專利名稱：一種動物通用人工紅細胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以豬血紅蛋白為基礎(chǔ)的血紅蛋白脂質(zhì)體即一種動物通用人工紅細胞的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
輸血是臨床上一項重要的搶救和治療措施，尤其在急救醫(yī)學(xué)中的作用是其它任何手段無法完全替代的，其應(yīng)用非常廣泛。在動物臨床醫(yī)學(xué)中，輸血療法也是很重要的一種治療方法。但由于輸血可能導(dǎo)致的疾病的感染和傳播,血液貯存期短,動物血型種類繁多和血液來源緊張以及動物相關(guān)血庫尚未建立等原因，動物輸血療法的應(yīng)用受到了限制。目前國內(nèi)寵物的輸血目前大都飼養(yǎng)活體犬和貓來滿足輸血的需求，血型的限制比較大，有成本高，操作復(fù)雜繁瑣的缺點。尋找安全有效的血液替代品成為世界范圍的研究熱點。豬血紅蛋白脂質(zhì)體微囊動物人工紅細胞具有有效擴充血容量并向組織供氧、復(fù)蘇瀕臨死亡的寵物及珍稀動物的功能，在寵物醫(yī)學(xué)、奶牛業(yè)、良種畜禽治療及保護野生動物治療上具有廣泛應(yīng)用前
旦
-5^ O由于血紅蛋白儲存期長、來源廣泛，因此以血紅蛋白為原料的血液代用品被廣泛研究。但是游離血紅蛋白能與NO結(jié)合，也能與血管收縮肽內(nèi)皮素、巨噬細胞、白細胞和血小板作用，導(dǎo)致血管收縮，血壓升高；同時血紅蛋白被降解釋放鐵離子也能使細菌快速生長而造成敗血癥；血紅蛋白在血漿中易解聚為二聚體分子，在血漿循環(huán)中的半衰期僅為2-4h,且會產(chǎn)生強烈的腎毒性，導(dǎo)致腎功能下降。一種經(jīng)5-磷酸吡哆醛(PLP)交聯(lián)的血紅蛋白血液替代品再用戊二醛進行分子間關(guān)聯(lián)，形成大分子血紅蛋白，使血紅蛋白的半衰期延長。Sloan等在美國18個創(chuàng)傷中心對112例失血性休克患者進行了多中心、隨機、單盲的臨床試驗，有患者均多聚血紅蛋白或生理鹽水500毫升注入。其結(jié)果卻顯示血紅蛋白溶液組28d死亡率顯著高于對照組，雖然死亡率差異是否完全是由于直接的輸血或其他因素導(dǎo)致，還應(yīng)當(dāng)應(yīng)進一步分析調(diào)查，這一結(jié)果限制了血紅蛋白溶液在臨床上的應(yīng)用。Powanda研究表明交聯(lián)PolyHb-SOD-CAT的血紅蛋白，不會造成短暫性腦缺血再灌注模型缺血的組織損傷，也不會造成血腦屏障破壞或腦水腫。為延長血紅蛋白的循環(huán)半衰期，通常還采用惰性分子如聚乙二醇修飾來增大相對分子質(zhì)量，該血液替代品具有較長的血漿半衰期、低P50值和高粘度等特點。PEG可以保持Hb的氧結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)完整性，降低Hb免疫原性，提高血紅蛋白存留時間，減少過敏和免疫反應(yīng)。聚乙二醇修飾的血紅蛋白，具有獨特的PEG-Hb的結(jié)合物分子特性，PEG-Hb的四聚體其結(jié)構(gòu)和較高穩(wěn)定性。PEG-Hb可以降低NO減少而導(dǎo)致的血壓升高，并增大血紅蛋白的分子質(zhì)量防止血紅蛋白溢出到組織間隙。重組血紅蛋白由基因工程生產(chǎn)而成，該制品可以解決Hb來源問題，不受輸血相關(guān)傳染病的影響，通過基因突變方法改變了 Hb空間結(jié)構(gòu)，使重組Hb不容易與NO結(jié)合，因此具有較好的前景。但由于目前技術(shù)水平的限制，重組Hb在細菌或真核細胞中表達率較低，產(chǎn)物分離純化困難等，因此造成Hb的純化費用過大，影響了該制品的商業(yè)化。脂質(zhì)體可以屏蔽無基質(zhì)血紅蛋白的毒副作用，且延長血紅蛋白的血漿半衰期。Terajima等的研究也表明，通過檢測血流動力學(xué)、血液平均動脈血壓、中心靜脈壓，心臟指數(shù)值在液體休克復(fù)蘇時脂質(zhì)體血紅蛋白可以保護微循環(huán)免受損傷。Sakai等的研究證明，在大鼠出血性休克模型復(fù)蘇實驗中，LHl對出血性休克的大鼠能迅速恢復(fù)血壓，并能顯著改善功能性毛細血管的密度和組織的氧合作用，脂質(zhì)體血紅蛋白能正常保存I年以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種動物通用人工紅細胞的制備方法。本發(fā)明方法無毒、收率高，得到的人工紅細胞大小均勻，適于應(yīng)用，操作簡便，制備得到的人工紅細胞對于動 物兔、貓、犬是安全的，無免疫原性，不會激活動物的正常免疫系統(tǒng)功能，輸血時不需要驗血型，可以直接使用節(jié)省搶救時間。一種動物通用人工紅細胞的制備方法，包括以下步驟大豆卵磷脂和膽固醇按質(zhì)量比例2:1充分溶于10-20ml乙醚中，再加入IOml提純的濃度范圍為100-250g/L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速為90rpm, -O. IMPa至-O. OlMPa減壓旋轉(zhuǎn)緩慢蒸發(fā)，水浴溫度為20_35°C，除去乙醚，再加入IOml生理鹽水洗滌，同時40KHZ水浴超聲振蕩5_10min，形成人工紅細胞；500rpm離心5min去除下層大顆粒人工紅細胞，取上液6000rpm離心5min，收集下層人工紅細胞，然后40KHZ探頭超聲5秒，停10秒，共10次，500rpm離心3_5min ;取上液，收集人工紅細胞；所得的動物通用人工紅細胞直徑小于10微米。本發(fā)明所使用的血紅蛋白為豬紅細胞破碎提取液。所使用的制備方法為脹破法，將得到的上清液依次通過5. O μ m，I. 2 μ m，O. 22 μ m微孔濾膜過濾，得到無基質(zhì)豬血紅蛋白。測得在波長540nm下稀釋100倍后A值為O. 784，根據(jù)下列公式計算豬血紅蛋白濃度C=K* 稀釋倍數(shù) *OD540其中Κ=0· 170計算出血紅蛋白濃度為133. 3g/L。本發(fā)明解決了目前脂質(zhì)體類血液替代品制備過程中使用有毒有機溶劑的問題如目前制備大都會用到氯仿，而氯仿是有毒藥品，對心、肝、腎有損害，吸入或經(jīng)皮膚吸收引起急性中毒；且光照時會與空氣中的氧氣作用，逐漸被分解成劇毒的光氣(碳酰氯)和氯化氫。而光氣是劇毒物質(zhì)，常用來農(nóng)藥生產(chǎn)，人吸入3200mg/m3即可致死。我們使用的是低毒的有機溶劑乙醚，這樣即使存在少量的殘留，也不會對動物機體產(chǎn)生很大的影響，同時不會導(dǎo)致氣體污染以及操作人員吸入有毒物質(zhì)氯仿和光氣的危險，保障了操作人員的人身安全。而且乙醚低毒，對血紅蛋白活性無影響。反應(yīng)過程中嚴格控制溫度，反應(yīng)條件溫和。經(jīng)血紅蛋白活性保持驗證試驗證明本發(fā)明所采用的條件對血紅蛋白的活性無影響。本方法采用同時加入血紅蛋白溶液和有機溶劑減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，在整個過程中乙醚同大豆卵磷脂分散在血紅蛋白周圍，形成“油包水，水包油”的一種動態(tài)的平衡，隨之乙醚的揮發(fā)減少，大豆卵磷脂逐漸將血紅蛋白溶液包裹起來，形成人工紅細胞。由于減少常規(guī)方法中制備脂質(zhì)體膜的過程和縮短了水和脂質(zhì)體膜的過程，整個過程只需要5-6小時，同專利201110050117中采用常規(guī)方法制備脂質(zhì)體人工紅細胞至少需要4_6天的時間相比，本方法極大地縮短了人工紅細胞的制備時間。本發(fā)法通過同時減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)血紅蛋白溶液和有機溶劑、水浴超聲和探頭超聲等手段協(xié)同作用，不僅是人工紅細胞的大小較為均一，還提高了血紅蛋白的包裹率通過高速離心法測得未包裹的豬血紅蛋白溶液的濃度為41. 3g/L，通過制備前后血紅蛋白濃度的對t匕，可以計算出包裹率為38%，與樊晶等在天津醫(yī)藥，32 (2)，101-103，2004中《脂質(zhì)體包裹人血紅蛋白微囊的制備及其對大鼠血液的影響》報道包裹率為27. 7%，洪民等在中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，17 (6)，772 776，2001中《脂質(zhì)體包埋豬血紅蛋白的制備及其注入小鼠體內(nèi)的初步試驗》報道包裹率為10-30%以及專利201110050117中脂質(zhì)體人工紅細胞包裹率為25%左右對比，包裹率有了較大的提 升。本方法還使用了梯度離心處理最后獲得的人工紅細胞，利用不同的轉(zhuǎn)速對紅細胞施加不同的離心力，從而將大小不同的人工紅細胞分離。在本方法中先500rpm離心5分鐘，取上液6000rpm離心5min,取下層,可以將大顆粒人工紅細胞去除,收集大小適合人工紅細胞收集，探頭超聲將較大的人工紅細胞變小，再通過500rpm離心3_5min取上液。本方法可以通過該手段得到大小較為均一的脂質(zhì)體人工紅細胞。


圖I是本發(fā)明制備的動物通用人工紅細胞的直觀示意圖；圖2是人工動物通用紅細胞顯微鏡照片。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實施例I200mg大豆卵磷脂和IOOmg膽固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提純的血紅蛋白濃度為133. 3g/L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液于加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速為90rpm, -O. 05MPa減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)加熱，使水浴溫度為20°C，除去乙醚，加入IOml生理鹽水洗漆,40KHZ水浴超聲振蕩5-10min,形成人工紅細胞。500rpm離心5分鐘,去除下層大顆粒人工紅細胞，取上液6000rpm離心5min，收集下層大小適合人工紅細胞，40KHZ探頭超聲5秒，停10秒，共10次，使紅細胞粒徑減小，500rpm離心5min。取上液，收集人工紅細胞，用生理鹽水稀釋至20ml人工紅細胞，在顯微鏡下人工紅細胞呈圓形。將稀釋后的人工紅細胞溶液15ml輸給約I. 5kg健康新西蘭兔，兔存活15天以上。實施例2200mg大豆卵磷脂和IOOmg膽固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提純的血紅蛋白濃度為133. 3g/L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液于加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速為90rpm, -O. 05MPa減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)加熱，使水浴溫度為20°C，除去乙醚，加入IOml生理鹽水洗漆,40KHZ水浴超聲振蕩5-10min,形成人工紅細胞。500rpm離心5分鐘,去除下層大顆粒人工紅細胞，取上液6000rpm離心5min，收集下層大小適合人工紅細胞，40KHZ探頭超聲5秒，停10秒，共10次，，使紅細胞粒徑減小，500rpm離心5min。取上液，收集人工紅細胞，用生理鹽水稀釋人工紅細胞至20ml，將稀釋后的人工紅細胞溶液3ml耳緣靜脈輸給約I. Ikg健康新西蘭兔，輸血前和輸血后兔臨床指標體溫和心跳等正常，檢測并比較輸血前和輸血后血常規(guī)和尿常規(guī)紅細胞數(shù)目和白細胞數(shù)目只有小幅度的增加紅細胞數(shù)目從6. 25X IO12/L增加到10. 02X1012/L,白細胞數(shù)目從6. 5X109/L增加至Ij 7. 2X 109/L，血紅蛋白含量從144g/L增加到222g/L，說明人工紅細胞沒有激活兔的免疫系統(tǒng)和豬血紅蛋白到兔體內(nèi)后被釋放出來；尿膽原有略微增加到33mmol/L，表明豬血紅蛋白在兔體內(nèi)被釋放后在血液中會逐步被機體代謝。兔輸血實驗說明人工動物通用紅細胞對兔安全可用。實施例3200mg大豆卵磷脂和IOOmg膽固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提純的血紅蛋白濃度為133. 3g/L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液于加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速為90rpm, -O. 05MPa減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)加熱，使水浴溫度為20°C，除去乙醚，加入IOml生理鹽水洗漆,40KHZ水浴超聲振蕩5-10min,形成人工紅細胞。500rpm離心5分鐘,去除下層大顆粒人 工紅細胞，取上液6000rpm離心5min，收集下層大小適合人工紅細胞，40KHZ探頭超聲5秒，停10秒，共10次，使紅細胞粒徑減小，500rpm離心5min。取上液，收集人工紅細胞，用生理鹽水稀釋人工紅細胞至20ml，將稀釋后的人工紅細胞溶液Iml輸給約O. 520kg健康貓，監(jiān)測貓輸血前和輸血后5天的血常規(guī)和尿常規(guī)白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)目和血紅蛋白在輸血后第一天增加，分別達到23. 8X 109/L、10. 62X 1012/L，263g/L，之后均恢復(fù)恢復(fù)正常水平。其中紅細胞數(shù)目只是輕微的增加。表明輸血沒有導(dǎo)致貓產(chǎn)生輸血反應(yīng)。蛋白質(zhì)、膽紅素和尿膽原升高后持續(xù)2-4天，其中蛋白質(zhì)、膽紅素和尿膽原在輸血后第一天達到最大值3g/L、8. 6 μ mol/L、66 μ mol/L,隨后逐步恢復(fù)輸血前的正常水平，輸入的血紅蛋白在逐步被代謝。輸血前和輸血后貓臨床指標正常。輸血實驗說明人工動物通用紅細胞對貓安全可用的。實施例4200mg大豆卵磷脂和IOOmg膽固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提純的血紅蛋白濃度為133. 3g/L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液于加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速為90rpm, -O. 05MPa減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)加熱，使水浴溫度為20°C，除去乙醚，加入IOml生理鹽水洗漆,40KHZ水浴超聲振蕩5-10min,形成人工紅細胞。500rpm離心5分鐘,去除下層大顆粒人工紅細胞，取上液6000rpm離心5min，收集下層大小適合人工紅細胞，40KHZ探頭超聲5秒，停10秒，共10次，，使紅細胞粒徑減小，500rpm離心5min。取上液，收集人工紅細胞，用生理鹽水稀釋人工紅細胞至20ml，將稀釋后的人工紅細胞溶液13ml分別輸給2只約3kg健康犬，監(jiān)測犬輸血前和輸血后5天的血常規(guī)和尿常規(guī)在輸血后犬I和犬2白細胞數(shù).在8. 1-17 X 109/L之間，血紅蛋白含量在135-198g/L之間，屬于正常范圍內(nèi)。犬I犬2中膽紅素分別達到66umoL/L和100umoL/L和蛋白質(zhì)均達到彡3. Og/L,其趨勢是2_3天內(nèi)升高后慢慢降低到輸血前的正常水平，尿膽原持續(xù)的略有升高。輸血前和輸血后犬的臨床指標正常。輸血實驗人工動物通用紅細胞對犬安全可用的。
權(quán)利要求
1.一種動物通用人工紅細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 大豆卵磷脂和膽固醇按質(zhì)量比例2:1充分溶于10-20ml乙醚中，再加入IOml提純的濃度范圍為 IO O - 2 5 O g/ L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速為90rpm, -O. IMPa至-O. OlMPa減壓旋轉(zhuǎn)緩慢蒸發(fā)，水浴溫度為20-35 °C，除去乙醚，再加入IOml生理鹽水洗滌，同時40KHZ水浴超聲振蕩5_10min，形成人工紅細胞；500rpm離心5min去除下層大顆粒人工紅細胞，取上液6000rpm離心5min，收集下層人工紅細胞，然后40KHZ探頭超聲5秒，停10秒，共10次，500rpm離心3_5min ;取上液，收集人工紅細胞；所得的動物通用人工紅細胞直徑小于10微米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物通用人工紅細胞的制備方法，將大豆磷脂和膽固醇按比例溶于有機溶劑乙醚；再將豬血紅蛋白溶液加入到乙醚溶液中；將混合溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醚；加入生理鹽水洗滌，水浴超聲振蕩；離心、洗滌、收集人工紅細胞；超聲，離心，取上清。所述的動物通用人工紅細胞大小為直徑小于10微米。本發(fā)明方法無毒、收率高，得到的人工紅細胞大小均勻，適于應(yīng)用，操作簡便，制備得到的人工紅細胞對于動物兔、貓、犬是安全的，無免疫原性，不會激活動物的正常免疫系統(tǒng)功能，輸血時不需要驗血型，可以直接使用，節(jié)省搶救時間。
文檔編號A61K38/42GK102836126SQ20121025565
公開日2012年12月26日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者賈杏林, 丁維, 李曉云, 萵小慶, 周放 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)