用于將hGH與實(shí)施例18、24、29、31或37的活化的寡聚體偶聯(lián)。
實(shí)施例41用活化的棕櫚酸酯-TEG寡聚體合成人生長(zhǎng)激素-寡聚體偶聯(lián)物使用來(lái)自實(shí)施例39的活化的聚合物進(jìn)行類似于以上在實(shí)施例41中所述的方法。通過(guò)HPLC檢查偶聯(lián)的進(jìn)行，將20μL偶聯(lián)反應(yīng)混合物置于小瓶，并用100μL的0.1％ TFA-水-IPA(1∶1)稀釋。結(jié)果如圖23所示。2小時(shí)后，通過(guò)加入0.1％TFA-水而終止反應(yīng)。通過(guò)制備HPLC純化偶聯(lián)產(chǎn)物。
實(shí)施例42用活化的TEG寡聚體合成人生長(zhǎng)激素-寡聚體偶聯(lián)物將1當(dāng)量購(gòu)自Serono of Randolph，Massachusetts的商品名為SaizenTM的人生長(zhǎng)激素(hGH)(生長(zhǎng)激素(rDNA origin)，用于注射)溶于DMSO(1mg/125μL)，并在室溫下攪拌2-4分鐘。加入2當(dāng)量的TEA，然后加入2當(dāng)量的溶于THF的實(shí)施例39的活化的寡聚體。2小時(shí)后，通過(guò)加入0.1％TFA-水終止反應(yīng)。通過(guò)圖24所示的制備HHPLC純化偶聯(lián)產(chǎn)物。
用5當(dāng)量的TEA和5當(dāng)量的實(shí)施例39的活化的寡聚體進(jìn)行類似的操作。如圖25所示通過(guò)制備HPLC法，使用C18柱純化偶聯(lián)產(chǎn)物。流動(dòng)相和洗脫時(shí)間如下
將收集的餾分凍干成白色粉末。該化合物的質(zhì)譜如圖26和27所示。
使用9當(dāng)量的TEA和9當(dāng)量的實(shí)施例39的活化的寡聚體行類似的操作。如圖28所示，通過(guò)制備HPLC法，使用C18柱純化偶聯(lián)產(chǎn)物。
實(shí)施例43測(cè)定人生長(zhǎng)激素的混合物-寡聚體偶聯(lián)物的分散系數(shù)如下測(cè)定人生長(zhǎng)激素的混合物-寡聚體偶聯(lián)物的分散系數(shù)。例如，如以上實(shí)施例40所述，提供人生長(zhǎng)激素的混合物-寡聚體偶聯(lián)物。通過(guò)HPLC純化第一混合物樣品以分離(separate和isolate)樣品中的不同的人生長(zhǎng)激素寡聚體偶聯(lián)物。假定每種分離的餾分包含完全單分散的偶聯(lián)物的混合物，則“n”等于收集的餾分?jǐn)?shù)。所述混合物可以包括一種或多種偶聯(lián)物，包括一、二、三、四、五、六、七、八和/或九偶聯(lián)物。每種分離的混合物的餾分通過(guò)質(zhì)譜法分析測(cè)定餾分的質(zhì)量，從而根據(jù)偶聯(lián)的程度將每種分離的餾分分類，并得到樣品中的每個(gè)偶聯(lián)物的變量“Mw”的值。
第二混合物樣品通過(guò)HPLC法分析得到HPLC跡線。假定偶聯(lián)并沒(méi)導(dǎo)致摩爾吸光度的改變，則由對(duì)應(yīng)于特定偶聯(lián)物的HPLC的峰之下的面積得到混合物中特定偶聯(lián)物的重量百分?jǐn)?shù)，為HPLC跡線的所有峰之下的總面積的百分?jǐn)?shù)。收集樣品并凍干以確定樣品的無(wú)水克重量。將樣品的克重量乘以樣品每個(gè)組分的重量百分?jǐn)?shù)來(lái)確定樣品中每個(gè)偶聯(lián)物的克重量。通過(guò)以下方法確定特定偶聯(lián)物(ith偶聯(lián)物)的變量“Ni”將樣品中特定偶聯(lián)物的克重量除去特定偶聯(lián)物的質(zhì)量并將此商值乘以Avagadro數(shù)(6.02205×1023mole-1)，以上確定的Mi，得到樣品中特定的偶聯(lián)物的分子數(shù)量，Ni。然后利用驛每個(gè)偶聯(lián)物所測(cè)得的n、Mi和對(duì)每個(gè)偶聯(lián)物所測(cè)得的Ni計(jì)算分散系數(shù)。
實(shí)施例44如下進(jìn)行試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)如前述，在293細(xì)胞(人腎胚胎細(xì)胞系)中產(chǎn)物表達(dá)全長(zhǎng)人GHR的穩(wěn)定的克隆，指定為293GHR。
轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)用所報(bào)道的包含融合到最小的TK啟動(dòng)子上的Stat5結(jié)合元件(LHRE)和螢蟲(chóng)素酶的構(gòu)建體在293 GHR細(xì)胞中進(jìn)行這些試驗(yàn)。將β-半乳糖苷酶表達(dá)載體作為轉(zhuǎn)染對(duì)照進(jìn)行共同轉(zhuǎn)染，并校正螢蟲(chóng)素酶的β-半乳糖苷酶活性值。在轉(zhuǎn)染后16小時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)染至不含血清的培養(yǎng)基，并用GH或激動(dòng)劑處理6小時(shí)。螢蟲(chóng)素酶活性報(bào)道為在特定的實(shí)驗(yàn)中由GH的允許在重復(fù)的實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行比較的最大活性的百分?jǐn)?shù)。由GH刺激的最大活性是GH刺激的倍數(shù)誘導(dǎo)，即將校對(duì)的細(xì)胞刺激的GH的螢蟲(chóng)素酶值除以校對(duì)的未刺激的細(xì)胞的螢蟲(chóng)素酶值。試驗(yàn)的結(jié)果如圖29和30所示，其中Genotropin為人生長(zhǎng)激素(標(biāo)準(zhǔn)品，不是本發(fā)明的部分)，GH-002為2當(dāng)量mTEG偶聯(lián)物，GH-003為5當(dāng)量mTEG偶聯(lián)物，GH-004為5當(dāng)量mTEG偶聯(lián)物，Prot hGH為人生長(zhǎng)激素(標(biāo)準(zhǔn)品，不是本發(fā)明的部分)，而hGH-TEG為9當(dāng)量mTEG偶聯(lián)物。
在本說(shuō)明書(shū)中已公開(kāi)了本發(fā)明的典型的優(yōu)選實(shí)施方案。雖然使用了具體的術(shù)語(yǔ)，但它們僅在一般和描述的含義上使用，且其目的不在于限定以下權(quán)利要求所述的本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種偶聯(lián)物的混合物，所述每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，該混合物具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約14道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約11道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的混合物，其中所述聚丙二醇是均一的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的混合物，其中所述寡聚體與人生長(zhǎng)激素的氨基官能團(tuán)共價(jià)偶合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的混合物，其中所述氨基官能團(tuán)為選自以下的人生長(zhǎng)激素的氨基酸殘基Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和Lys172。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的混合物，其中所述偶聯(lián)物包含多數(shù)寡聚體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的混合物，其中所述聚丙二醇部分為均一的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡聚體由均一的聚丙二醇部分組成，且其中所述偶聯(lián)物各自是兩親平衡的，因而每個(gè)偶聯(lián)物溶于水并能夠穿透生物膜。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體共價(jià)偶合。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的混合物，其中所述生長(zhǎng)激素藥物與寡聚體通過(guò)可水解的鍵共價(jià)偶合。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述生長(zhǎng)激素藥物與聚亞烷基二醇部分共價(jià)偶合。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的混合物，其中所述寡聚體還包含與聚亞烷基二醇部分共價(jià)偶合的親脂部分。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡聚體還包含親脂部分。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的混合物，其中所述生長(zhǎng)激素藥物與親脂部分共價(jià)偶合。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述偶聯(lián)物包含多數(shù)寡聚體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的混合物，其中所述多數(shù)寡聚體中的每一個(gè)寡聚體相同。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述寡聚體包含通過(guò)不可水解的鍵與生長(zhǎng)激素藥物共價(jià)偶合的第一聚亞烷基二醇部分和通過(guò)可水解的鍵與第一聚亞烷基二醇部分共價(jià)偶合的第二聚亞烷基二醇部分。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的混合物，其中所述寡聚體還包含與第二聚亞烷基二醇部分共價(jià)偶合的親脂部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中所述偶聯(lián)物各自為兩親平衡的，因而每個(gè)偶聯(lián)物溶于水并能夠穿透生物膜。
27.一種藥物組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1的混合物；和藥學(xué)上可接受的載體。
28.一種治療需要這種治療的受試者的生長(zhǎng)激素缺乏的方法，該包括給患者施用有效量的偶聯(lián)物的混合物以治療生長(zhǎng)激素缺乏，該偶聯(lián)物各自包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，該混合物具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布。
29.一種加速動(dòng)物生長(zhǎng)速率的方法，該方法包括給動(dòng)物施用足以加速動(dòng)物生長(zhǎng)速率的數(shù)量的偶聯(lián)物的混合物，該偶聯(lián)物各自包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，該混合物具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于大約22道爾頓的分子量分布。
30.一種基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中該聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中該聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中該聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
34.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯(lián)物具有相同的分子量。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中所述混合物為單分散的混合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中所述混合物為基本上完全單分散的混合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有相同的分子結(jié)構(gòu)。
38.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中所述混合物為完全單分散的混合物。
39.根據(jù)權(quán)利要求30的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為均一的聚丙烯部分。
40.一種基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，每個(gè)偶聯(lián)物包含與寡聚體共價(jià)偶合的人生長(zhǎng)激素，所述寡聚體包含均一的具有至少7個(gè)聚丙二醇亞基的聚丙二醇部分。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的混合物，其中所述寡聚體由均一的具有至少7個(gè)聚丙二醇亞基的聚丙二醇部分組成，且其中每個(gè)偶聯(lián)物是兩親平衡的，因而每個(gè)偶聯(lián)物溶于水并能夠穿透生物膜。
42.一種偶聯(lián)物的混合物，所述的每個(gè)偶聯(lián)物包含與具有聚亞烷基二醇部分的聚合物偶合的生長(zhǎng)激素藥物，其中述混合物的分散系數(shù)(DC)大于10,000，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數(shù)量；Ni為樣品中ith分子的數(shù)量；和Mi為ith分子的質(zhì)量。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的混合物，其中所述分散系數(shù)大于100,000。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的混合物，其中所述分散系數(shù)大于500,000。
45.根據(jù)權(quán)利要求42的混合物，其中所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素。
46.根據(jù)權(quán)利要求42的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
47.根據(jù)權(quán)利要求42的混合物，其中所述聚丙二醇部分是均一的。
48.根據(jù)權(quán)利要求42的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
49.一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物包含與寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物；和具有相同數(shù)量的聚亞烷基二醇亞基。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的混合物，其中所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的混合物，其中所述聚丙二醇部分是均一的。
53.根據(jù)權(quán)利要求49的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基。
54.一種偶聯(lián)物的混合物，其中每個(gè)偶聯(lián)物具有相同的分子量并具有下式生長(zhǎng)激素藥物 其中B為鍵合部分；L為接頭部分；G、G′和G″為獨(dú)立選擇的間隔部分；R為親脂部分而R′為聚亞烷基二醇部分，或者R′為親脂部分而R為聚亞烷基二醇部分；T為末端部分；h、i、j、k、m和n獨(dú)立地為0或1，附帶條件是當(dāng)R為聚亞烷基二醇部分時(shí)，m為1；當(dāng)R′為聚亞烷基二醇部分時(shí)，n為1；和p為1至生長(zhǎng)激素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的混合物，其中所述聚亞烷基二醇基團(tuán)為聚丙二醇部分。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的混合物，其中所述聚丙二醇基團(tuán)是均一的。
57.根據(jù)權(quán)利要求54的混合物，其中i、j、k和n為0；R為均一的聚丙二醇；和所述偶聯(lián)物各自是兩親平衡的，因而每個(gè)偶聯(lián)物溶于水并能夠穿透生物膜。
58.根據(jù)權(quán)利要求54的混合物，其中R為具有至少7個(gè)聚亞烷基二醇亞基的聚亞烷基二醇部分。
59.一種用于合成基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物的方法，每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚乙二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，該方法包括使基本上單分散的包含具有式I的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物與基本上單分散的包含具有式II的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式III的結(jié)構(gòu)的聚合物的條件下反應(yīng)，R1(OC2H4)m-O-X+(I)其中R1為H或親脂部分；m為1-25；而X+為陽(yáng)離子，R2(OC2H4)n-OMs (II)其中R2為H或親脂部分；而n為1-25，R2(OC2H4)m+n-OR′ (III)將基本上單分散的包含式III的聚合物的混合物活化得到基本上單分散的能夠與生長(zhǎng)激素藥物反應(yīng)的活化的聚合物的混合物；和使所述基本上單分散的活化的聚合物的混合物與基本上單分散的生長(zhǎng)激素藥物的混合物在足以得到基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物的條件下反應(yīng)，所述偶聯(lián)物各自包含與寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物，所述寡聚體包含具有m+n個(gè)亞基的聚乙二醇部分。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中R2為脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯包含長(zhǎng)度至少為5個(gè)碳原子的烷基部分。
62.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中R1為甲基。
63.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，所述方法還包括使基本上單分散的包含具有式V的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物與甲基磺酰鹵化物在足以得到基本上單分散的包含具有式II的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物反應(yīng)，R2(OC2H4)n-OH(V)R2(OC2H4)n-Oms (II)。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，所述方法還包括使基本上單分散的包含具有式VI的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物與基本上單分散的包含具有式VII的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式VIII的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物的條件下反應(yīng)R2-OMs (VI)其中R2為親脂部分；R3(OC2H4)m-O-X2+(VII)其中R3為芐基、三苯甲基或THP，而X2+為陽(yáng)離子；R3(OC2H4)m-OR2(VIII)；和使基本上單分散的包含具有式VIII的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式V的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物的條件下反應(yīng)R2(OC2H4)m-OH (V)。
65.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，所述方法還包括使基本上單分散的包含具有式IV的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式I的結(jié)構(gòu)的化合物的混合物的條件下反應(yīng)R1(OC2H4)n-OH (IV)R1(OC2H4)n-O-X+(I)。
66.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述基本上單分散的混合物的活化包括使基本上單分散的式III的聚合物的混合物與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)得到能夠與生長(zhǎng)激素藥物反應(yīng)的活化的聚合物。
67.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述生長(zhǎng)激素藥物為人生長(zhǎng)激素，且其中所述基本上單分散的活化的聚合物的混合物與基本上單分散的人生長(zhǎng)激素的混合物的反應(yīng)包括使基本上單分散的活化的聚合物的混合物與選自Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168、Lys172及其組合的人生長(zhǎng)激素的氨基酸殘基的氨基官能團(tuán)反應(yīng)得到基本上單分散的偶聯(lián)物的混合物，所述偶聯(lián)物各自包含與一個(gè)或多個(gè)寡聚體偶合的人生長(zhǎng)激素，所述寡聚體包含具有m+n個(gè)亞基的聚乙二醇部分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種偶聯(lián)物的混合物，其中所述混合物中每個(gè)偶聯(lián)物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長(zhǎng)激素藥物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1538852SQ02815301
公開(kāi)日2004年10月20日 申請(qǐng)日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月4日
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