專利名稱：：用于糖尿病治療的模板化的胰島細(xì)胞和小胰島細(xì)胞簇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及用于建立可存活的胰島細(xì)胞、胰島和小胰島細(xì)胞簇的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：在美國，糖尿病病例的增加已經(jīng)被稱作流行性的。糖尿病是第三大疾病致死原因，僅次于心臟病和癌癥成為美國公民的主要?dú)⑹帧Ｓ捎跓o法解釋的原因，I型糖尿病的發(fā)生在世界上日益增加，在過去的十年中發(fā)病年齡已經(jīng)下降了3-5年，所以許多兒童現(xiàn)在在入學(xué)以前發(fā)生糖尿病。結(jié)果是，許多糖尿病患者將在他們的大部分壽命中面臨發(fā)生與I型糖尿病有關(guān)的慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。由于大部分與糖尿病有關(guān)的慢性并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與血糖控制有關(guān)，大量注意指向新穎的療法(諸如胰島移植)，以改善血糖控制。在二十世紀(jì)八十年代首次嘗試了胰島移植。胰島移植在人類中的最初成功率是令人失望的，僅5%的接受移植物的患者取得部分功能。參見Sutherland等人，Evolutionofkidney,pancreas,andislettransplantationforpatientswithdiabetesattheUniversityofMinnesota,Am.J.Surg.166:456491(1993)。失敗包括，孤立的個(gè)體成功史實(shí)現(xiàn)了長期反轉(zhuǎn)他們的糖尿病1-2年的時(shí)段，這鼓舞研究人員繼續(xù)該方案來治療糖尿病。在2000年，使用省略糖皮質(zhì)激素的抑制方案(現(xiàn)在稱作埃德蒙頓方案)，在7位糖尿病患者上成功地進(jìn)行了胰島移植。參見Ridgway等人，Pancreaticisletcelltransplantation:progressintheclinicalsetting,Treat.Endocrinol.2(3):173-189(2003)。因而，胰島移植結(jié)果已經(jīng)限制改善。參見Shapiro等人，Clinicalresultsafterislettransplantation,J.Investig.Med.49(6):559-562(2001);Balamurugan等人，Prospectiveandchallengesofislettransplantationforthetherapyofautoimmunediabetes,Pancreas32(3):231243(2006)。然而，盡管這些結(jié)果產(chǎn)生了樂觀，仍然存在使用胰島移植作為糖尿病的實(shí)際治療的屏障，考慮到大多數(shù)個(gè)體需要多個(gè)移植物來實(shí)現(xiàn)胰島素獨(dú)立性，一個(gè)屏障是有限數(shù)目的供體器官。許多因素可能影響移植成功，包括胰島的物理特征。約20年前，研究人員詳細(xì)地描述了胰島的大小和形狀，并確定了估測胰島體積的方法。參見Bonnevie-Nielsen等人,Pancreaticisletvolumedistribution:directmeasurementinpreparationsstainedbyperfusioninsitu,ActaEndocrinol.(Copenh)105(3):379-84(1984)多年來，由于下述幾個(gè)原因，傳統(tǒng)上已經(jīng)認(rèn)為大胰島是移植部位所希望的(1)認(rèn)為大胰島的存在是良好胰消化的標(biāo)志，因?yàn)橐葝u可通過過度消化而破碎，和(2)使用體積來確定移植所需的胰島的最小數(shù)目，且因?yàn)橐葝u直徑的倍增等同于它的體積的8倍增加，大胰島對制品中的胰島等效物的數(shù)目做出巨大貢獻(xiàn)。近年來，研究人員已經(jīng)將氧、葡萄糖和胰島素在胰島中的運(yùn)輸模型化。參見Dulong等人，Contributionsofafiniteelementmodelforthegeometricoptimizationofanimplantablebioartificialpancreas,Artif.Organs26(7):5S3-9(2OO2)。如果周圍細(xì)胞的氧消耗速率超過氧擴(kuò)散進(jìn)胰島中的速率，氧的有限運(yùn)輸可以擴(kuò)大胰島核心中的細(xì)胞死亡。例如，最近的研究指示，當(dāng)暴露于低氧條件時(shí)，更大的胰島表現(xiàn)出增加的壞死。實(shí)際上，當(dāng)胰島直徑超過100-150μm時(shí),幾乎所有的β細(xì)胞死亡。參見Giuliana等人，Centralnecrosisinisolatedhypoxichumanpancreaticislets;evidenceforpostisolationischemia,CellTransplantation14767-76(2005);MacGregor等人，Smallratisletsaresuperiortolargeisletsininvitrofunctionandintransplantationoutcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.290(5):E771_779(2006)。得到的氧化性應(yīng)激可以加重細(xì)胞凋亡和對移植的免疫應(yīng)答。參見Bottino等人，Responseofhumanisletstoisolationstressandtheeffectofantioxidanttreatment,Diabetes53(10):2559-68(2004)。甚至在尚未發(fā)生細(xì)胞死亡的情況下，胰島核心中的代謝速率可能降低。葡萄糖和胰島素的遲緩運(yùn)輸也會降低胰島的功能性。與在胰島核心中包含的那些細(xì)胞相比，在胰島內(nèi)的葡萄糖梯度會造成周圍細(xì)胞接觸到遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高的葡萄糖濃度。參見Kauri等人,DirectmeasurementofglucosegradientsandmasstransportwithinisletsofLangerhans,Biochem.Biophys.Res.Commun.304(2):371-7(2003)該梯度的形狀與胰島直徑和葡萄糖代謝速率直接相關(guān)。增加胰島直徑會增加在胰島內(nèi)的所有平面中的該擴(kuò)散和消耗屏障。為了發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞的其它來源，還已經(jīng)嘗試在體外培養(yǎng)β細(xì)胞。這些方法已經(jīng)聚焦于培養(yǎng)來自胎兒組織的β細(xì)胞，或從生產(chǎn)胰島的干細(xì)胞或祖細(xì)胞衍生出這樣的細(xì)胞。參見，例如Peck等人，美國專利號6，703，017;Brothers,WO93/00411(1993);Neilsen,W086/01530(1986);Zayas,EP0363125(1990);Bone等人,Microcarriers;ANewApproachtoPancreaticIsletCellCulture,InVitroVol.18,No.2Feb.(1982)。不幸的是，這樣的技術(shù)通常是耗時(shí)的，且需要珍貴的胎兒組織或干細(xì)胞作為它們的來源的可用性，并產(chǎn)生培養(yǎng)的β細(xì)胞的匯合單層。因而，仍然需要使用更有效的、可利用的且可靠的技術(shù)來建立可存活的胰島細(xì)胞。在克服構(gòu)建大完整胰島時(shí)所遇到的擴(kuò)散屏障的嘗試中，發(fā)明人做出了不同的嘗試來在用于植入的聚合物微球上培養(yǎng)多個(gè)胰島細(xì)胞層。將圖IA所示的微球工程設(shè)計(jì)成在完整胰島的大小范圍內(nèi)。通過使β細(xì)胞附著于微球的外表面，理論上認(rèn)為，幾乎不存在或不存在由擴(kuò)散屏障導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。使用不同的培養(yǎng)環(huán)境做了多種嘗試，以優(yōu)化所述細(xì)胞向微球的附著，包括使用極高密度的懸浮細(xì)胞。但是，該方法會快速地耗盡營養(yǎng)物介質(zhì)，且細(xì)胞存活較差。其它技術(shù)包括這樣的細(xì)胞所述細(xì)胞緩慢地“滴”在微球上以增加細(xì)胞與微球的物理相互作用，或在微重力室中共培養(yǎng)細(xì)胞和微球數(shù)天。盡管有些β細(xì)胞會附著于聚合物微球上，它們的分布是不均勻的，且從未一致地實(shí)現(xiàn)多個(gè)附著細(xì)胞層(圖1Β)。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種可植入的裝置，其包括基本上平面的由生物材料構(gòu)成的支架，所述支架具有主表面；和以多層附著于生物材料支架的表面的單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇。所述單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇優(yōu)選地衍生自成年完整胰島。可以將細(xì)胞粘附分子(例如整聯(lián)蛋白、鈣粘著蛋白、選擇素和免疫球蛋白)附著于支架，以促進(jìn)單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇向所述支架的附著。此外，可以受控地從所述支架釋放出一種或多種血管生成因子、免疫抑制劑(包括自身免疫抑制劑)、抗生素、抗氧化劑、抗-細(xì)胞因子或抗-內(nèi)毒素，以提高胰島細(xì)胞和小胰島細(xì)胞簇的生存力。在另一個(gè)方面，所述生物材料支架是柔性的生物材料，且可以由生物相容的和/或可生物降解的聚合物構(gòu)成，諸如聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)、聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共聚-羥乙酸)(PLGA)。在另一個(gè)方面，所述多層包含生產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞和其它胰島細(xì)胞類型的組合。所述多層優(yōu)選地是約1-2至5個(gè)細(xì)胞厚，并形成約10-50μm厚的多層。所述多層優(yōu)選地具有基本上均勻的厚度，使得細(xì)胞厚度在生物材料支架的表面上變化不超過1-2個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)方面，從完整成年胰島衍生出所述單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇，其中使用酶消化和/或在鈣清空的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明也提供了一種形成可植入的裝置的方法。具體地，提供了從完整胰島衍生出單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇的技術(shù)(例如酶消化、鈣清空或它們的組合)。另外，提供了用于附著單個(gè)胰島細(xì)胞和/或小胰島細(xì)胞簇的方法，所述方法包括離心細(xì)胞懸浮液，和使用細(xì)胞粘附分子來改善向支架表面的附著。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明的可植入裝置來治療糖尿病的方法。描述了用于植入所述裝置的方法和用于治療糖尿病的技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于培養(yǎng)細(xì)胞的表面，所述表面包括具有基本上平面的頂部表面的基質(zhì)，其中所述表面包括多個(gè)凹坑(divot)。每個(gè)凹坑包括內(nèi)部底部表面和內(nèi)部側(cè)壁表面。所述底部表面是圓形的，且每個(gè)凹坑的具有100-200μm的直徑(±20)和50-150μm的深度(±20)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的裝置，所述裝置包括上述的表面，并另外包括用于支持所述平面表面的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)形成底部表面和內(nèi)部側(cè)壁表面和內(nèi)部體積，所述底部和側(cè)壁基本上不透過液體。當(dāng)使用所述裝置時(shí)，將細(xì)胞和培養(yǎng)基分布進(jìn)內(nèi)部體積中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是胰島細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是選自下述的非胰島細(xì)胞干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)系、新鮮分散的細(xì)胞或原代細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是胰島細(xì)胞，且所述凹坑具有100μπι(±20%)的直徑和60μm(土20%)的深度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括將細(xì)胞引導(dǎo)至包括多個(gè)凹坑的表面，其中每個(gè)凹坑具有100-200μm的直徑(±20%)和50-150μm的深度(±20%)，并將所述裝置暴露于細(xì)胞培養(yǎng)條件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是胰島細(xì)胞，且所述細(xì)胞在暴露于所述裝置和支持性培養(yǎng)條件以后再聚集成小胰島。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞以每I個(gè)凹坑大約20-150個(gè)細(xì)胞的比率沉降在凹坑中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，已經(jīng)從胰島培養(yǎng)物分散所述細(xì)胞，且將非天然分子工程設(shè)計(jì)成得到的小胰島。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非胰島細(xì)胞選自干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)系、新鮮分散的細(xì)胞或原代細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種用于測試多個(gè)細(xì)胞樣品對導(dǎo)入的化學(xué)品的反應(yīng)的方法，所述方法包括下述步驟(a)在包括多個(gè)凹坑的裝置中培養(yǎng)細(xì)胞，其中每個(gè)凹坑具有100-200μm的直徑(±10%)和50-150μm的深度(±10%)，(b)將測試化學(xué)品引導(dǎo)至每個(gè)凹坑，和(c)分析所述細(xì)胞對所述測試化學(xué)品的反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是分離的胰島群體，其中所有胰島中的至少80%具有低于90μm的直徑，且其中所述胰島具有比天然大胰島低的擴(kuò)散屏障。優(yōu)選地，所述胰島具有比天然小胰島和大胰島高的細(xì)胞生存力，且胰島的胰島素生產(chǎn)特征在于，水平是天然的分離的胰島大于10倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，大多數(shù)胰島是球形的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述胰島包含胰腺α細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞和胰腺δ細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述胰島中的至少85%是可存活的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所有胰島中的至少80%具有小于50μm的直徑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述胰島中的至少50%具有小于·37μm的直徑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與分離自天然小胰島或天然大胰島的β細(xì)胞相t匕，所述胰島β細(xì)胞生產(chǎn)更大量的胰島素。本專利或申請文件含有至少一幅彩色繪制的圖。在請求并支付必要的費(fèi)用后，含有彩圖的該專利或?qū)＠暾埞_文本的復(fù)制件將由美國專利和商標(biāo)局提供。圖IA和B解釋了以前在微球聚合物上培養(yǎng)β細(xì)胞的嘗試，所述微球聚合物用于植入患者中。在該照片中，顯示了附著于用聚氨基葡糖聚合物包被的PLGA微球上的細(xì)胞的不均勻分布。在長期溫育β細(xì)胞以后，僅可以得到部分細(xì)胞單層。圖2的圖對比了培養(yǎng)的大鼠大胰島(大于125μm)、小胰島(小于125μm)和分散的β細(xì)胞的隨時(shí)間而變化的細(xì)胞生存力。在第3天以后，大胰島的降低的生存力是統(tǒng)計(jì)上顯著的(Ρ〈0·05)ο圖3Α和B總結(jié)了小胰島(小于125μm)或大胰島(大于125μm)向糖尿病大鼠中的移植的結(jié)果。當(dāng)使用小胰島時(shí)，在約80%的時(shí)間內(nèi)觀察到向血糖正常的成功恢復(fù)，但是當(dāng)移植大胰島時(shí)，移植物沒有成功地恢復(fù)正常血糖水平。通過證實(shí)在移植后60天每組動物的血糖水平，可以最好地解釋該現(xiàn)象。接受大胰島的動物在移植后仍然是高血糖的，而接受小胰島的大鼠是血糖正常的。*指示0.01的顯著差異。圖4是在移植后約8周從腎囊取出的胰島移植物，并針對胰島素進(jìn)行免疫標(biāo)記。左圖的照片顯示了使用小胰島(小于125μπι)時(shí)相對更多的胰島素免疫標(biāo)記(紅色)和在移植物中建立的毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)。相比而言，大胰島(大于125μπι)的移植物表現(xiàn)出極微小的胰島素免疫標(biāo)記和顯著的纖維化(右圖)。所述照片是4只不同動物的代表。圖5顯示了為了鑒別β細(xì)胞用雙硫腙染色的大鼠小胰島細(xì)胞簇。因?yàn)闉闃O端薄的Z切片設(shè)置共焦孔，在亞基內(nèi)、但是低于焦點(diǎn)平面的細(xì)胞是模糊的，且沒有顯示紅色。但是，共焦平面向那些細(xì)胞的調(diào)節(jié)指示，它們也顯然被雙硫腙染色。圖6(圖Α)顯示了使用酶促分散從完整成年胰島制備的小胰島細(xì)胞簇的活/死染色。該小胰島細(xì)胞簇具有大約40μm的直徑。在圖6的右上圖(圖B)中，顯示了用鈣清空的培養(yǎng)基培養(yǎng)完整胰島所衍生出的小胰島細(xì)胞簇。所述小胰島細(xì)胞簇被展開或打開，所以培養(yǎng)基能夠環(huán)繞簇中的細(xì)胞。在圖6(圖C)中，顯示了使用鈣清空和酶促分散衍生出的小胰島細(xì)胞簇。片段的直徑是大約15μπι。圖6(圖D)顯示了通過鈣清空和酶消化的組合、隨后手工移液所衍生出的單個(gè)胰島細(xì)胞。紅色指示死細(xì)胞，綠色的細(xì)胞是活細(xì)胞。在圖B中的比例條適用于圖A-C。圖7是根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)貼劑的示意圖，所述貼劑具有與其附著的胰島細(xì)胞多層。圖8是β細(xì)胞向㈧聚氨基葡糖(Mw=IOOkDa)和⑶層粘連蛋白的附著的光學(xué)顯微照片。插圖顯示了在層粘連蛋白上的β細(xì)胞的光學(xué)和熒光顯微照片，其中用細(xì)胞色素B(cytochB,綠色)進(jìn)行肌動蛋白染色。圖9顯示了當(dāng)將胰島細(xì)胞鋪層在由50:50ALGA_羧基(5.5kDa)制成的聚合物貼劑上時(shí)的結(jié)果。使用共焦顯微鏡，光學(xué)地觀察所述貼劑的斷面。提供照片，以得到顯示的Z斷面切片。上圖解釋了具有一層或兩層細(xì)胞的貼劑，然后添加顯示的額外細(xì)胞層。通過將它們在板式離心機(jī)中在約3500rpm離心約10分鐘，將細(xì)胞鋪層在支架上。在重復(fù)沖洗以后，所述層仍然附著于聚合物支架上。圖10的示意圖描繪了具有凹坑的微型模具(micro-mold)的一般設(shè)計(jì)。在該實(shí)施例中，PDMS是構(gòu)成微型模具的外殼的材料，且蝕刻的玻璃是在其中蝕刻凹坑的基質(zhì)。圖11的顯微照片顯示了微型模具中的空凹坑的俯視圖；這里描繪的凹坑的圖案是微型模具設(shè)計(jì)B的代表。圖12是由面形測定器產(chǎn)生的圖，其解釋了單個(gè)凹坑的深度和所述凹坑的圓底形狀。圖13的示意圖解釋了用于微型模具生產(chǎn)的臺架。微型模具的組件和用于構(gòu)建微型模具的臺架是[I]大銅管；[2]小銅管；[3]PDMS聚合物，其構(gòu)成容納具有凹坑的表面的系統(tǒng)；[4]扁平的表面，諸如被包圍在鋁箔中的大玻璃正方形，其用作在上面構(gòu)建所述微型模具的基質(zhì)；[5]微型模具外殼的垂直壁；[6]微型模具的基質(zhì)，在這里顯示為達(dá)到2mm的深度；和[7]蝕刻的玻璃，它是具有凹坑的基質(zhì)。圖14的顯微照片顯示了在第2和5天在微型模具的凹坑內(nèi)的胰島細(xì)胞再聚集。圖15的顯微照片顯示了與凹坑區(qū)域鄰近的、具有凹坑的基質(zhì)的未形成凹坑的邊緣；凹坑含有小的再聚集的胰島細(xì)胞，但是落在未形成凹坑的表面上的那些細(xì)胞已經(jīng)再聚集成大的巨型胰島(mega-islets)。圖16的顯微照片顯示了聚集在可商業(yè)得到的平板的孔的邊緣處的活胰島細(xì)胞；胰島細(xì)胞的再聚集不象在微型模具中一樣是球形的，所述再聚集的胰島細(xì)胞群遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在微型模具中形成的90μm胰島。圖17A和B的一組示意圖顯示的微型模具的2種可能的凹坑圖案；圖17A是這樣的設(shè)計(jì)其中凹坑彼此靠近，當(dāng)嘗試使在單個(gè)微型模具中形成的再聚集體的數(shù)目最大化時(shí)，這是有用的；圖17B是這樣的設(shè)計(jì)其中凹坑彼此隔開，當(dāng)操作單個(gè)凹坑中的細(xì)胞處理時(shí)，這是有用的。圖18的顯微照片顯示了被包含在單個(gè)凹坑內(nèi)的2個(gè)再聚集的胰島。圖19A和B的一組顯微照片顯示了在再聚集的胰島中的生存力染色；紅色指示死細(xì)胞。圖19A表明，再聚集在微型模具內(nèi)的胰島含有非常少的死細(xì)胞，在上邊的胰島中僅一個(gè)死細(xì)胞被染色，而在下邊的胰島中沒有細(xì)胞死亡的證據(jù)。圖19B顯示了在微型模具的未形成凹坑的表面上形成的巨型胰島，其中在視圖的共焦平面中存在至少23個(gè)死胰島細(xì)胞。圖20的圖將天然小胰島和天然大胰島的生存力與再聚集的胰島進(jìn)行了對比。所有胰島取自同一只大鼠，并將一部分分離的胰島分散成胰島細(xì)胞用于再聚集。在第5天，從微型模具取出再聚集的胰島，并將所有胰島暴露于活/死生存力染料。在再聚集的胰島中的活細(xì)胞百分比高于天然的大或小胰島。圖21顯示了在微型模具凹坑中再聚集以后6天的2個(gè)代表性的胰島，它們已經(jīng)經(jīng)過三重染色，以鑒別β細(xì)胞(綠色)、α細(xì)胞(紅色)和S細(xì)胞(藍(lán)色)。上邊的胰島測得43χ55μm的直徑(在X和Y方向測量)，下面的胰島測得48x65μm的直徑。圖22顯示了在微型模具凹坑中形成的第6天再聚集的胰島，其已經(jīng)經(jīng)歷針對胰島素(綠色)和胰島素原(紅色)的染色。該胰島具有45x54μm的直徑(在X和Y方向測量)O圖23的圖描繪了暴露于不同的葡萄糖條件的3類胰島中的胰島素分泌。將天然小胰島和在微型模具凹坑中再聚集的胰島暴露于低葡萄糖條件(3mM);收集分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的胰島素，并定量，如Y軸所示。將天然小胰島、天然大胰島和在微型模具凹坑中再聚集的胰島暴露于高葡萄糖條件(20mM);收集分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的胰島素，并定量，如Y軸所示。圖24的示意流程圖解釋了使用本發(fā)明的微型模具來再聚集最佳地限定尺寸的胰島的一般方法。圖25的示意流程圖解釋了本發(fā)明的微型模具用于高處理量藥物試驗(yàn)的一種示例性用途。圖26顯示了在含有2-[N-(7-硝基苯基_2_氧雜_1，3_二唑_4_基)氨基]_2_脫氧-D葡萄糖(2-NBDG;20mM)的培養(yǎng)基中的再聚集的胰島。圓圈指示胰島的位置。2-NBDG(一種熒光葡萄糖類似物)完全摻入每個(gè)再聚集的胰島中。圖27顯示了負(fù)印章(negativestamp)(由金屬或SU-8制成)的設(shè)計(jì),其可以用于建立生物聚合物模具。終產(chǎn)物具有與在玻璃模具中建立的那些類似的凹坑。圖28A和B解釋了這樣的負(fù)印章設(shè)計(jì)其包括標(biāo)記，以鑒別每個(gè)凹坑在每個(gè)微型模具的凹坑區(qū)域內(nèi)的位置。如圖28A所示，可以以比玻璃蝕刻方法高的精確度為凹坑底部設(shè)計(jì)不同的形狀。圖28B顯示了最終的生物聚合物模具的一部分，其含有具有區(qū)分標(biāo)記的凹坑。圖29A和B對比了具有大約相同尺寸的2個(gè)胰島。圖29A是球形再聚集的胰島的一個(gè)實(shí)例。圖29B描繪了天然小胰島。2個(gè)胰島的形狀、大小和光滑的囊樣外緣是類似的。具體實(shí)施例方式A.一般描述在本說明書中引用的所有專利申請、專利和出版物通過引用整體并入本文。在不一致的情況下，以本公開內(nèi)容(包括定義)為準(zhǔn)。本文使用的術(shù)語“朗格漢斯島”或“胰島”表示，胰腺中的一組專門化的細(xì)胞，所述細(xì)胞生產(chǎn)和分泌激素。胰島通常含有一種或多種下述細(xì)胞類型(I)生產(chǎn)胰高血糖素的α細(xì)胞，所述胰高血糖素會升高血液中的葡萄糖(糖)的水平；(2)生產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞；(3)生產(chǎn)生長激素抑制素的S細(xì)胞，所述生長激素抑制素會抑制體內(nèi)的眾多其它激素的釋放；(4)生產(chǎn)胰腺肽的PP細(xì)胞；(5)分泌血管活性腸肽的Dl細(xì)胞；或(6)分泌胰泌素、促胃動素和P物質(zhì)的EC細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“胰島細(xì)胞”表示在胰島中發(fā)現(xiàn)的任意細(xì)胞。在本發(fā)明中使用的胰島細(xì)胞優(yōu)選地是生產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞與其它胰島細(xì)胞類型的組合。本文使用的術(shù)語“小胰島細(xì)胞簇”或“胰島片段”表示，結(jié)合到一起的胰島細(xì)胞集合，通常在簇中含有小于約25個(gè)胰島細(xì)胞。小胰島細(xì)胞簇優(yōu)選地具有這樣的形態(tài)其使得簇內(nèi)的任意細(xì)胞的(例如營養(yǎng)物、氧、葡萄糖等的)擴(kuò)散屏障不超過約7個(gè)細(xì)胞。通常，所述擴(kuò)散屏障是小于約5個(gè)細(xì)胞，且可以低至4、3或2個(gè)細(xì)胞?！靶∫葝u細(xì)胞簇”優(yōu)選地包含β細(xì)胞作為優(yōu)勢細(xì)胞類型，且可以任選地包括一種或多種其它胰島細(xì)胞類型。所述小胰島細(xì)胞簇可以具有多種形狀(例如，通常是球形的、伸長的或以其它形狀不對稱的)。小胰島細(xì)胞簇的實(shí)例顯示在圖5和6(A)、6(Β)和6(C)中。優(yōu)選地，通過分散從供體胰腺分離出的完整的更大的胰島而衍生出“小胰島細(xì)胞簇”。本文使用的術(shù)語“天然胰島”表示從動物胰腺衍生出的胰島。天然胰島可以表征為，具有大于125μm、優(yōu)選地大于150μm的直徑的“天然大胰島”,或具有小于125μm的直徑的“天然小胰島”。本文使用的術(shù)語“巨型胰島”表示具有大于約300μm的直徑的再聚集的胰島。本文使用的術(shù)語“成年完整胰島”表示從成年哺乳動物胰腺衍生出的天然大胰島或天然小胰島，其中所述胰島已經(jīng)被分離。本文使用的術(shù)語“分散的胰島細(xì)胞”表示細(xì)胞懸浮液，優(yōu)選地如下衍生出破碎大胰島，使得胰島細(xì)胞均勻地分布在懸浮液中。優(yōu)選地，懸浮液中不小于90%的胰島細(xì)胞是單個(gè)細(xì)胞，其它胰島細(xì)胞形成雙聯(lián)體(結(jié)合到一起的2個(gè)細(xì)胞)和三聯(lián)體(結(jié)合到一起的3個(gè)細(xì)胞)和非常少的彼此結(jié)合的更大的細(xì)胞集合。本文使用的術(shù)語“再聚集的胰島”表示結(jié)合到一起的胰島細(xì)胞集合，其優(yōu)選地如下衍生出將大胰島破碎成單個(gè)胰島細(xì)胞，并將那些單個(gè)胰島細(xì)胞一起成群地培養(yǎng)，以形成胰島。優(yōu)選地，單個(gè)胰島細(xì)胞再聚集成胰島會受到微型模具中的凹坑的物理尺寸的影響。用于形成再聚集的胰島的單個(gè)胰島細(xì)胞的數(shù)目取決于所述胰島產(chǎn)物的希望大小。本文使用的術(shù)語“擴(kuò)散屏障”表示，分子從高濃度區(qū)域(例如，在細(xì)胞外的氧或葡萄糖濃度)向低濃度區(qū)域(例如，在細(xì)胞內(nèi)的氧或葡萄糖濃度)的運(yùn)動的抑制。大胰島表現(xiàn)出相對較高的氧擴(kuò)散屏障，這會限制它們的生存力和移植實(shí)用性。在微型模具中再聚集的胰島比天然大胰島更小，并表現(xiàn)出相對較低的擴(kuò)散屏障，這會促進(jìn)在再聚集的胰島內(nèi)的細(xì)胞生存力。本文使用的術(shù)語“細(xì)胞生存力”表示，基于總細(xì)胞樣品，活的或死的細(xì)胞的量的量度。本文定義的高細(xì)胞生存力表示這樣的細(xì)胞群其中所有細(xì)胞中的大于85%是可存活的，優(yōu)選地大于90-95%，且更優(yōu)選地，通過高細(xì)胞生存力表征的群體含有超過99%的可存活的細(xì)胞。本文使用的意圖接觸生物流體或組織(諸如通過植入或移植進(jìn)受試者中)的材料稱作“生物材料”。希望的是，生物材料會誘導(dǎo)所述材料和生理環(huán)境之間的最小反應(yīng)。在下述情況下，認(rèn)為生物材料是“生物相容的”:在放入生理環(huán)境中以后，存在微小的炎癥反應(yīng)，沒有過敏反應(yīng)的證據(jù)，且在生物材料表面上存在最小限度的細(xì)胞生長。在植入宿主哺乳動物中以后，生物相容的生物材料不會引起足以有害地影響微囊功能的宿主反應(yīng)；這樣的宿主反應(yīng)包括在生物材料上或周圍的纖維變性結(jié)構(gòu)的形成，生物材料的免疫學(xué)排斥，或有毒的或熱原性的化合物從生物材料中釋放進(jìn)周圍的宿主組織中。本文使用的術(shù)語“蝕刻”表示，使用酸在基質(zhì)中建立凹坑的化學(xué)過程。本文使用的術(shù)語“凹坑”是指，在基質(zhì)中的局限性的孔或室，其包括底部表面和側(cè)壁(即挖空的空間，其具有寬度和深度)。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了胰島的再聚集，凹坑具有小于100μm的直徑和小于60μm的深度。例如，所述凹坑可以具有80μm的直徑和48μm的深度。在其它實(shí)施方案中，在希望再聚集胰島的情況下，所述凹坑具有80-120μm的直徑和48-72μm的深度。為了其它目的，諸如培養(yǎng)用于藥物試驗(yàn)的微型腫瘤，最佳凹坑具有100-200μm的直徑和60-100μm的深度。本文使用的術(shù)語“具有凹坑的基質(zhì)”表示，已經(jīng)被修飾成含有分散的單個(gè)凹坑的固體支持物或任意材料。本文使用的術(shù)語“微型模具”表示，具有由多個(gè)凹坑構(gòu)成的表面的裝置，其中所述凹坑具有100-200μπι的直徑。微型模具中的凹坑的物理圖案可以由微型模具的生產(chǎn)商指定。所述微型模具優(yōu)選地包含2個(gè)主要部分i)具有凹坑的基質(zhì)，和ii)用于容納具有凹坑的基質(zhì)并在其中含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的系統(tǒng)。所述微型模具用于引導(dǎo)或決定置于其中的細(xì)胞的生長或再聚集。本文使用的術(shù)語“模具外殼”表示這樣的結(jié)構(gòu)所述結(jié)構(gòu)用于支持具有凹坑的基質(zhì)和加入其中的任意液體和細(xì)胞材料。本文使用的術(shù)語“外殼支架”表示，在構(gòu)建所述微型模具的過程中，用于支持和影響材料形式的臨時(shí)框架。本文使用的術(shù)語“濺射”是指，用于將薄膜包衣沉積在基質(zhì)上的氣態(tài)沉積方法。B.附著成多層的胰島細(xì)胞在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)用于植入的可存活的單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇的方法。在一個(gè)方面，分離自非胎兒供體胰腺的單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇以多層附著于合適的生物材料支架的表面。在一個(gè)方面，單個(gè)胰島細(xì)胞(優(yōu)選地β細(xì)胞)附著于生物材料支架上。在另一個(gè)方面，不同胰島細(xì)胞類型的組合附著于生物材料支架上。在另一個(gè)方面，由2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的小胰島細(xì)胞簇附著于生物材料支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，1_2、3、4或5層胰島細(xì)胞的多層附著于生物材料支架上。在所述生物材料支架上的胰島細(xì)胞和小胰島細(xì)胞簇形成約10-50μm厚、最優(yōu)選約20-40μm厚的細(xì)胞多層。在一個(gè)方面，所述胰島細(xì)胞多層優(yōu)選地具有基本上均勻的厚度，使得細(xì)胞厚度在生物材料支架的表面上變化不超過1-2個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述單個(gè)胰島細(xì)胞和/或小胰島細(xì)胞簇直接地分離自供體成年受試者的胰腺，并從完整胰島中分離出。適合將所述胰島分成單個(gè)細(xì)胞和/或小胰島細(xì)胞簇的方法包括酶消化和基于金屬的分散(鈣清空)或它們的組合。在另一個(gè)方面，所述生物材料支架由這樣的材料構(gòu)成所述材料會提供合適的單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇向所述支架的附著。預(yù)見到，不同類型的材料(包括無機(jī)和有機(jī)材料)可以用作本發(fā)明的生物材料支架。這些材料的非限制性實(shí)例包括聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(磷酸酯)、聚(磷腈)和其它。其它非限制性的材料包括，例如，多糖、聚酯(諸如聚(乳酸)、聚(L-賴氨酸)、聚(羥乙酸)和聚(乳酸-共聚-羥乙酸))、聚(乳酸-共聚-賴氨酸)、聚(乳酸-接枝-賴氨酸)、聚酸酐(諸如聚(脂肪酸二聚體)、聚(富馬酸)、聚(癸二酸)、聚(羧基苯氧基丙烷)、聚(羧基苯氧基己烷)、這些單體的共聚物等等)、聚(酸酐-共聚-酰亞胺)、聚(酰胺)、聚(原酸酯)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚氨酯、聚(有機(jī)磷腈)、聚(磷酸酯)、聚(乙烯醋酸乙烯酯)和其它?；〈拇姿崂w維素和它們的衍生物、聚(己內(nèi)酯)、聚(碳酸酯)、聚(氨基酸)、聚(丙烯酸酯)、聚縮醛、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(苯乙烯)、聚(氯乙烯)、聚(氟乙烯)、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸酯化的聚烯烴、聚氧化乙烯、共聚物、聚苯乙烯和它們的混合物或共聚物)。在某些優(yōu)選的方面，生物材料包括多糖、海藻酸鹽、羥丙基纖維素(HPC)、N異丙基丙烯酰胺(NIPA)、聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亞胺、聚氨基葡糖(CS)、甲殼質(zhì)、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸軟骨素、明膠等和它們的衍生物、共聚物及混合物。其它合適的生物材料包括在下述文獻(xiàn)中描·述的那些尼龍、透明質(zhì)烷、聚四氟乙烯、聚乙烯基甲酰胺和其它材料=Vats等人，Scaffoldsandbiomaterialsfortissueengineering:areviewofclinicalapplications,Clin.Otolaryngol.AlliedSci.28(3):165-72(2003);Wang等人，Anencapsulationsystemfortheimmunoisolationofpancreaticislets,Nat.Biotechnol.15(4):358-62(1997);Orive等人,Cel!encapsulation:promiseandprogress,Nat.Med.9(1):104-7(2003),它們通過引用并入。在優(yōu)選的方面，所述生物材料支架由可生物降解的材料構(gòu)成。合適的可生物降解的生物材料包括聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLO)、聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共聚-羥乙酸)(PLGA)。PLG是一種經(jīng)過充分研究的用于藥物遞送的聚合物，并被FDA批準(zhǔn)用于多個(gè)體內(nèi)用途。參見Berkland等人，F(xiàn)abricationofPLGmicrosphereswithpreciselycontrolledandmonodispersesizedistributions,J.Control.ReleaseMay18，73(1):59-74(2001),它通過引用并入。在另一個(gè)方面，所述生物材料支架全部或部分地包有包衣，所述包衣會增加胰島和β細(xì)胞附著。示例性的包衣包括纖連蛋白、聚乙二醇乙酸酯、層粘連蛋白、聚乙烯醇(PVA)、乙烯-馬來酸交替共聚物(PEMA)和聚氨基葡糖(CS)。所述支架也可以具有附著于其上面的一種或多種胰島細(xì)胞粘附分子(“CAM”)，以促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞向所述支架的附著和/或小胰島細(xì)胞簇向所述支架的附著。在其它用途中，以前已經(jīng)證實(shí)CAM會促進(jìn)細(xì)胞向用于組織工程的聚合物的附著(Dunehoo等人，Celladhesionmoleculesfortargeteddrugdelivery,J.Pharm.Sci.95:1856-1872(2006))。細(xì)胞粘附分子(CAM)包括，但不限于整聯(lián)蛋白(例如，3>3、&>5、^^-1、￥1^-4)、鈣粘著蛋白(例如，E-、P-和N-鈣粘著蛋白)、選擇素(例如，E-、L-和P-選擇素)、免疫球蛋白超家族(例如，ICAM-I、1CAM-2、VCAM-I和MadCAM-I)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(例如，纖連蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白、纖維蛋白原、膠原、層粘連蛋白和vonWillebrand因子)、線性和環(huán)狀細(xì)胞粘附肽和衍生自RGD肽、ICAM-I肽、VCAM-I肽、鈣粘著蛋白肽和LFA-I肽的肽擬似物。CAM是組織再生、細(xì)胞形態(tài)、移位、有絲分裂、胞質(zhì)分裂、吞噬作用和維持細(xì)胞極性的必需分子。CAM是存在于細(xì)胞表面上的糖蛋白，其起細(xì)胞-與-細(xì)胞和細(xì)胞-與-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)附著的受體的作用。以前已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞粘附分子(諸如R⑶肽)可以幫助組織工程、組織再生、傷口愈合、再建性外科手術(shù)、神經(jīng)再生、骨移植和器官移植的過程。另外，已經(jīng)證實(shí)，E-鈣粘著蛋白在β_細(xì)胞附著中是重要的(Hauge-Evans等人，Pancreaticbeta-cell-to-beta-cellinteractionsarerequiredforintegratedresponsestonutrientstimuli:enhancedCa2+andinsulinsecretoryresponsesofMINEpseudoislets,Diabetes,48:1402-1408(1999))。在一個(gè)方面，所述細(xì)胞粘附分子使用共價(jià)鍵錨定在所述聚合物上，所述共價(jià)鍵包括、但不限于肽、硫醚、二硫化物或酯鍵?？梢詫㈤g隔分子添加在細(xì)胞粘附分子和所述聚合物之間，以允許在所述聚合物上的粘附分子和在細(xì)胞表面上的細(xì)胞附著受體之間的自由相互作用。將不同細(xì)胞附著于布滿R⑶肽的聚合物上的研究已經(jīng)證實(shí)，就細(xì)胞表面受體對RGD肽的最佳識別而言，聚合物和RGD肽之間的最佳間隔物是約11-46埃。所述間隔物可以由下述材料制成，但不限于聚乙二醇(PEGS)、聚氨基酸(例如，聚-Gly、聚-Lys、聚-Ala)、聚氨基己酸(聚-Aca)和2種或3種氨基酸重復(fù)的組合(例如，聚-Aca-Gly)。除了共價(jià)鍵以夕卜，可以如下附著所述細(xì)胞粘附分子首先將可以吸附進(jìn)貼劑的聚合物網(wǎng)絡(luò)中(例如靜電地、疏水地或通過其它非共價(jià)相互作用)的細(xì)胞粘附分子附著到所述聚合物上，然后附著所述胰島細(xì)胞。在另一個(gè)方面，所述生物材料支架具有促進(jìn)所述單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇向它的表面的附著的形狀。所述支架通常具有基本上平面的表面，諸如在貼劑或圓盤上的表面。在所述優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物材料支架包含基本上平面的柔性貼劑材料。所述生物材料支架具有適合附著單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇的尺寸。例如，在一個(gè)方面，所述平面貼劑通常具有約0.2-3厘米量級的尺寸。所述貼劑的厚度通常是約50μm至I厘米的量級。在另一個(gè)方面，所述生物材料支架可以受控地釋放一種或多種生長因子、免疫抑制劑、抗生素、抗氧化劑、抗-細(xì)胞因子、抗-內(nèi)毒素、T-細(xì)胞附著阻滯劑、血管生成因子、營養(yǎng)物或它們的組合。示例性的生長因子包括，表皮調(diào)節(jié)素、表皮生長因子(“EGF”)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(“ECGF”)、成纖維細(xì)胞生長因子(“FGF”)、神經(jīng)生長因子(“NGF”)、白血病抑制因子(“LIF”)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白_4(“BMP-4”)、肝細(xì)胞生長因子(“HGF”)、血管內(nèi)皮生長因子-A(“VEGF-A”)、膽囊收縮素八肽、胰島素-樣生長因子和甚至胰島素本身。通常參見Miao等人，Invitroandinvivoimprovementofisletsurvivalfollowingtreatmentwithnervegrowthfactor,TransplantationFeb27;81(4):519-24(2006);Ta等人,Thedefinedcombinationofgrowthfactorscontrolsgenerationoflong-termreplicatingisletprogenitor-likecellsfromculturesofadultmousepancreas,StemCells,Mar23(2006);Johannson,Isletendothelialcellsandpancreaticbeta-cellproliferation:studiesinvitroandduringpregnancyinadultrats,EndocrinologyMay;147(5):2315-24(2006)，EpubJan26(2006);Kuntz等人,Effectofepiregulinonpancreaticbetacellgrowthandinsulinsecretion,GrowthFactorsDec23(4):285-93(2005);Vasadava,Growthfactorsandbetacellreplication,Int.J.Biochem.CellBiol.38(5-6):931-50(2006)，EpubAug31Review(2005);Kuntz等人，Cholecystokininoctapeptide:apotentialgrowthfactorforpancreaticbetacellsindiabeticrats,J0P,Nov10;5(6):464-75(2004)。示例性的免疫抑制劑是眾所周知的，且可以是留體類或非留體類。優(yōu)選的留體類試劑是潑尼松。優(yōu)選的非留體類試劑包括在所謂的埃德蒙頓方案中的那些西羅莫司(雷帕鳴，Wyeth-AyerstCanada)、他克莫司(Prograf,FujisawaCanada)和抗-IL2R達(dá)珠單抗(賽尼哌，RocheCanada)。其它免疫抑制劑包括15-脫氧司加林、環(huán)孢菌素、雷帕霉素、雷帕鳴(西羅莫司/雷帕霉素)、FK506或利索茶堿(LSF)?？捎糜趯?shí)踐本發(fā)明的示例性抗生素包括、但不限于阿莫西林、青霉素、磺胺藥物、紅霉素、鏈霉素、四環(huán)素、克拉霉素、ciproflozacin、特康唑、阿奇霉素等等。各種抗氧化劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。特別優(yōu)選的是包括硫醇基團(tuán)的分子，諸如還原的谷胱甘肽(GSH)或它的前體、谷胱甘肽或谷胱甘肽類似物、谷胱甘肽單酯和N-乙酰基半胱氨酸。其它合適的抗氧化劑包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、維生素Ε、ΤιΙοχ、硫辛酸、拉扎洛依、丁羥基茴香醚(BHA)、維生素K等等。例如，可以使用在約2至約IOmM的濃度范圍內(nèi)的谷胱甘肽。參見，例如，美國專利號5，710，172,5,696，109和5，670,545。合適的抗-細(xì)胞因子是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括二甲基硫脲(約10mM)、西替沃酮(約5mM)、普伐他汀鈉(PRAVACH0L，約20mg/kg)、L-NG-單甲基精氨酸(L-NMMA，2mM)、乳鐵蛋白(約100μg/ml)、4-甲基潑尼松龍(約20μg/ml)等等?？?內(nèi)毒素也是本領(lǐng)域已知的，且包括L-Ne-單甲基精氨酸(L-NMMA，約2mM)、乳鐵蛋白(約100ug/ml)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC，約ImM)、腺苷受體拮抗劑諸如芐胺茶堿(茶堿)和抗-脂多糖化合物諸如棘霉素(約IOnM)等等。在另一個(gè)方面，將T-細(xì)胞附著阻滯劑提供給含有胰島細(xì)胞的植入的生物聚合物，以抑制免疫反應(yīng)。這些阻滯劑的添加會預(yù)防胰島移植的排斥。已經(jīng)證實(shí)，T-細(xì)胞附著阻滯劑會抑制器官移植和自身免疫疾病中的T-細(xì)胞活化和免疫應(yīng)答(參見Yusuf-Makagiansar等人,inhibitionofLFA-1/1CAM-1andVLA-4/VCAM-1asatherapeuticapproachtoinflammationandautoimmunediseases,MedicinalChemistryReviews22，146-167(2002);AndersonandSiahaan,TargetingICAM-1/LFA-Iinteractionforcontrollingautoimmunediseases:Designingpeptideandsmallmoleculeinhibitors,Peptides24，487-501(2003))。T-細(xì)胞附著阻滯劑包括、但不限于(a)針對ICAM-ULFA-UB7、⑶28、⑶2和VLA-4的單克隆抗體，(b)可溶性的蛋白和它的片段諸如ICAM-I、VCAM-I、MadCAM-I，(c)RGD肽和肽擬似物，(d)VCAM-1肽和肽擬似物，(e)ICAM-1肽和肽擬似物，和(f)LFA-I肽和肽擬似物。另外，已經(jīng)證實(shí)，衍生自谷氨酸脫羧酶65(GAD65)和GAD雙功能肽抑制劑(GAD-BPI)的肽(例如GAD2(I8_217)會誘導(dǎo)免疫耐受性并抑制T-細(xì)胞的胰島浸潤(胰島炎)。已經(jīng)證實(shí)，GAD2Q8_217在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中會阻斷攻擊β細(xì)胞的T-細(xì)胞的活化，這通過在T-細(xì)胞APC相互作用過程中調(diào)節(jié)TCR-MHC-Ag復(fù)合物形成(Signal-I)而實(shí)現(xiàn)(Tisch等人，InductionofGAD65_specificregulatoryT—cellsinhibitsongoingautoimmunediabetesinnonobesediabeticmice,Diabetes47:894-899(1998))。優(yōu)選的GAD-BPI包含與LFA-I肽的一部分相連的GAD2(I8_217(序列EIAPVFVLLE-[Ac-G-Ac-G-Ac]-ITDGEATDSG)，且已經(jīng)被證實(shí)會在NOD小鼠中阻斷T-細(xì)胞活化和胰島炎，如在下述文獻(xiàn)中所述Murray等人，標(biāo)題為“Signal-1/signal_2bifunctionalpeptideinhibitors”的公開的美國專利號2005/0107585，它通過引用并入。因而，這些分子可以共同施用，以預(yù)防胰島移植物的排斥。這些分子也可以經(jīng)由控釋機(jī)制來遞送，以預(yù)防胰島移植物的排斥。因而，可以將所述分子捕集在所述生物材料支架內(nèi)，然后使β細(xì)胞附著所述支架。使用在下述文獻(xiàn)中闡述的方案，可以實(shí)現(xiàn)這樣的試劑的控釋=Raman等人，Modelingsmall-moleculereleasefromPLGmicrospheres:effectsofpolymerdegradationandnonuniformdrugdistribution,J.Control.Release.Mar2;103(I):149-58(2005);Berkland等人，PrecisecontrolofPLGmicrospheresizeprovidesenhancedcontrolofdrugreleaserate,J.Control.Release.Jul18;82(I):137-47(2002);Schwendeman,RecentadvancesinthestabilizationofproteinsencapsulatedininjectablePLGAdeliverysystems,Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.19(1):73-98(2002);Sershen等人，Implantable,polymericsystemsformodulateddrugdelivery,Adv.DrugDeliv.Rev.5;54(9):1225-1235(2002),它們都通過引用并入。C.在凹坑化的微型模具上生產(chǎn)胰島本發(fā)明也涉及可存活的小胰島的體外生產(chǎn)方法。在一個(gè)方面，將分離自非胎兒供體胰腺的分散的胰島細(xì)胞成群地放入微型模具的單個(gè)凹坑中，并培養(yǎng)以形成再聚集的胰島，所述胰島的形狀和尺寸都受凹坑尺寸的影響。所述微型模具的凹坑具有適合形成小胰島的大小。例如，在一個(gè)方面，所述微型模具通常具有直徑在約30-35mm量級的尺寸，但是該尺寸不受生產(chǎn)方法的限制，且可以放大至30x30cm。所述凹坑通常具有直徑在約100-200μm(±20%)和深度在60-100(±20%)μπι量級的尺寸。優(yōu)選地，為了生產(chǎn)胰島，所述凹坑具有100μm(土20%)的直徑和60μm(土20%)的深度。在另一個(gè)方面，所述微型模具可以用于制備適合移植或體外研究的最佳地成形的且設(shè)定大小的胰島群體。例如，在一個(gè)方面，在微型模具中產(chǎn)生的胰島群體具有50μm或更小的平均直徑。在其它方面，所述群體的特征在于至少85%的可存活的細(xì)胞、優(yōu)選地大于90%或95%的可存活的細(xì)胞，更優(yōu)選地所述群體的特征在于大于99%的可存活的細(xì)胞。在另一個(gè)方面，在微型模具中產(chǎn)生的胰島群體可以以高胰島素分泌水平為特征。例如，在微型模具中再聚集的小胰島的特征在于，與天然小胰島相比，更大的胰島素分泌水平，優(yōu)選地多了超過20倍的胰島素分泌，更優(yōu)選地多了超過100倍的胰島素分泌。例如，再聚集的胰島測得大約10ng/IE的分泌，如圖23所示。這是來自Crim等人(2010)的最佳計(jì)算值的41倍。對比實(shí)驗(yàn)室之間的胰島素分泌數(shù)據(jù)的一個(gè)困難是，許多研究人員沒有報(bào)道單位胰島體積的胰島素分泌。在Crim等人的情況下，他們報(bào)道了每50個(gè)胰島的胰島素分泌，但是沒有指示所述胰島的平均大小。因而，僅僅可以假定，它們的50個(gè)胰島各自等同于以前定義的I胰島當(dāng)量(IE)的胰島體積。我們的實(shí)驗(yàn)室總是報(bào)道通過除以IE而關(guān)于胰島和細(xì)胞的總體積標(biāo)準(zhǔn)化的胰島素分泌。利用關(guān)于Crim論文所做的假定，與Crim等人報(bào)道的最佳條件相比，本文所述的再聚集的胰島響應(yīng)于高葡萄糖而釋放出超過40倍的胰島素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述微型模具將用于建立可用于體外測試和其它體外用途的細(xì)胞。在該實(shí)施方案中，所述微型模具表面優(yōu)選地由玻璃制成，模具側(cè)壁(外殼系統(tǒng))由PDMS制成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，建立可植入的且由生物相容的材料制成的微型模具。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選的材料是以前描述的任意數(shù)目的生物聚合物。在另一個(gè)方面，將所述微型模具凹坑設(shè)計(jì)成為非胰島細(xì)胞提供最佳的物理再形成條件。預(yù)見到，可以在本發(fā)明的凹坑中形成不同類型的細(xì)胞。非限制性實(shí)例包括，長神經(jīng)元途徑、腎小球樣濾器、血管、替換胞室等。干細(xì)胞或重新程序化的細(xì)胞在小的界限清楚的形狀(諸如微型模具)中的聚集，也是本發(fā)明的適當(dāng)用途。優(yōu)選的細(xì)胞類型包括這樣的細(xì)胞其中3-D結(jié)構(gòu)對于細(xì)胞功能而言是重要的。一般而言，圖24是顯示本發(fā)明的方法的示意圖。將取自胰腺或其它胰島源的天然大胰島簇分散成單個(gè)胰島細(xì)胞，并加載到具有凹坑的微型模具上?！胺稚⒌募?xì)胞”是指，大多數(shù)(通常至少90%)的細(xì)胞是單個(gè)細(xì)胞，更少比例的細(xì)胞結(jié)合到一起成為雙聯(lián)體或三聯(lián)體。以導(dǎo)致分散的細(xì)胞群體沉降到每個(gè)凹坑中的方式，將分散的細(xì)胞放入所述微型模具中。優(yōu)選地，30-150個(gè)細(xì)胞沉降在每個(gè)凹坑中。實(shí)施例5公開了一種將胰島分散成單個(gè)細(xì)胞并在微型模具中溫育所述細(xì)胞的優(yōu)選方法。優(yōu)選地，所述解離是在KU糖尿病研究實(shí)驗(yàn)室(KUDiabetesResearchLaboratory)中配制的培養(yǎng)基混合物中。該混合物包括9份不含鈣-鎂的漢克平衡鹽溶液和I份木瓜蛋白酶(50單位/ml)。相比而言，使用胰蛋白酶或除了木瓜蛋白酶以外的酶，實(shí)現(xiàn)大部分胰島解離。所述解離在37°C在旋轉(zhuǎn)下進(jìn)行。最后，如下將胰島分散成單個(gè)細(xì)胞手工地抽吸它們，并用血球計(jì)數(shù)器觀察，直到至少90%的細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞。實(shí)施例5也公開了用于在所述微型模具中再聚集胰島細(xì)胞的優(yōu)選條件。一般而言，所述細(xì)胞保持作為單個(gè)細(xì)胞或松散附著的細(xì)胞群體至第2天，如圖14所示。但是，在第5天或第6天之前，在凹坑中的那些相同細(xì)胞已經(jīng)重組成3D結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)經(jīng)常是球形(例如參見圖18-19A和21)。通常，在第5天之前，再聚集的胰島可以耐受從模具中取出，并作為獨(dú)立的胰島起作用。在該時(shí)段內(nèi)，所述細(xì)胞呈現(xiàn)天然胰島的三維形狀。在所述凹坑中形成的胰島的平均直徑小于50μπι。實(shí)施例5描述了在所述微型模具中形成的小胰島的形態(tài)性質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以將以低濃度分散的細(xì)胞加入所述微型模具中，使得少至2或3個(gè)細(xì)胞落入每個(gè)凹坑中，并使得在凹坑內(nèi)的細(xì)胞能夠生長和分裂。以此方式在凹坑中培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)的形狀和大小會受所述凹坑的物理尺寸的影響。優(yōu)選地，給微型模具加載濃縮的胰島細(xì)胞，使得少至2或3個(gè)胰島細(xì)胞占據(jù)每個(gè)凹坑，其中胰島細(xì)胞生長和聚集在一起，以形成小胰島，優(yōu)選地具有30-40μm的直徑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可能希望在再聚集時(shí)將化學(xué)品或生物分子摻入工程設(shè)計(jì)的胰島中。這些分子包括生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、DMARD(緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物)、抗炎藥和抗生素。可以將增加在移植部位處的氧張力的分子或微型裝置摻入再聚集的胰島中，特別當(dāng)使用可植入的微型模具基質(zhì)時(shí)。可以在再聚集時(shí)添加的其它非限制性的分子類別包括用于誘導(dǎo)胰島素釋放的藥物、小分子、肽、蛋白、抗體(例如針對CDlla、CDllb、CDllc、CD18)和核酸(例如DNA或RNA)。通?？梢栽诩虞d進(jìn)所述微型模具中時(shí)將這樣的分子摻入胰島中。將所述分子加入含有分散的細(xì)胞的培養(yǎng)基中，使得它們在聚集過程中被細(xì)胞攝入或附著于細(xì)胞上?；蛘?，可以在再聚集之前，經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法修飾所述細(xì)胞，這會導(dǎo)致用戶的靶蛋白的生產(chǎn)增加或減少。在形成再聚集體以后，用攜帶化學(xué)品諸如免疫抑制劑或其它目標(biāo)分子(諸如生長因子)的生物聚合物包囊新形成的胰島?；蛘?，使用可植入的微型模具，可以用候選分子浸潰所述模具?？梢詫⒈景l(fā)明的方法設(shè)計(jì)成形成細(xì)胞聚集體，用于隨后的移植或用于藥物或裝置測試。實(shí)施例5描述了用于再聚集移植和藥物篩選所用的細(xì)胞的優(yōu)選方法和實(shí)現(xiàn)該目的的優(yōu)選方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明也涉及一種用于高處理量篩選藥物、化學(xué)品或其它小分子的方法。預(yù)見到，在本發(fā)明的微型模具中的凹坑的圖案和尺寸可以設(shè)計(jì)成適應(yīng)每個(gè)凹坑中的單個(gè)插入。在另一個(gè)方面，從適合移植進(jìn)動物宿主中的生物聚合物，制備所述凹坑化的微型模具。我們預(yù)見到，再聚集進(jìn)可植入的微型模具中的細(xì)胞可以附著或未附著于具有凹坑的基質(zhì)上。對于體外工作，非粘附的基質(zhì)表面(諸如玻璃)是優(yōu)選的。但是，對于可植入的模具或生物聚合物貼劑，粘附基質(zhì)會增加移植過程的效率，減少移植過程中和以后的胰島損失。已經(jīng)測試了所述細(xì)胞向生物聚合物的附著，并描述在表I和圖8中。本發(fā)明的其它方面以及附帶的優(yōu)點(diǎn)和新穎的特征將在下面的描述和實(shí)施例中部分地闡述，且在本領(lǐng)域技術(shù)人員審查下述內(nèi)容以后會部分地顯而易見，或可以從本發(fā)明的實(shí)踐中獲知。借助于在所附的權(quán)利要求中具體地指出的手段和組合，可以實(shí)現(xiàn)和獲得本發(fā)明的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例I:胰島的大小影響生存力和移植成功本實(shí)施例研究了胰島大小如何影響在大鼠中的移植成功。在該實(shí)施例中，描述了用于分離胰島的技術(shù)，并測量了細(xì)胞生存力。移植了大胰島(大于125μπι)和小胰島(小于125μπι)，以便評估胰島大小對移植成功的影響。如下面討論的，小的大鼠胰島在體外功能和體內(nèi)移植結(jié)果方面優(yōu)于大胰島。這些實(shí)驗(yàn)也描述在MacGregor等人，Smallratisletsaresuperiortolargeisletsininvitrofunctionandintransplantationoutcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.May;290(5):E771_9(2006)中，它通過引用整體并入。大鼠胰島分離為了分離大的和小的胰島，通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮和賽拉嗪的混合物，麻醉成年雄性DA大鼠。暴露腹腔，并夾住與腸相連的胰腺導(dǎo)管。經(jīng)由膽總管，在原位給胰腺插入套管，并通過將冷的膠原酶溶液抽入導(dǎo)管中進(jìn)行擴(kuò)張。以450U/ml，將膠原酶(CLS-1,WorthingtonBiochemicalCorp,Lakewood,NJ)溶角軍于20mlLeibovitzL15中。隨后，切離擴(kuò)張的胰腺，轉(zhuǎn)移至50ml離心管，并在輕輕翻轉(zhuǎn)下在37°C培養(yǎng)箱中溫育約20-30分鐘。在溫育以后，輕輕搖動所述試管，以逐出胰島。將所述試管的內(nèi)容物放入含有10%新生小牛血清的稀釋的冰冷的漢克平衡鹽溶液(“HBSS”)中。在Ixg沉降消化物，并去除上清液。加入更多的HBSS/血清，并重該過程。使洗滌的消化物穿過500微米不銹鋼篩，并在冷凍離心機(jī)中在300xg沉降約I分鐘。將沉淀物與IOmLI.110克/mL的Histopaque(密度=1.1085,SigmaDiagnosticsInc.,St.Louis,Missouri)相混合，并在800xg離心10分鐘。梯度收集胰島漂浮物，并分別沉降，然后放入含有10%胎牛血清的Ham氏F12培養(yǎng)基中，并放入含有5%C02的37°C培養(yǎng)室中。產(chǎn)率為了產(chǎn)率測量，檢查每批胰島的一式三份樣品，每份樣品包含大約2%的胰島級分。計(jì)數(shù)單個(gè)胰島，并測量它們的直徑。對于不規(guī)則形狀的胰島，在胰島的不同位置做3-4次直徑測量，并使用平均值。計(jì)算胰島體積，并轉(zhuǎn)化成樣品和整個(gè)胰島級分的胰島當(dāng)量。將小胰島定義為，與具有約125μm或更大直徑的大胰島相比，具有小于約125μm的直徑的那些。為了使小胰島與大胰島分離，將新鮮的胰島或培養(yǎng)過夜的胰島沉降，然后放入l-2mlL15培養(yǎng)基中。然后在5%BSA于L15中的單階梯度中，使所述胰島快速地分層。在Ixg沉降經(jīng)驗(yàn)地設(shè)定的時(shí)間段，直到在試管的底部觀察到大胰島。在此時(shí)，拋棄頂部的2毫升(不含有BSA)梯度，小心地取出除了底部2ml以外的全部，以限定小胰島群體。將沉降的胰島和在底部2毫升中的那些組合成大胰島級分。如果必要的話，重復(fù)所述梯度，以優(yōu)化大和小胰島的分離。沉降最終的胰島級分，并放入Ham氏F12和無葡萄糖的RPMI1640(葡萄糖=5mM)的1:1混合物中培養(yǎng)，直到進(jìn)行葡萄糖靈敏度實(shí)驗(yàn)。牛存力為了測試生存力，將胰島放入500μI體積的含有活/死熒光團(tuán)、Sytox(MolecularProbes,IμΜ)和I丐黃綠素(MolecularProbes,O.5μΜ)的L-15培養(yǎng)基中，并在37°C溫育約15-30分鐘。用由下述物質(zhì)(mM)組成的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗胰島137NaCl、2.7KC1、4.3Na2HP04和I.4KH2P04、pH7.4,并放入位于糖尿病研究實(shí)驗(yàn)室中的OlympusFluoview300共焦顯微鏡上的Attofluor室(MolecularProbes)中。使用40X或60X物鏡，獲取照片。在從培養(yǎng)基中取出胰島的20分鐘內(nèi)，收集所有照片。使用He:Ne和氬激光，收集每個(gè)胰島的3個(gè)同時(shí)照片和第三個(gè)明視野照片。如圖2所示，在僅4天以后，維持在培養(yǎng)物中的不論人的還是大鼠的大完整胰島(大于125μπι)通常表現(xiàn)出顯著百分比的壞死的(12.6%)和細(xì)胞凋亡的(6.3%)細(xì)胞，細(xì)胞死亡隨時(shí)間增加。更小的胰島(小于125μπι)表現(xiàn)出延長的生存力，但是在更晚的時(shí)間點(diǎn)(超過I周)仍然表現(xiàn)出急劇的細(xì)胞死亡。跟蹤這些小胰島的生存力最多I周，并發(fā)現(xiàn)，它們維持99-86%的高生存力百分比。這與10個(gè)完整的大胰島形成對比，所述大胰島在培養(yǎng)幾天以后具有下降至低于50%的生存力水平。如圖2所示，單個(gè)地分散的胰島細(xì)胞在培養(yǎng)物中維持與小完整胰島類似的高生存力特性。通過鑒別在所述視野中的胰島，并包圍目標(biāo)區(qū)域，完成活/死分析。從所有照片中減去背景熒光。通過使用Phot0Shop(Adobe)從目標(biāo)視野中形成色調(diào)直方圖，并計(jì)算綠色色調(diào)(活的)和紅色色調(diào)(死的)中的總像素，計(jì)算生存力百分比。將代表活細(xì)胞除以總胰島面積的比率計(jì)算為活的百分比值。使用Scion軟件計(jì)算胰島直徑和周長，使得可以根據(jù)胰島的大小分類生存力值。移棺研究還研究了胰島大小對移植成功的影響。在所述實(shí)驗(yàn)中，通過腹膜內(nèi)地注射鏈脲霉素(65mg/kg)(I次注射)，在受體動物中誘導(dǎo)糖尿病。當(dāng)血糖水平大于250mg/dl連續(xù)3天時(shí)，認(rèn)為大鼠患有糖尿病。用戊巴比妥45mg/kg麻醉大鼠。將大鼠剃毛并用聚維酮碘擦洗清潔以后，在左側(cè)腹上在體壁中制作切口。將腎遞送進(jìn)傷口中，并在腎囊中制作小切口。使用小內(nèi)徑移液器，將大或小胰島放在所述囊下面。將所述腎放回原始位置，并用創(chuàng)傷夾封閉切口。在胰島移植后3天，給受體施用牛/豬鋅-胰島素(NPI-IIletinI)注射劑(2次/天)，以減少高血糖癥對新移植的胰島的應(yīng)激。結(jié)束大的或小的大鼠胰島的移植(n=10移植/組)。鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病的DA大鼠在腎囊下接受大的(大于150μm)或小的(小于125μm)同源胰島的邊緣塊(1000IE)。監(jiān)測血糖水平8周。圖3(A)和3(B)顯示了來自每組的前5次移植的結(jié)果。所有大胰島受體在移植后保持高血糖(10/10)。相比而言，10個(gè)小胰島受體中的8個(gè)在移植后7-10天具有與正常水平接近或在正常水平的血糖水平，它們在整個(gè)8周時(shí)段內(nèi)保持正常。在移植后8周，從腎囊取出胰島移植物。固定所述組織，并關(guān)于胰島素進(jìn)行免疫標(biāo)記。圖4(左圖)顯示了來自接受小胰島移植的動物的移植物，并血糖正常持續(xù)8周。在所述移植物中，存在胰島素的大量染色。相比而言，圖4(右圖)顯示了接受大胰島移植的動物，所述動物繼續(xù)高血糖持續(xù)8周時(shí)段，并在所述移植物中幾乎沒有表現(xiàn)出胰島素的免疫T己O總之，前述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，更小的胰島(小于125μπι)在生存力、體內(nèi)功能試驗(yàn)和移植結(jié)果方面優(yōu)于大胰島(超過125μπι)。另外，小胰島的平均胰腺產(chǎn)率是大胰島的約3倍，且更小的胰島具有高大約20%的可存活性。最重要的是，當(dāng)移植進(jìn)糖尿病動物中時(shí)，小胰島遠(yuǎn)遠(yuǎn)勝過大胰島。實(shí)施例2:大胰島向單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇的轉(zhuǎn)化本實(shí)施例解釋了將完整胰島破碎或分散成小胰島細(xì)胞簇(諸如圖5所示的簇)和單個(gè)胰島細(xì)胞的方法。使用常規(guī)酶消化，建立圖6(A)中的小胰島細(xì)胞簇，而用分級的鈣清空形成圖6(B)中的小胰島細(xì)胞簇。如圖6(A)中的照片所解釋的，酶促分散會將所述胰島破碎成小胰島細(xì)胞簇，但是它不會“打開”所述簇，所以在所述簇內(nèi)部的細(xì)胞具有幾個(gè)細(xì)胞厚的擴(kuò)散屏障。相比而言，就使用鈣清空形成的小胰島細(xì)胞簇而言(圖6(B))，所述簇具有“打開的”形態(tài)學(xué)，所以當(dāng)小胰島細(xì)胞聚簇時(shí)，每個(gè)細(xì)胞具有更小的擴(kuò)散屏障。預(yù)見到，酶消化和鈣清空的組合也可以用于將完整胰島轉(zhuǎn)化成小胰島細(xì)胞簇，如圖6(C)所示。a.酶消化不同的酶混合液可以用于將完整胰島破碎成小胰島細(xì)胞簇和單個(gè)胰島細(xì)胞。示例性的酶消化方法參見美國專利號6，783，954，它通過引用并入。在該實(shí)例中，使用的12種酶混合液取得不同程度的成功，包括I種含有木瓜蛋白酶的混合液。為了分離胰島，通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮和賽拉嗪，麻醉Sprague-Dawley大鼠。暴露腹腔，并夾住與腸相連的胰腺導(dǎo)管。經(jīng)由膽總管，在原位給胰腺插入套管，并通過將冷的膠原酶溶液抽入導(dǎo)管中進(jìn)行擴(kuò)張。隨后，切離擴(kuò)張的胰腺，轉(zhuǎn)移至離心管，并在輕輕翻轉(zhuǎn)下在37°C溫育約30分鐘。使洗過的消化物穿過篩，并在冷凍離心機(jī)中沉降。將沉淀物與Histopaque(密度=1.1085,SigmaDiagnosticsInc.,St.Louis,MO)相混合，并離心。然后將胰島放入含有10%胎牛血清的Ham氏F12培養(yǎng)基中，并放入含有5%C02的37°C培養(yǎng)室中。β細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)方案包括在含有4.8mMHepes的Hanks平衡鹽溶液(“HBSS”)中溫育完整胰島(使用本文所述的技術(shù)分離)。參見Balamurugan等人，F(xiàn)lexiblemanagementofenzymaticdigestionimproveshumanisletisolationoutcomefromsub-optimaldonorpancreata.Am.J.Transplant3(9):113542(2003)。對于酶消化，將最后的9ml含有Iml木瓜蛋白酶(50單位/ml)的Hanks平衡鹽溶液加入所述胰島中。先用移液器輕輕上下抽吸胰島，以確保完全沖洗。使胰島沉降至試管的底部，并取出大部分上清液。在37°C緩慢地旋轉(zhuǎn)在所述酶中的胰島(約IOrpm)約30分鐘。在此時(shí)，一些單個(gè)的分散的細(xì)胞形成小胰島簇，并從所述溶液中取出。通常，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至作為最終培養(yǎng)基的CMRL1066或MemphisSMF中。用雙硫腙對細(xì)胞染色，用鑒別在所述簇內(nèi)的β細(xì)胞，如圖5和6(A)(酶)通常所/Jnοb.基于金屬的破碎使用基于金屬的破碎方案，也可以將完整胰島破碎成小胰島細(xì)胞簇和單個(gè)胰·島細(xì)胞?；诮饘俚钠扑榈牧钊烁信d趣的發(fā)現(xiàn)是，得到的小胰島細(xì)胞簇具有更低的緊湊性，或具有“打開的”形態(tài)學(xué)。細(xì)胞粘附分子(諸如E-鈣粘著蛋白)會將所述胰島保持在一起，但是需要二價(jià)金屬才能發(fā)揮功能。參見Hauge-Evans等人，Pancreaticbeta-cell-to—beta—cellinteractionsarerequiredforintegratedresponsestonutrientstimuli:enhancedCa2+andinsulinsecretoryresponsesofMIN6pseudoislets,Diabetes48(7):1402-8(1999)。因而，在無鈣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胰島約I小時(shí)，會產(chǎn)生“松散的”且破碎的胰島結(jié)構(gòu)(參見圖6(B))，與此相比，使用單獨(dú)的酶會產(chǎn)生更密集的胰島結(jié)構(gòu)(參見圖6(A))。此外，在使用鈣清空“松散”所述胰島以后，剩余的β細(xì)胞簇可被傳統(tǒng)的酶更容易地分散(參見圖6(C))。基于金屬的破碎的細(xì)節(jié)如下。為了得到單個(gè)胰島細(xì)胞和小胰島細(xì)胞簇，將胰島放入不含鈣-鎂的Hanks平衡鹽溶液+4.8mMHepes中。在約37°C溫育約30分鐘以后，移出細(xì)胞，將它們分散成小胰島細(xì)胞簇或單個(gè)細(xì)胞。將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至作為最終培養(yǎng)基的CMRL1066。在必要時(shí),用雙硫腙鑒別小胰島細(xì)胞簇或β細(xì)胞。參見Mythili等人，Culturepriortotransplantationpreservestheultrastructuralintegrityofmonkeypancreaticislets,J.ElectronMicrosc.(Tokyo)52(4):399-405(2003)。如圖6(B)所示，通過單獨(dú)的鈣清空衍生出的小胰島細(xì)胞簇具有不規(guī)則的管狀排列，這對于簇核心的灌注而言可能是最佳的。另外，從基于金屬的分散衍生出的簇僅需要約I小時(shí)即可生成，而酶破碎方案需要最多48小時(shí)。c.酶消化和金屬分散的組合還使用酶消化和金屬清空的組合作為分散技術(shù)，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。用9ml漢克平衡鹽溶液(不含有鈣或鎂，含有4.8mMHepes)沖洗完整的胰島。先用移液器輕輕上下抽吸胰島，以確保完全沖洗。使胰島沉降至試管的底部，并取出大部分上清液。重復(fù)地洗滌胰島，以去除所有鈣和鎂。將最后的9ml不含有鈣和鎂的漢克平衡鹽溶液(含有Iml木瓜蛋白酶(50單位/ml))加給所述胰島。緩慢地旋轉(zhuǎn)(IOrpm)在所述酶中的胰島30分鐘。在此時(shí),可以從所述溶液中取出小胰島簇。在中等速度強(qiáng)烈地抽吸2-3次，產(chǎn)生單個(gè)細(xì)胞。在1500相對離心力、25°C離心細(xì)胞5分鐘。使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(取決于隨后的試驗(yàn))，重新懸浮單個(gè)細(xì)胞。在37°C和5%C02，在培養(yǎng)箱中儲存細(xì)胞。如圖6(C)所示，酶和鈣清空方法的組合產(chǎn)生小胰島細(xì)胞簇或單個(gè)細(xì)胞。此外，所述組合是總體上更快的分散方案，但是必須小心地避免過度消化和損傷細(xì)胞。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用Y0-PR0-1和碘化丙唳(VibrantApoptotic試驗(yàn)，MolecularProbes)來測定壞死的和細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。對于所述試驗(yàn),將細(xì)胞與PBS—起放入OlympusFluoview300激光共焦顯微鏡上的Attofluor室(MolecularProbes)中。在從培養(yǎng)基取出細(xì)胞20分鐘內(nèi)，收集所有照片。使用He:Ne和氬激光，收集每個(gè)胰島的3個(gè)同時(shí)照片和第三個(gè)明視野照片。通過使用透射光鑒別所述視野中的細(xì)胞，完成活/死分析。綠色的細(xì)胞指示細(xì)胞凋亡，而黃色/紅色指示壞死性細(xì)胞死亡。缺少熒光發(fā)射的細(xì)胞是活細(xì)胞。將熒光照片與透射光照片(灰色)疊加。實(shí)施例3:將單個(gè)胰島細(xì)胞和小胰島簇制備在貼劑生物材料支架上前述實(shí)施例指示，小胰島細(xì)胞簇和甚至單個(gè)β細(xì)胞應(yīng)當(dāng)代表用于運(yùn)輸氧、葡萄糖等的最高可實(shí)現(xiàn)的自由表面積。因而，在該實(shí)施例中，將單個(gè)胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇模板化在生物材料支架材料(諸如在圖7中一般地顯示的貼劑)上，以形成胰島細(xì)胞多層。支架材料的篩選在該實(shí)施例中，通過測量所述胰島細(xì)胞向所述生物材料的相對附著，研究了可用于制備本發(fā)明的支架的不同生物材料的優(yōu)化。優(yōu)選地，所述支架材料易于操縱，無需將所述組織和生物材料解離以實(shí)現(xiàn)容易的植入。表I解釋了為與β細(xì)胞的相互作用而選擇的多種生物材料。這些材料中的幾種具有作為植入物的使用歷史。在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中，首先制備列出的生物材料的1%儲備溶液。將大多數(shù)材料溶解于在中性pH的去離子水中。聚氨基葡糖需要約5.5的更低pH來溶解(使用鹽酸)，其它材料需要有機(jī)溶劑；例如在乙醇中的Cellform和在二氯甲烷中的聚(DL-乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)。通常可溶于水中的聚合物(例如硫酸葡聚糖、海藻酸鹽等)可以交聯(lián)，以形成膜基質(zhì)。將大約25μL的每種儲備溶液加入96-孔平板的3個(gè)單個(gè)孔中，并蒸發(fā)或真空干燥，從而將薄生物材料膜沉積在每個(gè)孔的底部。殘余的溶劑含量是微量的，不會在細(xì)胞中誘導(dǎo)毒性。還為細(xì)胞附著預(yù)篩選幾種蛋白，所述蛋白可商業(yè)化地提供來促進(jìn)在孔板上的細(xì)胞附著(例如纖連蛋白、層粘連蛋白等)。在96-孔平板中溫育β細(xì)胞的稀釋懸浮液過夜，并洗滌3次，以去除未結(jié)合的β細(xì)胞。β細(xì)胞懸浮液是均勻的，并假定每個(gè)孔中的相同的等分試樣含有類似量的β細(xì)胞。將所有細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為來自不包括生物材料膜的孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)。一般而言，輕度疏水的聚合物較好地附著β細(xì)胞(表I)。表I:選擇的生物材料的相對β細(xì)胞附著生物材料相對細(xì)胞附著空孔(對照)I50:50PLGA羧基Mw=5.5kDa9.8+0.9層粘連蛋白8.7+0.6硫酸葡聚糖Mw=500kDa7.4+3.050:50PLGA-甲基酉旨iv=0.31dL/g6.8+0.7聚乙烯吡咯烷酮5.8+1.2硫酸葡聚糖MW=8kDa5.4+1.050:50PLGA-甲基酉旨iv=0.9dL/g5.2+0.850:50PLGA-甲基酉旨iv=0.58dL/g4.4+0.7Pluronic4.0+1.550:50PLGA-羧基iv=0.12dL/g3.9+0.7聚乙烯亞胺Mw=25kDa3.8+0.2纖連蛋白3.7+0.7PEG丙烯酸酯3.1+0.5聚氨基葡糖Mw=15kDa3.1±0.I膠原IV2.9+1.4PEGMw=8kDa2.8+1.I海藻酸鹽2.4+1.2明膠2.0+0.2肝素I.7±0.2CellformI.7+0.7聚氨基葡糖Mw=IOOkDaI.5±0.7聚乙烯亞胺Mw=800Da1.2+1.0聚乙烯卩比略燒酮n.d.聚(乙烯醇)n.d.聚(丙烯酸)iV=固有粘度通過在涂布生物材料并洗滌3次以后24小時(shí)計(jì)數(shù)附著的細(xì)胞的數(shù)目，測定細(xì)胞附著。使用下述計(jì)算式，將所述計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為附著于缺少生物材料的孔底部(參見空孔、對照)上的細(xì)胞的數(shù)目在目標(biāo)孔中附著的細(xì)胞的數(shù)目/在空孔中的細(xì)胞的數(shù)目。一式三份地重復(fù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)。一般而言，輕度疏水的聚合物較好地附著β細(xì)胞。光學(xué)顯微照片指示，細(xì)胞形態(tài)學(xué)也受所述生物材料的影響。在聚氨基葡糖(MW=IOOkDa)上的β細(xì)胞表現(xiàn)出光滑的、圓形的表面，而在層粘連蛋白上的β細(xì)胞表現(xiàn)出伸展的且波緣的形態(tài)學(xué)(參見圖8)。在層粘連蛋白基質(zhì)上的β細(xì)胞中的肌動蛋白的熒光染色，強(qiáng)烈地揭示熒光細(xì)胞骨架焦點(diǎn)，這提示牢固的細(xì)胞附著。胰島細(xì)胞貼劑的制備在該實(shí)施例中，所述胰島細(xì)胞結(jié)合到包含PLGA的生物材料支架貼劑上。在血管化的膜島中，平均β細(xì)胞距離血管不超過約25μm。參見Wayland,Microcirculationinpancreaticfunction,Microsc.Res.Tech.37(5-6):418-33(1997)。因?yàn)棣录?xì)胞具有約IOym的直徑，預(yù)期約3個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞層厚度會最準(zhǔn)確地模仿天然β細(xì)胞環(huán)境。一般而言，如以前所述，從大鼠胰腺分離出胰島，并分散成單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞簇。將在HBSS培養(yǎng)基(O.5ml)中的胰島細(xì)胞和小胰島細(xì)胞簇加入每個(gè)孔中，并在生物材料上培養(yǎng)3-4小時(shí)。將在孔中含有生物聚合物的平板在室溫在約3500rpm離心約10分鐘，以輔助所述細(xì)胞附著生物聚合物。從每個(gè)孔取出一半培養(yǎng)基，用含有新鮮胰島細(xì)胞或小胰島細(xì)胞簇懸浮液的培養(yǎng)基替換，并進(jìn)行附著(通過重力或通過離心)。這重復(fù)3次。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖9所示。與未經(jīng)過離心的在聚合物上的細(xì)胞培養(yǎng)物相比，當(dāng)使用離心方法時(shí)，在重復(fù)的洗滌以后，可以將額外的胰島細(xì)胞層附著于聚合物貼劑上。在重復(fù)的培養(yǎng)基更換下，約3-5個(gè)細(xì)胞層在O.58dL/g(在HFIP中)或O.9dL/g聚合物保持一致地附著于50:50PLGA。為了控制β細(xì)胞層的厚度，可以控制在重復(fù)的沉積循環(huán)中加入每個(gè)孔中的細(xì)胞培養(yǎng)物的體積和/或加入每個(gè)孔中的等分試樣的數(shù)目。實(shí)施例4:在生物材料支架上的胰島細(xì)胞的預(yù)示性測試在該實(shí)施例中，進(jìn)一步研究了具有與其相連的胰島細(xì)胞多層的生物材料貼劑。將進(jìn)行生存力測量和胰島素生產(chǎn)試驗(yàn)。另外，將研究作為用于治療糖尿病的可植入裝置的裝置。牛存力測量。如以前所沭,講行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和壞死實(shí)驗(yàn)的對比。在第0、1、3、7、14和30天，計(jì)算3個(gè)樣品的每個(gè)β細(xì)胞層的橫斷面積的活細(xì)胞百分比，用于與天然胰島進(jìn)行對比。將數(shù)據(jù)繪制為可存活細(xì)胞的百分比相對于時(shí)間，我們將使用t-檢驗(yàn)確定不同數(shù)目的β細(xì)胞層的生存力趨勢之間是否存在統(tǒng)計(jì)上顯著的差異。另外，記錄歸因于壞死或細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡的百分比。胰島素牛產(chǎn)試驗(yàn)。使用靜Ih溫育(ELISA)，在低葡萄糖(3mM)、高葡萄糖(30mM)和高葡萄糖/去極化(25mMK+)條件下(Dean1989)，測量胰島素生產(chǎn)。在37°C和5%C02，用新鮮培養(yǎng)基預(yù)溫育在12-孔平板中的每個(gè)孔。對于實(shí)驗(yàn)測量，在含有3或30mM葡萄糖的新鮮培養(yǎng)基中溫育不同的β細(xì)胞貼劑2小時(shí)。在30mM葡萄糖(含有25mMKCl和適當(dāng)?shù)剡€原的NaCl)中，溫育一個(gè)額外的孔組。對于測試的每種條件，一式三份地評價(jià)每種貼劑類型。使用ELISA免疫測定，測定培養(yǎng)基樣品的胰島素含量。將結(jié)果表示為一式三份樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并使用t-檢驗(yàn)對比統(tǒng)計(jì)顯著性。MacGregor等人，Smallratisletsaresuperiortolargeisletsininvitrofunctionandintransplantationoutcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.290(5);E771-779(2006)。貼齊l|和胰島的棺入。在成年受體糖尿病抗件的BioBreeding(DRBB)Worcester大鼠中誘導(dǎo)的糖尿病是與人類的I型糖尿病平行的自身免疫糖尿病模型。4周齡大鼠購自BiomedicalResearchModels,Inc,將動物隨機(jī)地分成2組貼劑受體和胰島受體(每組6只)。對于糖尿病的誘導(dǎo)，用抗-RT6單克隆抗體(DS4.23雜交瘤(由馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的DaleL.Greiner博士友情提供；2ml組織培養(yǎng)基，每周注射5次))和非特異性的免疫系統(tǒng)活化劑聚I:C(Sigma;5ug/g體重，每周注射3次)的組合治療DRBB大鼠。在3-周時(shí)段內(nèi)施用注射劑。在重復(fù)的高血糖癥(血糖水平>250mg/dl連續(xù)3天)當(dāng)天，認(rèn)為動物患有糖尿病，并中斷治療(Semis2004)。使用該方法，95%的大鼠在第3周結(jié)束之前變成糖尿病患者。在腎囊下植入β細(xì)胞貼劑和胰島。DA(DarkAgouti)大鼠充當(dāng)β細(xì)胞供體。用戊巴比妥(45mg/kg)麻醉大鼠，并將腎遞送進(jìn)在左側(cè)腹在體壁中制作的切口中。在腎囊中制作適當(dāng)?shù)那锌?，并將β?xì)胞貼劑放在所述囊下面。植入最小4個(gè)含有不同的生物材料和/或細(xì)胞層厚度的貼劑。胰島植入物通常需要更小的切口和穿過小內(nèi)徑移液器的輸注。受體組將接受1000或2000ΙΕ胰島用于移植或在貼劑基質(zhì)上的當(dāng)量β細(xì)胞。如果移植成功必需的最少胰島(1000ΙΕ)并與更高的胰島體積(2000ΙΕ)相對比，性能的顯著改善(貼劑類型相對于胰島)應(yīng)當(dāng)是可檢測的。在胰島移植后，施用牛/豬鋅-胰島素(NPHIletinI)注射劑(2次/天)3天，以減少高血糖癥的應(yīng)激。血糖過多的體內(nèi)測定。監(jiān)測大鼠的血糖4周，以測定貼劑或胰島植入物是否可以誘導(dǎo)血糖正常。在動物的血糖控制以后，每天進(jìn)行血糖測量。通過在前3周每天從尾巴獲得血液樣品，然后使用Freestyle葡萄糖計(jì)(TheraSense)每周測量2次,監(jiān)測血糖水平。通常，在胰島移植的24小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)糖尿病的反轉(zhuǎn)，使用貼劑會得到類似的結(jié)果。外植的β細(xì)胞貼劑的分析。在14或30天以后，取回貼劑或胰島，用于免疫染色(胰島素和胰高血糖素)、生存力測量和細(xì)胞凋亡的檢測。在某些情況下，在分析之前，達(dá)到血糖正常的大鼠維持8周。使用針對胰島素和胰高血糖素的抗體，完成在所述切片上的免疫組織化學(xué)。使用比色測量分析，處理照片，以測定每種染料陽性的橫截面積。制備并分析陰性對照載玻片。最初，我們使用雙硫腙染料來鑒別β細(xì)胞。使用末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP切口-末端標(biāo)記(TUNEL)試驗(yàn)，進(jìn)行DNA-碎片裂，其指示細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。如我們以前所做的，將貼劑或胰島制備在石蠟中，用于使用10%福爾馬林的組織學(xué)。使用TUNEL試劑盒(原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒，RocheDiagnostics)來標(biāo)記組織切片。由不知情的研究人員分析貼劑和胰島的TUNEL+細(xì)胞的數(shù)目和分布。將組織切片的照片重構(gòu)成胰島的完整3D照片。以此方式，可以鑒別在單個(gè)胰島中的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。用蘇木素對切片復(fù)染色，并在光學(xué)顯微鏡下顯影。為了鑒別在所述胰島內(nèi)的胰島素分泌細(xì)胞，使用抗-胰島素抗體來標(biāo)記樣品，并用羅丹明第二抗體進(jìn)行檢測。我們預(yù)期在移植后收集最小10個(gè)胰島/大鼠，用于細(xì)胞凋亡分析。在必要時(shí)制備陰性對照載玻片。除了TUNEL分析以夕卜，將貼劑固定，用于隨后的使用核心顯微術(shù)設(shè)備的電子顯微術(shù)。以此方式，鑒別β細(xì)胞層和浸潤細(xì)胞。實(shí)施例5:使用微型模具制備最佳地設(shè)定大小的細(xì)胞在該實(shí)施例中，開發(fā)和設(shè)計(jì)了用于再聚集細(xì)胞的額外裝置，并描述了用于制備微型模具的方法，所述微型模具具有蝕刻在基質(zhì)表面中的多個(gè)單個(gè)的凹坑。一般而言，將胰腺破碎成天然大胰島(大于150μπι)和天然小胰島(小于125μm)。分離大和小胰島，并將小胰島放入培養(yǎng)物中(在有些實(shí)施方案中，所述小胰島培養(yǎng)物在以后加回再聚集的胰島)。將大天然胰島分散成單細(xì)胞懸浮液，并使其沉降在所述微型模具中。通過加載進(jìn)微型模具中的細(xì)胞的數(shù)目，可以操縱生產(chǎn)的胰島的大小。取決于細(xì)胞懸浮液，通常20-100(+/-20%)個(gè)細(xì)胞會落入每個(gè)凹坑中以彼此結(jié)合，形成新的再聚集的小胰島。在促進(jìn)形成類似于天然小胰島的3D結(jié)構(gòu)的條件下，培養(yǎng)在單個(gè)凹坑中的單個(gè)細(xì)胞，其中再聚集的胰島的大小和形狀受所述凹坑的大小和形狀的影響。通過濃縮來改變在所述凹坑中的細(xì)胞的數(shù)目(通過測定懸浮液中的細(xì)胞密度)的能力，允許我們生產(chǎn)非常小的(小于30μm)或中等尺寸的(50-90μm)再聚集的胰島。當(dāng)形成其它3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如用于化學(xué)療法測試的微型腫瘤)時(shí)，該控制可能被證實(shí)是重要的。不同于上面實(shí)施例3的生物材料支架貼劑，在該實(shí)施例中描述的凹坑化的微型模具不需要細(xì)胞附著于基質(zhì)表面。如下面討論的，將再聚集在微型模具中的胰島細(xì)胞最佳地設(shè)定大小，并通過高生存力百分比和高胰島素分泌水平來表征從微型模具衍生出的可存活的細(xì)胞群。微型模具的開發(fā)作為再聚集物理環(huán)境的凹坑。在使單個(gè)細(xì)胞再聚集體成最佳地設(shè)定大小的小胰島的工作中，我們假定，在物理受限的環(huán)境中形成胰島，會引導(dǎo)在再聚集過程中的細(xì)胞團(tuán)的形狀。為此，我們確定，最佳的再聚集物理環(huán)境會與希望的細(xì)胞終產(chǎn)物的形狀和大小類似。在我們的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的尺寸范圍(100μπι直徑和60μπι深度)對于生產(chǎn)直徑小于50μπι(平均而言)的再聚集的胰島而言是最佳的。60μπι深度允許容易地取回再聚集的胰島，無需將它們破碎成更小的碎片。在每個(gè)再聚集環(huán)境中的圓形底部會弓丨導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)再聚集成大致球形的形狀。我們將具有指定的尺寸(包括圓形底部)的這些再聚集物理環(huán)境稱作“凹坑”。所述凹坑的尺寸和布局可以根據(jù)用戶的需要而變化。微型模具設(shè)計(jì)。在制備最佳地設(shè)定大小的小胰島群體的工作中，我們設(shè)計(jì)了一種微型模具，所述微型模具具有包含眾多凹坑的表面。在該微型模具中的凹坑的尺寸和它們在所述微型模具內(nèi)相對于彼此的空間關(guān)系由用戶指定。使用AutoCAD軟件來建立所述微型模具的電子模板。所述模板描繪了在模具表面上的凹坑的大小、形狀和分布。具有凹坑的基質(zhì)設(shè)置在更大的外殼內(nèi)，所述外殼能夠無泄漏地容納液體，在本文中也稱作模具外殼(圖10)。所述微型模具和在所述微型模具內(nèi)的凹坑的尺寸可以根據(jù)用戶的需要而變化。例如，如果目標(biāo)是使用所述模具進(jìn)行藥物試驗(yàn)，可以測試更大的和/或更深的凹坑，從而在每個(gè)凹坑中容納更大體積的測試化合物。如果目標(biāo)細(xì)胞不是胰島，可以以其它方式指定所述凹坑的尺寸，以滿足目標(biāo)細(xì)胞類型的最佳再聚集或生長標(biāo)準(zhǔn)。具有凹坑的表面的基質(zhì)。當(dāng)選擇基質(zhì)時(shí)，存在幾種重要的物理性質(zhì)。就使用緩沖的氫氟(HF)酸溶液的濕法蝕刻而言，使用基于二氧化硅(SiO2)的物質(zhì)是優(yōu)選的。HF酸通過與SiO2分子反應(yīng)而蝕刻基質(zhì)。另外，就所述微型模具的體外應(yīng)用而言，優(yōu)選地選擇細(xì)胞不會附著的基質(zhì)，從而允許從凹坑更容易地去除再聚集的胰島。透明基質(zhì)允許在顯微鏡下觀察在凹坑內(nèi)的內(nèi)容物，不必轉(zhuǎn)移至另一個(gè)平板上?？蓽缇幕|(zhì)會提供可重復(fù)使用的模具。選擇玻璃作為不可植入的微型模具的理想基質(zhì)，因?yàn)樗鼤憩F(xiàn)出所有這些特征。另外，用戶可以在生產(chǎn)過程中指定玻璃的厚度和尺寸，這允許進(jìn)一步定制微型模具。玻璃也會提供低成本的解決方案，但是，該材料不是可植入的。為了開發(fā)模具外殼，所述基質(zhì)的幾種性質(zhì)是必要的。選擇用于構(gòu)建模具外殼的材料應(yīng)當(dāng)具有根據(jù)用戶規(guī)范進(jìn)行塑造的能力。這意味著，它開始時(shí)是作為可以倒入模具中的液體，并隨著時(shí)間和溫度進(jìn)行設(shè)定，以形成包圍蝕刻的基質(zhì)的固體部件。所述聚合物優(yōu)選地是可滅菌的。它通常是疏水的，以防止液體滲漏出模具。Sylgard184聚二甲基硅氧烷(PDMS)理想地用于這些模具。它可以被滅菌，是疏水的，可以容易地倒入模具中，并固化成固體產(chǎn)物。另外，它可以在-45至200°C的溫度范圍內(nèi)長時(shí)間地使用，允許冷凍和蒸汽滅菌。PDMS具有約2小時(shí)的工作時(shí)間，然后可以在室溫固化(約48小時(shí))或熱固化(最高到大約200°C)。滿足生產(chǎn)規(guī)范的PDMS具有粘附玻璃基質(zhì)的能力，這會進(jìn)一步保護(hù)免于模具中的液體的泄漏(Mata等人，2005)。用玻璃和PDMS設(shè)計(jì)的微型模具具體地設(shè)計(jì)成用于體外實(shí)驗(yàn)，且不適用于體內(nèi)用途。下面描述了用于體內(nèi)目的的可植入的模具，它們不使用光刻技術(shù)，而是通過首先制備負(fù)印章來生產(chǎn)。迄今制備的微型模具原型由玻璃基質(zhì)構(gòu)成，在所述玻璃基質(zhì)中蝕刻出凹坑?？梢郧懈畎伎踊|(zhì)，以滿足用戶的需要。例如，可以將基質(zhì)切割成標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡載玻片的大小。在迄今制備的一個(gè)原型中，將堿石灰玻璃基質(zhì)切成33_直徑和3mm厚的圓形?；|(zhì)表面的制備。用氮?dú)馇鍧嵰伎踊幕|(zhì)的表面，以去除大顆粒。使用酸和堿洗液(piranhasolution)來深度清潔基質(zhì)，以去除有機(jī)化合物和可能干擾金屬沉積和光刻的物質(zhì)。隨后，將所述基質(zhì)烘烤30-60分鐘。技術(shù)人員可以使用其它方法來從表面基質(zhì)去除大顆粒和有機(jī)化合物。清潔基質(zhì)表面以后，使用Lesker薄膜沉積系統(tǒng)將金屬層(300nm鉻)飛濺在基質(zhì)上。用于將薄金屬層施加于基質(zhì)上的替代技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且可以使用。光刻技術(shù)。使用旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)(BrewerCEE100可編程的旋轉(zhuǎn)涂布機(jī))，將AZ1518正性光刻膠(Iml)涂層施用于沉積的金屬的上面。將所述旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)設(shè)定成產(chǎn)生I.8微米光刻膠層，然后在100°C軟烘烤2分鐘。冷卻后，將具有光掩模的玻璃暴露于紫外線(ABMUVFlood&MaskAlignmentSystem)4秒，隨后在AZ300MIF顯影劑中浸泡30秒。輕輕搖動基質(zhì)。然后在100°c烘烤基質(zhì)8-10分鐘。隨后如下將在光刻膠中顯影的圖案蝕刻進(jìn)鉻層中將它浸泡在CR7S鉻蝕刻劑中，并攪拌，以輔助蝕刻工藝。需要浸泡30-45秒才能使照片出現(xiàn)。用水輕輕洗滌所述基質(zhì)，并用氮干燥，以準(zhǔn)備用于濕法蝕刻工藝。這產(chǎn)生一塊具有鉻層和光刻膠層的玻璃，其在表面上含有開放的斑點(diǎn)，在所述斑點(diǎn)中不存在鉻或光刻膠。這些未掩模的斑點(diǎn)將玻璃表面暴露于濕法蝕刻工藝，而被鉻和光刻膠覆蓋的區(qū)域會保護(hù)玻璃表面免于蝕刻溶液。這會導(dǎo)致在未掩模區(qū)域中蝕刻凹坑。濕法蝕刻在20:14:66比率的HF=HNO3=H2O溶液中完成。將基質(zhì)在溶液中浸泡18分鐘，同時(shí)放在低速定軌搖床上。在該浸泡期間，酸通過與SiO2反應(yīng)而蝕刻玻璃，從而溶解未被鉻和光刻膠掩模覆蓋的可見玻璃部分，這會在所述表面上產(chǎn)生均勻的凹坑(圖11)。該溶液會產(chǎn)生4-5μm深度/分鐘的大約蝕刻速率(取決于溶液的新鮮度)。在定軌搖床上振蕩會確保表面的均勻蝕刻。隨后在碳酸鈣中、然后在水中洗滌所述基質(zhì)，以中和和去除多余的酸，并最后用氮干燥。如果多余的鉻保留在基質(zhì)上，需要另外在鉻蝕刻劑中浸泡并用丙酮和水洗滌，以去除任何殘余物。最后，用氮干燥基質(zhì)。使用面形測定器，測量凹坑深度和直徑(圖12)。在迄今制備的原型中，凹坑大小的變異性尚未成為問題；原型凹坑測得指定尺寸的±10%。我們預(yù)見到可以用于制備模具的2種其它預(yù)示方法SU-8負(fù)模在該實(shí)施方案中，再次使用玻璃作為基質(zhì)。所述玻璃經(jīng)歷與以前類似的光刻工藝，但是改變了原始設(shè)計(jì)，以建立負(fù)模板模具，其然后可以轉(zhuǎn)換成微型模具，但是將列出的生物聚合物之一倒在印章上，并使它固化。簡而言之，將SU-8光刻膠旋轉(zhuǎn)涂布成厚層(層厚度應(yīng)當(dāng)?shù)扔诎伎拥睦硐肷疃?。然后將它軟烘烤，用光掩模覆蓋(如上所述)，并暴露于紫外線，在暴露后再次烘烤，在SU-8顯影劑中顯影，并最后暴露于顯影后烘烤。這會產(chǎn)生一塊具有凹坑負(fù)突出(基于設(shè)計(jì)規(guī)范)的玻璃。該負(fù)模板然后用于在給定的生物聚合物或PDMS中澆鑄模具，其中在固化后建立模具印痕。然后從固化聚合物中取出印章。完成的聚合物類似于PDMS/玻璃微型模具，且具有確定尺寸的凹坑。該操作的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，對于藥物試驗(yàn)或其它用途而言，可以在設(shè)計(jì)步驟中用唯一標(biāo)識符(例如，文字、數(shù)字)標(biāo)記每個(gè)凹坑，并在完成的模具中呈現(xiàn)為每個(gè)凹坑的可見印痕(參見圖28)。在生產(chǎn)商的加工指南(SU-82000-PermanentEpoxyNegativePhotoresist,MicroChem,Newton,MA)中描述了一種更詳細(xì)的工藝。蝕刻的金屬負(fù)模在該實(shí)施方案中，使用金屬澆鑄模具，制備聚合物模具。通過在CAD軟件中設(shè)計(jì)3-D模型，可以生產(chǎn)金屬鑄件。在圖27中提供了一種可能的設(shè)計(jì)。用激光蝕刻金屬，以建立與上述的SU-8模具類似的澆鑄模具。將聚合物倒在金屬鑄件上，并固化，以建立新的微型模具。另外，如果必要的話，可以將文字或數(shù)字整合進(jìn)3-D模型中，以標(biāo)記上述的每個(gè)凹坑，剩下可見的印痕。使SU-8和蝕刻的金屬模板顯影，以實(shí)現(xiàn)從用于體外和體內(nèi)用途的給定材料生產(chǎn)模具的方法。更具體地，這些方法可以使用生物聚合物來制備可以植入的模具。這些方法還應(yīng)當(dāng)允許更詳細(xì)的設(shè)計(jì)(諸如凹坑標(biāo)記)和在凹坑制備、形狀和大小方面的更多控制(凹坑測量的變異性應(yīng)當(dāng)小于指定尺寸的±1%)。具有凹坑的基質(zhì)的外殼的構(gòu)建。構(gòu)建所述微型模具的下一步是，開發(fā)一個(gè)系統(tǒng)，在所述系統(tǒng)中將放置和固定具有凹坑的表面，并充當(dāng)用于培養(yǎng)的更大容器(參見圖10中的PDMS“外殼”)。使用DowCorningSylgard184聚二甲基硅氧烷(PDMS)，構(gòu)建模具外殼的基底[6]和垂直壁[5](圖13)。在50ml離心管中，以10份基質(zhì):I份固化劑的比率混合PDMS(約2小時(shí)工作時(shí)間)。將所述試管混合均勻，以徹底分散基質(zhì)和固化劑。在該過程中，可以使用渦旋來輔助混合。在1000-1500rpm離心PDMSl分鐘，以去除空氣泡。除了PDMS以外的材料可以用于構(gòu)建適合微型模具的外殼。例如，適合微型模具(意圖用于多次使用的體外用途)的材料包括、但不限于用具有凹坑的表面形成要植入的微型模具(體內(nèi)用途)，并用生物聚合物形成模具的側(cè)壁。但是，側(cè)壁的高度是最小的，且可以在移植之前去除，以減少移植材料的總體積。適合意圖用于體內(nèi)用途的微型模具的材料包括，但不限于聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(磷酸酯)、聚(磷腈)和其它。其它非限制性的材料包括，例如，多糖、聚酯(諸如聚(乳酸)、聚(L-賴氨酸)、聚(羥乙酸)和聚(乳酸-共聚-羥乙酸))、聚(乳酸-共聚-賴氨酸)、聚(乳酸-接枝-賴氨酸)、聚酸酐(諸如聚(脂肪酸二聚體)、聚(富馬酸)、聚(癸二酸)、聚(羧基苯氧基丙烷)、聚(羧基苯氧基己烷)、這些單體的共聚物等等)、聚(酸酐-共聚-酰亞胺)、聚(酰胺)、聚(原酸酯)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚氨酯、聚(有機(jī)磷腈)、聚(磷酸酯)、聚(乙烯醋酸乙烯酯)和其它?；〈拇姿崂w維素和它們的衍生物、聚(己內(nèi)酯)、聚(碳酸酯)、聚(氨基酸)、聚(丙烯酸酯)、聚縮醛、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(苯乙烯)、聚(氯乙烯)、聚(氟乙烯)、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸酯化的聚烯烴、聚氧化乙烯、共聚物、聚苯乙烯和它們的混合物或共聚物)。在某些優(yōu)選的方面，生物材料包括多糖、海藻酸鹽、羥丙基纖維素(HPC)、N異丙基丙烯酰胺(NIPA)、聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亞胺、聚氨基葡糖(CS)、甲殼質(zhì)、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸軟骨素、明膠等和它們的衍生物、共聚物及混合物。其它合適的生物材料包括在下述文獻(xiàn)中描述的那些尼龍、透明質(zhì)燒、聚四氟乙烯、聚乙烯基甲酰胺和其它材料Vats等人，(2003);ffang等人，(1997)；和Orive等人,(2003)。使用銅支架，形成模具外殼的形狀(圖13)。將一個(gè)大銅管(I.75英寸直徑)[I]開口側(cè)向下地放置在扁平的表面[4](例如，包裝在鋁箔中的大玻璃正方形)上。將PDMS加至管開口的中心至2_的深度，以形成模具外殼的基底[6]。然后在烘箱中在100°C烘烤整個(gè)結(jié)構(gòu)45分鐘。在烘烤以后，將具有凹坑的基質(zhì)凹坑側(cè)向上地放置在位于固化的PDMS基底[6]上面的銅管(斜線描繪了蝕刻的玻璃[4]相對于大銅管的位置)的中央。將小量PDMS加至具有凹坑的基質(zhì)的邊緣，以將它固定在固化的PDMS基底[6]的中央。然后在100°c烘烤該結(jié)構(gòu)30分鐘。將小銅管[2](I英寸直徑)安置在蝕刻的基質(zhì)的上面中心處，并將PDMS倒入大[I]和小[2]銅管之間的間隙中。小心地進(jìn)行該步驟，以避免PDMS飛濺到模具的中心中。倒入大[I]和小[2]銅管之間的間隙中的PDMS的量決定了模具外殼[5]的高度。模具外殼的高度和寬度可以由用戶指定。然后在100°C烘烤所述微型模具(包括銅外殼支架)過夜(至少12小時(shí))，以完全固化PDMS。在過夜烘烤以后，如下去除銅支架機(jī)構(gòu)。冷卻整個(gè)結(jié)構(gòu)[1-7]，以使PDMS收縮，從而允許從銅管支架去除模具。冷卻所需的確切時(shí)間取決于溫度；在_201時(shí)，30-60分鐘是足夠的。小心地取下底部箔/玻璃層[4]和小銅管[2]。接著，從所述微型模具分離大銅管[I]。微型模具的滅菌。優(yōu)選地，本發(fā)明的含有凹坑的表面能夠被滅菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)完成的微型模具不具有臺架時(shí)，在必要時(shí)可以將它洗滌并滅菌備用。乙醇和蒸汽滅菌是優(yōu)選的滅菌方法，但是技術(shù)人員已知的其它滅菌方法是合適的。當(dāng)在所述微型模具中使用PDMS時(shí)，不應(yīng)當(dāng)使用丙酮。同樣地，不應(yīng)當(dāng)使用會破壞在具有凹坑的基質(zhì)或模具外殼中使用的材料的完整性的滅菌操作。滅菌允許所述微型模具重復(fù)地用于體外用途。顯然，用于體內(nèi)植入的模具不具有該要求。在微型模具內(nèi)的細(xì)胞再聚集向微型模具遞送細(xì)胞。從任意胰島細(xì)胞源，可以得到用于再聚集體胰島的單個(gè)的分散的胰島細(xì)胞。在該實(shí)施例中，經(jīng)由膽總管給動物胰腺在原位插管，并通過將冷的膠原酶溶液(Worthington,Lakewood,NJ)抽入導(dǎo)管中進(jìn)行擴(kuò)張。隨后，切離擴(kuò)張的胰腺，轉(zhuǎn)移至離心管，并在輕輕旋轉(zhuǎn)下在37°C溫育30分鐘。然后使洗過的消化物穿過篩，并在冷凍離心機(jī)中沉降。將得到的沉淀物與Histopaque(密度=1.1085，SigmaDiagnosticsInc.,St.Louis,Missouri)相混合,并離心。然后如下清潔胰島的外分泌組織使用含有5%小牛血清的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)，穿過40μ篩進(jìn)行過濾，并放入含有DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、EGF(20ng/mL)和1%抗生素的培養(yǎng)皿中。在37°C、5%C02下維持所述胰島過夜。為了將胰島分散成單個(gè)細(xì)胞，如下將分離的胰島消化成可存活的細(xì)胞懸浮液將它們放入50ml離心管中，離心，并將沉淀物轉(zhuǎn)移至I.5ml微量離心管。在用不含鈣-鎂的HBSS洗滌2次以后，加入9份不含鈣-鎂的HBSS和I份木瓜蛋白酶(5Uml終濃度)的混合物。在旋轉(zhuǎn)器上在37°C溫育20min以后，用移液器移出胰島，將它們分散成單個(gè)細(xì)胞。在微型模具中溫育細(xì)胞。將單個(gè)分散的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至微型模具中的專門的聚集培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清(FBS)、EGF(20ng/mL)、ITS(lg/L)、BSA(2g/L)、煙酰胺(10nmol/L)、艾塞那肽-4(5nmol/L)和1%抗生素)(Kikugawa等人2009)中，進(jìn)行最后的培養(yǎng)。向該聚集培養(yǎng)基中，我們已經(jīng)加入了高鈣條件(2_4mM)，這會增強(qiáng)胰島再聚集。在分散時(shí)，使用血球計(jì)數(shù)器，用顯微鏡檢查細(xì)胞的等分試樣。測定單個(gè)細(xì)胞相對于雙聯(lián)體或三聯(lián)體的百分比。將成功的細(xì)胞分散定義為，具有最少90%的可存活的單個(gè)細(xì)胞，其它10%包含雙聯(lián)體和三聯(lián)體。通過獲知分散系中的細(xì)胞的密度(經(jīng)由使用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù))，我們能夠估測每個(gè)凹坑的細(xì)胞的數(shù)目。但是，我們還已經(jīng)在已經(jīng)加載所述微型模具以后計(jì)數(shù)細(xì)胞/凹坑，其隨實(shí)驗(yàn)不同而變化，基于培養(yǎng)基細(xì)胞密度，但是范圍為20-150?；诩虞d進(jìn)模具中的培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度，可以操縱細(xì)胞數(shù)目/凹坑，這會為用戶提供控制目標(biāo)3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)的最終大小的優(yōu)點(diǎn)。輕輕搖動所述微型模具，然后靜置15分鐘，使得細(xì)胞沉降進(jìn)單個(gè)凹坑中。在37°C、5%C02下維持胰島最多9天，每天更換培養(yǎng)基。如下容易地更換具有60μm深度凹坑的微型模具中的培養(yǎng)基從模具壁附近輕輕取出(利用抽吸)舊培養(yǎng)基，并向模具中輕輕移入新鮮培養(yǎng)基。在微型模具內(nèi)的細(xì)胞簇的再聚集。最初，細(xì)胞隨機(jī)地落在每個(gè)孔的底部上。沉降在每個(gè)凹坑中的細(xì)胞的數(shù)目由懸浮液中的細(xì)胞密度決定。為了在加載所述微型模具以前測定細(xì)胞密度，取出胰島細(xì)胞懸浮液的等分試樣，并使用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞/體積。獲知模具中的凹坑的數(shù)目和每個(gè)再聚集的胰島的目標(biāo)大小，可以根據(jù)起始細(xì)胞密度濃縮或稀釋懸浮液中的細(xì)胞數(shù)目。如果模具含有10，000個(gè)凹坑且希望的結(jié)果是100個(gè)細(xì)胞/凹坑，則在加載進(jìn)所述微型模具中的培養(yǎng)基中必須存在1，000，000個(gè)細(xì)胞。圖14顯示了從第2天開始并進(jìn)行至第5天，在微型模具中的細(xì)胞發(fā)展。在第3天和第4天之間，細(xì)胞開始呈現(xiàn)天然胰島的三維形狀。在凹坑內(nèi)形成的胰島都限于小于90μπι的直徑(平均直徑小于50μm)。該尺寸是重要的，因?yàn)槲覀円呀?jīng)公開的資料表明，50μm是確保向胰島的核心細(xì)胞供給營養(yǎng)的臨界尺寸(Williams等人，2010)。大于50μm的胰島表現(xiàn)出核心細(xì)胞死亡，而小于50μπι的那些胰島在培養(yǎng)中很少表現(xiàn)出核心細(xì)胞死亡。每個(gè)凹坑的彎曲的底部有助于使細(xì)胞彼此靠近，以最佳地形成球形再聚集的胰島。圖14顯示了使用面形測定器對單個(gè)凹坑深度的測量。該單個(gè)凹坑的深度稍微大于60μm,且底部是彎曲的，這會將細(xì)胞推向凹坑的中央進(jìn)行聚集。從早期原型得到的結(jié)果例證了在制備最佳尺寸和形狀的再聚集的胰島中的成功。該早期原型具有包圍凹坑區(qū)域的未形成凹坑的基質(zhì)表面區(qū)域(圖15)。當(dāng)接種時(shí)，一些細(xì)胞落在原型微型模具的未形成凹坑的表面上。盡管一些落在未形成凹坑的表面上的細(xì)胞停留在單個(gè)細(xì)胞形式或生長成小細(xì)胞簇，其它細(xì)胞形成巨型胰島不受凹坑規(guī)范限制的巨大復(fù)合物(圖15)。在該早期原型模具內(nèi)，細(xì)胞(分離自同一個(gè)動物，在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在相同的基質(zhì)材料上再聚集)生成2種不同的細(xì)胞再聚集體i)形成在凹坑內(nèi)的那些形成小的確定形狀的胰島，和ii)形成在扁平表面上的那些(不限于凹坑的物理限制)形成細(xì)胞的大聚集塊，它們具有差的擴(kuò)散性質(zhì)。一些無限制的胰島生長至400μπι直徑的大小。這些結(jié)果會提供優(yōu)良的概念證據(jù)(proof-of-concept):物理地限制細(xì)胞的再聚集會產(chǎn)生最佳地限定尺寸的胰島。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，在微型模具中再聚集的胰島表現(xiàn)出的擴(kuò)散性質(zhì)與天然小胰島表現(xiàn)出的擴(kuò)散性質(zhì)類似。為了測定在微型模具中再聚集的胰島的擴(kuò)散性質(zhì)，將再聚集的胰島暴露于含有葡萄糖的熒光類似物(2-NBDG)的培養(yǎng)基10分鐘。所述熒光葡萄糖類似物完全滲入再聚集的胰島的核心，這指示葡萄糖擴(kuò)散屏障相對較低(圖26)。相比而言，以前的工作證實(shí)，天然大胰島具有顯著的擴(kuò)散屏障，所述擴(kuò)散屏障會抑制葡萄糖滲入胰島核心中和細(xì)胞的攝取，甚至在暴露于2-NBDG數(shù)小時(shí)以后(Williams等人，2010)。這些數(shù)據(jù)共同地指示，在微型模具中再聚集的胰島具有比天然大胰島低的擴(kuò)散屏障。在微型模具中形成的細(xì)胞與在商業(yè)上可得到的多孔平板中形成的那些的對比。將在模具中的再聚集胰島的結(jié)果與在可商業(yè)得到的微量培養(yǎng)板中的再聚集胰島進(jìn)行了對比。商業(yè)平板含有正方形的孔，所述孔測得500μπι的直徑。在商業(yè)平板中培養(yǎng)分散的胰島細(xì)胞，并如預(yù)測的那樣形成胰島-樣簇。進(jìn)行幾次觀察。首先，在商業(yè)平板中形成的胰島細(xì)胞在孔的角落(在這里它們可以接觸壁)中聚集并彼此結(jié)合。圖16顯示了形成再聚集的胰島的細(xì)胞的一個(gè)典型實(shí)例，所述胰島接觸商業(yè)孔的側(cè)壁。這些細(xì)胞使用接觸導(dǎo)向來重新形成。其次，但不限于大小，越來越多的細(xì)胞結(jié)合到一起，產(chǎn)生具有差生存力的巨大胰島(一些具有超過400μm的直徑)。由于沒有小微型模具限制每個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞的數(shù)目，并將物理尺寸設(shè)計(jì)成最佳地指導(dǎo)再聚集的胰島的形狀，所以得到的胰島非常大，且含有高百分比的死細(xì)胞。在商業(yè)可得到的平板中再聚集的胰島的生存力試驗(yàn)中，在培養(yǎng)6天時(shí)觀察到超過50%的細(xì)胞死亡。在這些大開口中，細(xì)胞經(jīng)常保持為單個(gè)，其表現(xiàn)出差的細(xì)胞生存力。能夠沿著孔的壁或角落簇集的那些細(xì)胞從未形成球形(指示天然胰島)，且具有差的生存力。第三，在商業(yè)模具中形成的細(xì)胞簇不會再聚集成我們使用所述微型模具能夠得到的球形胰島-樣組織。再聚集的胰島的成球能力可能是預(yù)示成功的體外功能的一項(xiàng)重要特征。將大多數(shù)多孔平板生產(chǎn)成具有扁平的底部孔和正方形側(cè)壁，如圖16所示。在商業(yè)平板中再聚集的細(xì)胞，諸如不會彼此粘附成天然回憶球(native-reminiscentsphere)的那些，并因此更不可能象天然胰島一樣有效地起作用。盡管具有圓形底部的1536孔板是可商業(yè)得到的，在500μπι直徑的任意孔中形成的胰島細(xì)胞會因?yàn)樘蠖y以克服擴(kuò)散屏障。這些結(jié)果支持了下述觀念當(dāng)前的可商業(yè)得到的模具就最佳胰島形成而言是不適當(dāng)?shù)幕|(zhì)。從模具取出再聚集的細(xì)胞簇。在有些情況下，希望以不會破壞細(xì)胞的完整性或生存力的方式，從所述微型模具中取出再聚集的胰島細(xì)胞。這可以如下容易地實(shí)現(xiàn)將大移液器輕輕地直接放置在凹坑上面，并施加抽吸。從所述凹坑中與培養(yǎng)基一起取出再聚集的胰島。隨后用新鮮培養(yǎng)基洗滌所述微型模具，并直接地移到所述凹坑上，會取出模具中的幾乎所有的再聚集的胰島。在微型模具中形成的細(xì)胞再聚集體的表征。測量從微量培養(yǎng)板取出的胰島的大小和生存力。天然大鼠胰島的直徑范圍是20-350μπι。當(dāng)在微型模具(IOOym直徑，60μπι深)的凹坑內(nèi)再聚集時(shí)，100%的胰島具有小于90μm的直徑；每個(gè)再聚集的胰島的平均直徑是36.6±I.2μm(共焦顯微術(shù)測量超過500個(gè)單個(gè)的再聚集的胰島)。最初，我們發(fā)現(xiàn)少數(shù)更大的結(jié)構(gòu)，我們認(rèn)為它們代表從未完全消化成單個(gè)細(xì)胞的胰島并因此從未落入凹坑中。此后，在分散操作中更加小心地制備胰島懸浮液，所述懸浮液含有90%的單個(gè)細(xì)胞，剩余的細(xì)胞主要是雙聯(lián)體或三聯(lián)體。我們使用微型模具模式A和B(圖17)估測，得到的所有聚集體中的85-90%具有小于90μm的直徑。由于沒有理解的原因，在凹坑中的一些細(xì)胞分裂成多個(gè)胰島，而不是在每個(gè)凹坑中形成一個(gè)再聚集的胰島。圖18顯示了在一個(gè)凹坑內(nèi)的2個(gè)再聚集的胰島的一個(gè)實(shí)例。在形態(tài)學(xué)上，再聚集的胰島看起來與相同大小的天然胰島相同。它們的形狀是球形，具有胞外胰島的囊-樣外表面，如圖29所示。相比而言，圖15表明，在沒有微型模具下聚集的細(xì)胞沒有形成球形或明顯的囊。使用細(xì)胞凋亡/壞死細(xì)胞染色(Invitrogen,含有Yo-Pro-l和碘化丙唳的Vybrant細(xì)胞凋亡試驗(yàn))，在再聚集的胰島上完成生存力實(shí)驗(yàn)。該雙標(biāo)記試驗(yàn)會測量膜完整性和DNA破碎。使用我們以前公開的方法(MacGregor等人，2006;WiIIiams等人，2010)，在所述兩種標(biāo)記中溫育再聚集的胰島I小時(shí)。隨后，用PBS沖洗胰島，并放入在Fluoview300共焦顯微鏡上的Attofluor室中。將再聚集的胰島光學(xué)地切片，并存儲來自胰島中心的照片，用于以后分析。將在含有染料的胰島內(nèi)的區(qū)域計(jì)算為總胰島區(qū)域的百分比，以測定生存力。5天齡再聚集的胰島的生存力測量證實(shí)了在細(xì)胞內(nèi)非常高的生存力，并揭示非常少的死細(xì)胞/胰島。再聚集的胰島的總生存力是99.76%。該值高于以前在文獻(xiàn)中關(guān)于天然大和小胰島以及關(guān)于單個(gè)胰島細(xì)胞分散系所報(bào)道的值(WiIIiams等人，2010;Song等人，2009)。圖19顯示了典型胰島的生存力染色的實(shí)施例。在這些實(shí)驗(yàn)中，紅色染色指示由壞死導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，綠色細(xì)胞染色指示由細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。圖19A顯示了在所述微型模具中再聚集的胰島中鑒別的僅有的非常少的死細(xì)胞之一。染成紅色的細(xì)胞正在發(fā)生由壞死導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。在分離的組織中，經(jīng)常首先發(fā)生細(xì)胞壞死。在500個(gè)測試的胰島中，僅觀察到2個(gè)細(xì)胞凋亡的(綠色)細(xì)胞。相比而言，當(dāng)來自相同動物的細(xì)胞在微型模具表面上形成大巨型胰島時(shí)，在所述塊中存在大量死細(xì)胞。圖19B捕獲了含有23個(gè)死細(xì)胞的視圖的一個(gè)平面。調(diào)節(jié)顯微鏡的焦面，證實(shí)在所述塊的所有平面內(nèi)存在更多死細(xì)胞。因而，在凹坑中再聚集成正確大小的細(xì)胞具有非常高的生存力，而在凹坑外面再聚集成大塊的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞死亡。這些結(jié)果支持所述微型模具的成功，因?yàn)槲挥谀＞叩臎]有凹坑的區(qū)域上的細(xì)胞具有比在凹坑中形成的那些遠(yuǎn)遠(yuǎn)更差的生存力。在微型模具中形成的所有細(xì)胞的生存力超過來自相同動物的天然大和小胰島的生存力(圖20)。如以前所述,使用Invitrogen的Vybrant細(xì)胞凋亡試驗(yàn),在大鼠大胰島、小胰島和再聚集的胰島之間對比了生存力。在分離后6天，在2組天然胰島中存在活細(xì)胞百分比的一些變異性，但是在再聚集的胰島中幾乎不存在死細(xì)胞，這導(dǎo)致誤差棒太小而難以在圖中可見地表示。在微型模具中再聚集的胰島表現(xiàn)出比天然小胰島高大約10%的生存力比天然大胰島高大約40%的生存力(圖20)。從微型模具制備細(xì)胞群。在天然胰島(大的和小的)中存在3大類細(xì)胞，它們占所述胰島的總細(xì)胞的約90%。分泌胰高血糖素的α細(xì)胞占所述胰島的所有細(xì)胞的約20%。生產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)目的60-65%，生產(chǎn)生長激素抑制素的δ細(xì)胞占所述胰島細(xì)胞組合物的5-10%。已經(jīng)證實(shí)，在本發(fā)明的微型模具中工程設(shè)計(jì)的胰島含有α、β和δ細(xì)胞。例如，圖21描繪了在再聚集以后6天在本發(fā)明的微型模具中形成的2個(gè)代表性的胰島；β細(xì)胞被染成綠色，α細(xì)胞被染成紅色，δ細(xì)胞被染成藍(lán)色。這些工程設(shè)計(jì)的胰島似乎具有比一般的天然胰島低的β細(xì)胞百分比。但是，與天然小胰島相比，αβδ細(xì)胞的細(xì)胞相對組成和它們的構(gòu)造可能類似于天然小胰島。天然大鼠大和小胰島構(gòu)造成，胰高血糖素陽性的和生長激素抑制素陽性的細(xì)胞位于胰島的外層上。胰島素陽性的細(xì)胞存在于中央。這樣，在小胰島中的胰島素陽性的細(xì)胞(β細(xì)胞)的百分比更低，但是每個(gè)胰島含有大量胰島素。盡管我們尚未在足以確定地做出結(jié)論的再聚集的胰島中計(jì)算β/α/δ細(xì)胞(胰島素/胰高血糖素/生長激素抑制素陽性的細(xì)胞)的百分比，β細(xì)胞相對于所有其它細(xì)胞的百分比可能類似于天然小胰島。一個(gè)重要的差別是，在再聚集的胰島中，α、β和δ細(xì)胞與分散在再聚集的胰島中的細(xì)胞一起以隨機(jī)模式構(gòu)造。這是與在人胰島中觀察到的相同的構(gòu)造(HahnvanDorshe等人，1988;Bosco等人，2010)。因而,再聚集的胰島表現(xiàn)出更隨機(jī)的細(xì)胞構(gòu)造模式(暗示天然人胰島)。胰島素生產(chǎn)。重要的是，證實(shí)在微型模具中工程設(shè)計(jì)的胰島能夠生產(chǎn)新的胰島素分子。首先合成胰島素作為前體分子，稱作胰島素原。將6天齡再聚集的胰島關(guān)于胰島素原水平進(jìn)行染色，以測定它們是否生產(chǎn)新的胰島素。圖22顯示了關(guān)于成熟的胰島素(綠色)和胰島素原分子(紅色)進(jìn)行染色的再聚集的胰島的一個(gè)實(shí)施例。如預(yù)期的，β細(xì)胞被雙重標(biāo)記。照片表明，在再聚集的胰島中正在合成新的胰島素，甚至在培養(yǎng)6天時(shí)。胰島負(fù)責(zé)在進(jìn)餐后響應(yīng)于高葡萄糖暴露將胰島素釋放進(jìn)血液中。胰島素分泌的缺乏是I型糖尿病患者不能維持正常血糖水平的原因。為了測定對葡萄糖的細(xì)胞反應(yīng)，將在本發(fā)明的微型模具中再聚集的胰島和天然小胰島暴露于低葡萄糖條件(3mM)。收集并定量由兩種胰島類型分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的胰島素(圖23)。在低葡萄糖條件下(30分鐘)，再聚集的胰島釋放的胰島素是天然小胰島的100倍(天然小胰島生產(chǎn)比天然大胰島更多的胰島素)。當(dāng)暴露于高葡萄糖(20mM)時(shí)，再聚集的胰島繼續(xù)分泌比天然大或小胰島明顯更多的胰島素。為了證實(shí)再聚集的胰島是在分泌胰島素而不是泄漏胰島素，我們使用小膜非滲透的葡聚糖(IOkD)完成了額外實(shí)驗(yàn)。該尺寸的分子小到足以穿過在細(xì)胞內(nèi)的核被膜上的核孔復(fù)合體。但是，質(zhì)膜不含有能夠穿過該尺寸的分子的蛋白復(fù)合體。將葡聚糖(20mM)加入含有再聚集的胰島的培養(yǎng)基中，并捕獲共焦照片，甚至在暴露4小時(shí)以后葡聚糖不能進(jìn)入細(xì)胞中，這提示所述細(xì)胞不是滲漏的或膜損壞的。另外，如果細(xì)胞實(shí)際上滲漏胰島素而不是分泌胰島素，我們應(yīng)當(dāng)已經(jīng)在壞死/細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中在再聚集的胰島中觀察到更高水平的紅色或綠色染色，如圖22所示。這些數(shù)據(jù)共同地提示，在微型模具中再聚集的胰島確實(shí)生產(chǎn)比它們的天然小或大胰島副本更高量的胰島素。據(jù)我們所知，尚未報(bào)道天然的或改變的胰島細(xì)胞在這些水平的胰島素分泌，這使得我們的結(jié)果是非常獨(dú)特的。Weir等人報(bào)道了將小型再聚集的胰島包囊進(jìn)具有高古洛糖醛酸含量的海藻酸鹽中(O’Sullivan等人，2010)。Weir如下制備了這些胰島聚集體簡單地將胰島分散成單個(gè)細(xì)胞，然后允許它們沒有限制地重新定形。Weir的工作證實(shí)，在正常的氧水平，它們的小胰島釋放出與天然胰島一樣多的胰島素，但是在低氧中，Weir胰島釋放出比天然胰島更多的胰島素。但是，Weir的最好表現(xiàn)的胰島分泌的胰島素與我們的在微型模具中再聚集的胰島相比少了20倍。我們的再聚集的胰島在高葡萄糖中的胰島素分泌的相對下降的原因在此時(shí)是未知的，且在工程設(shè)計(jì)的胰島可以移植進(jìn)糖尿病動物中之前必須確定。盡管相對下降，與天然胰島相比在低和高葡萄糖條件下胰島素分泌的急劇增加是微型模具再聚集方法的一個(gè)重要的且獨(dú)特的屬性。胰島的添加劑?？梢耘c在微型模具中的再聚集胰島過程一起使用的替代性的方法和材料幾乎沒有限制。首先，在再聚集時(shí)可以將許多分子摻入工程設(shè)計(jì)的胰島中。這些包括、但不限于生長因子、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑、細(xì)胞因子、趨化因子、DMARD(緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物)、抗炎藥和抗生素。可以將增加移植部位處的氧張力的分子或微型裝置摻入再聚集的胰島中，特別當(dāng)使用可植入的微型模具基質(zhì)時(shí)?？梢栽谠倬奂瘯r(shí)加入的其它非限制性的分子類別包括誘導(dǎo)胰島素釋放的藥物、小分子、肽、蛋白、抗體(例如針對CDlla、CDllb、CDllc、CD18)和核酸(例如DNA或RNA)。討論。我們的凹坑化的微型模具不同于在本領(lǐng)域中用于再聚集細(xì)胞的其它支架。以前，其他人已經(jīng)嘗試使用懸滴方法來形成胰島(例如，Lehmann等人，2007)。在所述懸滴方法中，將細(xì)胞放入溶液中，在培養(yǎng)皿蓋上形成液滴，然后將培養(yǎng)皿蓋上側(cè)朝下地反轉(zhuǎn)，使得所述細(xì)胞落在溶液懸滴的底部，它們可能在這里形成胰島。但是，所述懸滴方法是耗時(shí)的且易于污染，因?yàn)樵凇耙旱巍敝械呐囵B(yǎng)基不能更換。微型模具的體外實(shí)用性。本發(fā)明的微型模具可以設(shè)計(jì)成在體外形成細(xì)胞聚集體，用于以后移植或用于藥物或裝置測試以及其它用途。制備用于移植的細(xì)胞(預(yù)示實(shí)施例)。設(shè)計(jì)成產(chǎn)生用于移植的細(xì)胞的一種優(yōu)選的微型模具是這樣的單個(gè)裝置它是可滅菌的，可重復(fù)使用的，且當(dāng)填充時(shí)不會泄漏培養(yǎng)基或細(xì)胞(圖24)。首先，需要從胰腺中分離出胰島。從大胰島分離出健康的小胰島。可以將大胰島分散成單個(gè)細(xì)胞或雙聯(lián)體，將它們加載進(jìn)微型模具中。在培養(yǎng)3-6天以后，取出細(xì)胞，與天然小胰島混合，并移植進(jìn)糖尿病受體中。將微型模具A(圖17A)設(shè)計(jì)成用于胰島再聚集，其具有100μπι直徑和60μπι深度的凹坑。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，60μm深度是最佳的，因?yàn)樗试S從所述凹坑中容易地取出再聚集的胰島。所述凹坑排列成交替圖案，使得在凹坑之間存在最小間距(圖17A)。凹坑之間的平均距離小于30μm。在圖15中看到的未形成凹坑的表面完全隱蔽在預(yù)見到的微型模具中用于制備移植所用細(xì)胞的凹坑中。該排列允許在要使用的微型模具上形成最大的凹坑空間——導(dǎo)致在每個(gè)模具中產(chǎn)生最大數(shù)目的再聚集體和最大效率，使得漂浮在模具表面上的任意細(xì)胞可能落入凹坑中，從而限制用于再聚集的可存活細(xì)胞的損失。在一個(gè)模具上可得到的凹坑的數(shù)目將隨模具的大小而變化。使用微型模具A設(shè)計(jì)(圖17A)的直徑為大約I.5英寸的模具含有10，000-12，000個(gè)凹坑/模具。所述凹坑的間距也取決于模具的需要。對于移植所用組織的再聚集，原始組織產(chǎn)生再聚集的胰島的數(shù)目的效率是重要的。落入凹坑中的細(xì)胞的百分比越大，制備新胰島的效率越好。所以我們的為胰島移植所設(shè)計(jì)的模具具有20-30μm的凹坑間距。藥物篩選(預(yù)示實(shí)施例)。使用微型模具的藥物篩選是基于下述概念排列成3D結(jié)構(gòu)(象微型腫瘤或小胰島一樣)的細(xì)胞會對它們的環(huán)境做出反應(yīng)，所述反應(yīng)不同于在盤中扁平地生長或再聚集的細(xì)胞。例如，微型腫瘤或胰島可以形成在所述微型模具的凹坑中，然后可以將潛在的治療劑(諸如抗癌藥物)單個(gè)地施加于每個(gè)凹坑或加入整個(gè)平板中。然后可以檢查3D結(jié)構(gòu)的形成并觀察變化，諸如降低的細(xì)胞生存力或簇大小，這將指示測試化學(xué)品的不希望的效應(yīng)。在第一個(gè)實(shí)例中，可以在一塊長度為大約35_的玻璃上測試許多不同的藥物。對于第二個(gè)方案，將測試單一藥物，但是在一個(gè)模具中，可以定量許多單獨(dú)的反應(yīng)。癌癥藥物試驗(yàn)的一種可能的定量是生存力(活/死染色)，這可以針對每種腫瘤進(jìn)行。盡管使用所述微型模具設(shè)計(jì)來測試潛在的癌癥藥物是有吸引力的，所述模具可用于在3D排列的細(xì)胞上最佳地實(shí)現(xiàn)的所有藥物試驗(yàn)。將微型模具B(圖17B)設(shè)計(jì)成用于將單一干預(yù)遞送至每個(gè)孔。因而，它可適用于藥物試驗(yàn)。對于該設(shè)計(jì)，所述凹坑具有大約180μm的直徑，在每個(gè)凹坑之間具有120μm的間距。所述間距可以根據(jù)需要增加或減小。圖11顯示了具有單個(gè)空凹坑的微型模具B的底面的照片。微型模具B含有2，700-3，000個(gè)凹坑/模具，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于在設(shè)計(jì)A中。在設(shè)計(jì)B中的凹坑之間的間距更大，以確保僅向一個(gè)凹坑中的準(zhǔn)確藥物遞送。凹坑圖案的規(guī)范和間距由用戶設(shè)定，且取決于使用的藥物遞送系統(tǒng)。使用模具在每個(gè)凹坑中的細(xì)胞上測試數(shù)千種化合物，允許用戶在直徑小于2英寸的模具中完成對2000-3000種不同藥物的藥物篩選(圖24)。為單獨(dú)的藥物使用每個(gè)模具的高處理量藥物篩選允許數(shù)千單個(gè)細(xì)胞簇做出反應(yīng)，并測量為單個(gè)反應(yīng)而不是平均反應(yīng)?？梢允褂门c納米遞送系統(tǒng)配用的高處理量藥物篩選，使得每個(gè)凹坑含有不同的測試藥物。或者，可以從數(shù)千個(gè)暴露于相同處理和培養(yǎng)條件的樣品收集數(shù)據(jù)點(diǎn)(圖24)。非胰島細(xì)胞的制備(預(yù)示實(shí)施例)?？梢詾槎喾N細(xì)胞聚集形狀設(shè)計(jì)模具，所述形狀包括、但不限于長神經(jīng)元途徑、腎小球樣濾器、血管、替換胞室等。干細(xì)胞或重新程序化的細(xì)胞在小的、界限清楚的形狀(諸如微型模具)中的聚集，也是本發(fā)明的適當(dāng)用途。一種典型用途是，將培養(yǎng)的細(xì)胞系繁殖和聚集成模具。在該情況下，以1-50個(gè)細(xì)胞/凹坑(取決于用戶的需要)的非常低的密度，將懸浮液中的細(xì)胞加載進(jìn)模具中。培養(yǎng)的細(xì)胞系含有分裂細(xì)胞，它們被允許在凹坑中生長一段時(shí)間，所述時(shí)間取決于用戶的需要。其它細(xì)胞源包括來自動物或人類的新鮮分散的細(xì)胞。加載新鮮分散的細(xì)胞的方法類似于關(guān)于胰島所述的一般方法。將選擇的組織(例如血管)暴露于消化酶，直到單個(gè)細(xì)胞或雙聯(lián)體處于懸浮液中。由用戶將細(xì)胞以選擇的密度加載進(jìn)模具中的選擇的培養(yǎng)基中。最后，可以將干細(xì)胞程序化，以生產(chǎn)不同的成年細(xì)胞類型。這些細(xì)胞也可以加載進(jìn)微型模具中，以增強(qiáng)3D結(jié)構(gòu)形成。微型樽具的體內(nèi)實(shí)用件。(預(yù)示實(shí)施例)本文所述的微型模具可用于體外用途。在用于移植的模具中再聚集胰島(預(yù)示實(shí)施例)。從生物聚合物構(gòu)建的微型模具可以用于制備可植入的產(chǎn)品(圖23)。在這樣的情況下，會改變模具的微環(huán)境，使得再聚集的胰島附著于生物聚合物上，并將整個(gè)“貼劑”移植進(jìn)受體中。上述的生物聚合物適合制備這樣的可植入的微型模具。在模具中的凹坑可以用于制備孔，所述孔允許細(xì)胞首先沉降在凹坑中(它們在這里的再聚集受到凹坑尺寸的引導(dǎo))，然后附著于生物聚合物凹坑。為了在生物聚合物中產(chǎn)生凹坑，使用本領(lǐng)域已知的方案(例如，Dean等人2007)，設(shè)計(jì)蠟底片。對于可植入的模具，將胰島留在模具中，并通過外科手術(shù)放入受體中。可植入的模具具有這樣的模具設(shè)計(jì)所述設(shè)計(jì)具有在凹坑之間的開口，所述開口允許神經(jīng)和血管浸潤所述胰島。此外，可以用例如神經(jīng)元和血管生長因子浸潰可植入的材料，并且所述模具也可以含有免疫抑制劑來保護(hù)胰島免于免疫排斥。使用幾種公開的方法，可以植入含有胰島的模具。如Qi等人(2010)所公開地，可以將微型模具放入腹腔中。在麻醉下切開腹腔，將所述模具輕輕地放入筋膜下空間。用于植入所述微型模具的替代性部位包括皮下插入物，特別是在預(yù)處理以后，以增加與所述區(qū)域的維管聯(lián)結(jié)，如Veriter等人(2010)所述。在人移植中，經(jīng)由門靜脈，將胰島放入肝中(Koh等人，2010)。對于微型模具，通過門靜脈的輸注是不可能的，但是可以使用更侵入性的外科手術(shù)將所述模具放入肝中或在腎囊下(MacGregor等人，2006)。參考文獻(xiàn)就它們提供示例性操作細(xì)節(jié)或其它細(xì)節(jié)來補(bǔ)充本文所述的那些而言，下述參考文獻(xiàn)具體地通過引用并入本文。SU-82000-PermanentEpoxyNegativePhotoresist,MicroChemjNewton,MA.BahurganAN,ChangY，F(xiàn)ungJJjTruccoM，和BottinoR.,Flexiblemanagementofenzymaticdigestionimproveshumanisletisolationoutcomefromsub-optimaldonorpancreata,AmJTransplantation3:1135-1142，(2003).BoscoDjArmanetMjMorelP，NiclaussNjSgroiA,MullerYDjGiovannoniLjParnaudGjBerneyT，Uniquearrangementofalpha—andbeta—cellsinhumanisletsofLangerhansjDiabetes.Feb25.[印刷之前的電子版](2010).ChanCB，SalehMCjPurjeA，和MacPhailRM，Glucose-induciblehypertrophyandsuppressionofanioneffluxinratbetacells，JEndocrinol173:45-52，(2002).ChanCB和SuretteJJ，Glucoserefractorinessofbeta-cell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