專利名稱：一種吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及利用百日咳、白喉、破傷風(fēng)菌種培養(yǎng)類毒素制備成百白破疫苗，用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病。
背景技術(shù)：
百日咳是一種常見的、傳染性極強(qiáng)的呼吸道感染性疾病。百日咳病在中醫(yī)上稱為天哮嗆、鷺鶿吼、疫咳等，我國早在十一世紀(jì)就有關(guān)于此病的治療方法。1840年Monlton提到過百日咳病，1876年Sydenham詳細(xì)描述了該病，稱之為劇烈咳嗽的病。1900年由Bordet 和Gengon在患兒的咳痰涂片內(nèi)找到了百日咳桿菌。由于該菌初次分離營養(yǎng)要求較高，直到 1906年他們采用了血液-甘油-馬鈴薯培養(yǎng)基才獲得純種。百日咳桿菌能引起人類急性呼吸道傳染病，傳染力強(qiáng)，發(fā)病持續(xù)時(shí)間長，故稱百日咳(whoop cough或Pertussis)。百日咳桿菌能引起人類百日咳，以嬰幼兒患者居多，主要是易感者與患者密切接觸后，通過飛沫空氣傳播感染。百日咳病程較長，大約5 7周或更長，常見有流感嗜血桿菌、A群鏈球菌和肺炎球菌的繼發(fā)感染，具有嚴(yán)重的預(yù)后結(jié)果，最常見的合并癥為肺炎，是導(dǎo)致百日咳患兒死亡的主要原因。在患病的早期使用抗生素可能有效，百日咳桿菌對(duì)紅霉素、氯霉素、氨芐青霉素、多粘菌素等抗生素均有較敏感。若在百日咳潛伏期和卡他期立即使用這些藥物可以縮短病程，減輕病情。但是，如果進(jìn)入了百日咳痙咳期，則所有抗菌素效果都不明顯。百日咳桿菌致病機(jī)理至今尚不十分清楚。但體液內(nèi)存在一定的抗體水平可保護(hù)機(jī)體免受百日咳桿菌感染已被證實(shí)。自20世紀(jì)30年代Medson等制成百日咳菌體疫苗以來，已在世界各國使用近60年。百日咳菌體疫苗在預(yù)防和控制百日咳中發(fā)揮了巨大的作用，使百日咳成為用疫苗可以預(yù)防的傳染病，已列入世界衛(wèi)生組織推行的擴(kuò)大免疫計(jì)劃(Expend Programme Immunization, EPI)中要控制的和消滅的傳染病之一。破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重的疾病，它多發(fā)生于創(chuàng)傷后，由于患者傷口被破傷風(fēng)桿菌感染， 在厭氧的條件下產(chǎn)生大量的毒素，進(jìn)而侵害神經(jīng)組織，導(dǎo)致患者全身性肌肉強(qiáng)直和陣發(fā)性痙攣，死于窒息及全身性衰竭。它多是散在發(fā)生，感染與發(fā)病也需要特定的條件，即創(chuàng)傷、污染、破傷風(fēng)桿菌及厭氧條件。破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生的毒素經(jīng)甲醛解毒后，形成類毒素，可用于人群免疫接種，形成自動(dòng)免疫，該方法是1925年通過動(dòng)物法注射類毒素后，在血清中可測出相應(yīng)的抗體，并能抗破傷風(fēng)感染。白喉是一種嚴(yán)重的世界性的呼吸道傳染病，人類是白喉?xiàng)U菌的唯一宿主。它是由白喉棒狀桿菌侵入到上呼吸道粘膜上皮組織，生長繁殖并產(chǎn)生外毒素引起炎癥，產(chǎn)生纖維性滲出和組織破壞，形成典型的假膜，這種假膜牢固的附著在粘膜上，可引起呼吸障礙甚至窒息，同時(shí)白喉外毒素不斷由病灶吸收，引起全身性中毒性癥狀、器官損害和急性死亡，主要是心肌、神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎及腎上腺等器官的損害。自1923年發(fā)現(xiàn)經(jīng)用甲醛處理白喉毒素后，可使白喉毒素的毒性消失而保持免疫原性，注射動(dòng)物可產(chǎn)生中和抗體。我國目前應(yīng)用于計(jì)劃免疫預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)疾病的疫苗主要是在全細(xì)胞百日咳疫苗中加入白喉、破傷風(fēng)類毒素的聯(lián)合疫苗。自五十年代初我國已經(jīng)開始生產(chǎn)該種疫苗，至今已使用了半個(gè)多世紀(jì)。雖然近半個(gè)世紀(jì)以來，在世界范圍內(nèi)許多國家已經(jīng)廣泛應(yīng)用了疫苗，大大降低了白喉和破傷風(fēng)疾病的發(fā)病率，但有關(guān)研究表明，在疫苗接種不完全區(qū)域的人群中仍時(shí)有百日咳和白喉發(fā)生，處于地方性低水平流行。在20世紀(jì)70年代末至80 年代初，在一些發(fā)達(dá)國家，如英國、瑞典、意大利和日本等由于停止百日咳菌體疫苗接種，發(fā)病率大幅度上升。1993年瑞典報(bào)告在未免疫的兒童中，60%在10歲前發(fā)生過典型的百日咳癥狀，其中90%兒童的血清百日咳毒素抗體呈陽性反應(yīng)。因此，百日咳疫苗接種的長期性和保證完成全程免疫是非常重要和關(guān)鍵。根據(jù)WHO近期統(tǒng)計(jì)，全球每年仍有百日咳病人近 4000萬，35. 7萬人死亡。如非洲，發(fā)病率為2000/10萬，5歲以下兒童的發(fā)病率高達(dá)20% 60%。在歐洲發(fā)病率約為0.35/10萬 85/10萬。在美國，百日咳的發(fā)病率從1981年的 0. 5/10萬增加到1993年的2. 6/10萬；澳大利亞盡管3針基礎(chǔ)免疫覆蓋率高達(dá)90%，百日咳發(fā)病率從1991年的2/10萬增加到1994年的30. 5/10萬。在荷蘭疫苗接種率高達(dá)95%， 1996年仍發(fā)生了大范圍的流行，發(fā)病率達(dá)18/10萬。在我國，目前尚無百日咳感染的確切流行病學(xué)資料，盡管自1985年中國推行計(jì)劃免疫，將百白破聯(lián)合疫苗納入第一批計(jì)劃免疫的疫苗，使得百日咳的發(fā)病率急劇下降。但是，由于全細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗易產(chǎn)生的副反應(yīng)， 嚴(yán)重影響了劃免疫的實(shí)施，使常規(guī)免疫的全國覆蓋率尚未真正達(dá)到85%，造成百日咳的局部暴發(fā)流行的情況。如貴州省某鎮(zhèn)1997年發(fā)生暴發(fā)流行，發(fā)病率高達(dá)20. 55% 085例/總?cè)丝?1387)，其中7歲以下兒童占44%，此次流行與疫苗接種率低、易感人群累積有關(guān)。浙江麗水報(bào)告，1984-1992年百日咳的發(fā)病率仍達(dá)17. 24/10萬。由于百日咳在發(fā)病的早期癥狀不典型，不易診斷，但傳染性卻很強(qiáng)，所以難以控制傳染源和切斷傳播途徑，只有通過預(yù)防接種百日咳疫苗，減少易感人群，提高人群對(duì)百日咳的免疫水平，形成免疫屏障，才能達(dá)到控制和消滅百日咳的目的。有關(guān)流行病學(xué)調(diào)查證明全細(xì)胞百日咳疫苗對(duì)于控制百日咳疾病的流行非常有效，免疫人群后可提供中至高水平的保護(hù)作用。英國在1978年和1981年發(fā)生了兩次因停止接種全細(xì)胞百日咳疫苗后最為嚴(yán)重的百日咳流行。1979年日本由于疫苗接種事故停止接種疫苗，使百日咳發(fā)生率大幅度上升。然而，由于全細(xì)胞百日咳疫苗具有復(fù)雜的生物學(xué)性狀，而且有關(guān)其效力與毒性之間的關(guān)系不甚明了，因此盡管接種全細(xì)胞百日咳疫苗后是否會(huì)引起腦病已爭論了許多年，但是，因接種疫苗引起或誘發(fā)嚴(yán)重副反應(yīng)仍然是一個(gè)世界性的問題。與百日咳疫苗接種相關(guān)的副反應(yīng)可以分為兩大類。一類是常見副反應(yīng)，包括局部和全身輕微副反應(yīng)，前者如注射局部發(fā)生紅暈、疼痛、腫脹，在接種百日咳菌體疫苗后的發(fā)生率為50%;后者如發(fā)燒、煩躁、嗜睡、厭食等副反應(yīng)，吸附無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合疫苗(DTaP)明顯比白喉和破傷風(fēng)類毒素二聯(lián)疫苗(DT)的副反應(yīng)高。另一類為不尋常的副反應(yīng)，局部的有硬結(jié)和化膿，血管神經(jīng)性水腫等，全身副反應(yīng)有嘔吐、持續(xù)哭叫、 蕁麻疹等，嚴(yán)重的可發(fā)生驚厥、虛脫、休克等，極少數(shù)人可引起永久性腦損傷。我國在1988 年由中國藥品生物制品檢定所組織進(jìn)行了百日咳菌體疫苗人體接種反應(yīng)觀察，體溫38. 5°C 以上的中強(qiáng)反應(yīng) 6-8h 為 1. 62% -10. 57%,24h 為 2. 5% -11. 5%,48h 為 0-3. 84%。局部中強(qiáng)反應(yīng) 24h 為 0-4. 38 %，48h 為 0-3. 22 %，72h 為 0-2. 63 %。化膿發(fā)生率為 0.87%。由于百白破疫苗中白喉、破傷風(fēng)兩種類毒素是已經(jīng)被提純精制過的有效蛋白抗原，而百日咳則為全細(xì)菌體制劑，即包含所有的有效抗原和毒性成分，所以注射百白破疫苗所發(fā)生的反應(yīng)一般為百日咳所含的毒性組分所引起的異常反應(yīng)，如接種后發(fā)生的發(fā)燒、紅腫、硬結(jié)等，并不是疫苗本身所應(yīng)該具備的性狀，而是該疫苗本身含有除了人們所需要的有效抗原成分以外，同時(shí)所含的有害成分所引起的異常反應(yīng)。而有害成分對(duì)于過敏體質(zhì)或已被某些細(xì)菌、病毒隱性感染的接種者較容易引起變態(tài)反應(yīng)。而有害成分存在量也是疫苗質(zhì)量的反映。接種百、白、破疫苗后發(fā)生的異常反應(yīng)還有以下幾種嚴(yán)重異常反應(yīng)過敏性合并癥1)過敏性休克；幻過敏性皮疹；幻血管神經(jīng)性水腫；神經(jīng)系統(tǒng)合并癥1)腦病；2)神經(jīng)炎及神經(jīng)根炎；3)變態(tài)性腦脊髓炎。百白破疫苗中的百日咳菌體易誘發(fā)潛伏感染，或使原有的疾病加重。尤其過敏體質(zhì)和已被某些細(xì)菌、病毒隱性感染的接種者容易發(fā)生嚴(yán)重異常反應(yīng)。但是根據(jù)計(jì)劃免疫的要求，白、破兩種類毒素幾乎總是與百日咳疫苗合并使用，用于兒童計(jì)劃免疫，因此菌體百日咳引起的副反應(yīng)大大干擾了白喉和破傷風(fēng)類毒素的免疫接種。有些國家在百日咳發(fā)病率大幅度降低的情況下，由于接種疫苗后所引起的上述嚴(yán)重副反應(yīng)，使人們抵制接受百日咳疫苗，如英國、瑞典和日本等國都一度停止了百日咳疫苗的接種，隨后這些國家的百日咳發(fā)病率急劇上升。鑒于此種情況自20世紀(jì)70年代起對(duì)百日咳桿菌進(jìn)行了更加深入的研究，研制和純化了包百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳粘著素等近20種百日咳菌的生物活性成分。本在研究的基礎(chǔ)上，于1981年率先研制成功主要含有百日咳毒素和絲狀血凝素?zé)o細(xì)胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine, APV)，并替代百日咳菌體疫苗(whole cell pertussis vaccine，WPV)，用于免疫2歲以上兒童，并于1989年開始使用吸附無細(xì)胞百曰咳疫苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合疫苗(adsorbed acellular pertussis vaccine, iphtheria toxiod, tetanus toxoidcombined vaccine ;DTaP)，用于 3 月齡嬰JL白勺基石出免疫，至今已累計(jì)使用了幾千多萬針次，使百日咳的發(fā)病率重新下降，并且達(dá)到歷史最低點(diǎn)。 20世紀(jì)90年代以來在瑞典、美國、德國、意大利、塞內(nèi)加爾以及中國等國家，對(duì)近20多種不同的DTaP免疫效果、接種反應(yīng)等進(jìn)行了臨床觀察。結(jié)果證明，盡管不同DTaP的免疫保護(hù)率有所差異，但DTaP具有與吸附百日咳全細(xì)胞疫苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合疫苗(adsorbed whole cell pertussis vaccine,diphtheriatoxiod,tetanus toxoid combined vaccine ； DTwP)同樣免疫保護(hù)效果。此外，不論從日本歷年累計(jì)的接種反應(yīng)資料，還是其他國家的臨觀察資料，都證明DTaP的副反應(yīng)明顯低于DTwP [23]。目前從世界范圍內(nèi)，各國的百日咳疫苗都處于更新?lián)Q代的階段，即新的無細(xì)胞百白破疫苗逐步取代傳統(tǒng)的菌體百白破疫苗。至今已有近30個(gè)國家批準(zhǔn)使用DTaP或正在進(jìn)行DTaP的臨床評(píng)估。目前，歐美、加拿大和日本等國已普遍使用無細(xì)胞百日咳疫苗。我國是于80年代中期開始研制無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，90年代中期獲得正式生文號(hào)。無細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)工藝是沿用日本的無細(xì)胞百日咳生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)。工藝基本上包括大發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)菌，硫酸銨沉淀，高鹽濃度提取、 透析和糖梯度離心等。由于我國人口眾多，每年出生嬰兒逾二千萬，目前無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)量較低，只有極少數(shù)兒童才能使用無細(xì)胞百日咳疫苗，因此，從我國的計(jì)劃免疫預(yù)防工作的安全性和與國際接軌的要求來看，我國急需大力生產(chǎn)和發(fā)展自己的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，滿足每年出生嬰兒逾二千萬的免疫接種的需要，從而在我國實(shí)現(xiàn)以安全、有效的無細(xì)胞百白破疫苗全面替代全細(xì)菌體百白破疫苗，造福于廣大兒童。2、各國的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的現(xiàn)狀1981年日本的佐藤教授等人在純化出LPF和FHA兩種抗原的基礎(chǔ)上，在世界上第一次研制成功了含有兩種抗原成分的無細(xì)胞百日咳疫苗，并且與白喉和傷風(fēng)類毒素聯(lián)合成無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。該疫苗在日本開始正式使用，目前日本已經(jīng)全部取代了老的菌體百白破疫苗用于兒童計(jì)劃免疫接種。1992年美國正式批準(zhǔn)使用日本生產(chǎn)的無細(xì)胞百日咳疫苗。中國自80年代開始研制無細(xì)胞百日咳疫苗，目前我國已有無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗正式產(chǎn)品，已經(jīng)在我國許多省份用于兒童計(jì)劃免疫，由于該類型疫苗接種反應(yīng)好于老的百白破疫苗，很受國內(nèi)歡迎，產(chǎn)品供不應(yīng)求。目前，無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的配方在國際上有所不同，白喉和破傷風(fēng)類毒素的使用量也不同，成品中的吸附劑含量也有區(qū)別，按照含有百日咳抗原的類型主要分為幾種 DPT+FHA ；2)PT+FHA+Prn ；3)PT+FHA+Prn+Agg2，3 [25]。歐洲使用比較多的是第 2 和第 3 種。 美國使用的主要是第1和第2種，中使用的是第一種配方，生產(chǎn)工藝是參照日本的無細(xì)胞百日咳生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)，我國的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗已納入《中國生物制品規(guī)程》2000 版中。3、吸附無細(xì)胞百白破疫苗使用情況1981年日本率先研制成功含有PT、FHA的無細(xì)胞百白破疫苗，到目前日本全國已經(jīng)全部使用無細(xì)胞百、白、破疫苗用于預(yù)防百日咳、白喉和破傷風(fēng)三種嚴(yán)重傳染病，日本自 1989年起累計(jì)使用了 3千多萬人次。世界衛(wèi)生組織自1986年組織在瑞典進(jìn)行了第一次臨床試用無細(xì)胞百日咳疫苗起，至今世界上有十多個(gè)國家已經(jīng)使用了該類疫苗。美國每年從日本進(jìn)口無細(xì)胞百日咳疫苗原液，用于兒童免疫預(yù)防百日咳。亞洲除日本外，印尼、泰國、韓國和臺(tái)灣地區(qū)都從日本進(jìn)口無細(xì)胞百白破疫苗用于免疫接種。中國許多較發(fā)達(dá)地區(qū)已經(jīng)開始大范圍使用無細(xì)胞百白破疫苗，但是由于生產(chǎn)的疫苗數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要，造成很大的疫苗供應(yīng)缺口。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的之一是提供一種副反應(yīng)更小，免疫原性更高，接種更安全，接種人群更廣泛的新疫苗及其制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，通過將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類毒素和破傷風(fēng)毒素混合最終制備得到可用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述方法采用包括戊二醛解毒步驟的方法來制備包含有效抗原PT和FHA的無細(xì)胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50μ gPN/ml，然后加入戊二醛使其最終濃度為0. 5%，置于20°C脫毒，每1小時(shí)振搖一次，然后加入賴氨酸溶液，使其最終濃度為0. 2%，置于20°C作用3小時(shí)；采用包括甲醛解毒步驟的方法來制備白喉類毒素和破傷風(fēng)毒素，其中制備白喉類毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為選擇0. 5%的甲醛，經(jīng)調(diào)pH至7. 0 7. 2，在37 39°C下脫毒，然后加入賴氨酸(9. 125% )，脫毒42天左右；制備破傷風(fēng)毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為甲醛0. 15%，放置于37°C溫箱中加溫脫毒25天。制備百日咳原液的菌種為百日咳I相菌種 58003 (CS)，其接種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為將配制好SSM培養(yǎng)基加入IOL發(fā)酵罐，接種細(xì)菌的培養(yǎng)濃度為3. OX 108/ml，培養(yǎng)溫度為37°C，通氣量40 60L/min，壓力0. lkg/cm2，攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為350rpm。制備無細(xì)胞百日咳原液的方法還包括硫酸銨鹽析、密度梯度離心步驟，其中的硫酸銨鹽析是二次鹽析，硫酸銨鹽析的具體操作條件如下收集培養(yǎng)物并加入低濃度的硫酸銨進(jìn)行一次鹽析，7日后經(jīng)3500rpm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS進(jìn)行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘，經(jīng)7000rpm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rpm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS 二次浸提3天，每天攪拌2 次，每次1小時(shí)，包袋透析，銨根檢測合格后，透析內(nèi)液經(jīng)16000rpm離心，3小時(shí)收上清。制備無細(xì)胞百日咳原液的的密度梯度離心是經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心18 20小時(shí)除去內(nèi)毒素，收集糖濃度為4% 12%之間的樣品。在制備無細(xì)胞百日咳原液時(shí)，進(jìn)行戊二醛脫毒后，將所得原液包透析袋，每袋200 300ml，置于2 8°C，透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測。制備得到百日咳原液、白喉類毒素和破傷風(fēng)毒素后，配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至2%ig/ml，將百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類毒素加入氫氧化鋁，于20-25°C攪拌吸附4小時(shí)。本發(fā)明采用硫酸銨鹽析法，再經(jīng)過蔗糖密度梯度離心，去除內(nèi)毒素，獲得百日咳有效抗原PT和FHA，經(jīng)過檢測這兩種有效抗原的純度完全可以達(dá)到國家藥典要求的“純度達(dá)到85%以上”的標(biāo)準(zhǔn)。1、選取菌株制備培養(yǎng)基1. 1 菌株1. 1. 1百日咳I相菌58003 (CS)菌株來源于中國藥品生物制品檢定所1. 1. 2白喉棒狀桿菌菌株(PW8)菌株來源于中國藥品生物制品檢定所1. 1. 3破傷風(fēng)厭氧芽孢桿菌菌株(L58)菌株來源于中國藥品生物制品檢定所1. 2培養(yǎng)基1.2. 1包-姜氏培養(yǎng)基1.2. 2改良林氏培養(yǎng)基1.2. 3半固體碎肉培養(yǎng)基1. 2. 4綜合培養(yǎng)基和半綜合培養(yǎng)基1. 2. 5改良馬丁培養(yǎng)基和牛肉消化的林氏培養(yǎng)基1.2. 6雙胨培養(yǎng)基上述培養(yǎng)基均由公司培養(yǎng)基組提供1. 3 試齊[J1. 3. 1百日咳I相標(biāo)準(zhǔn)血清(93-1)來源中國藥品生物制品檢定所1. 3. 2百日咳分型血清1、2、3型(84_1)來源中國藥品生物制品檢定所所用化學(xué)試劑均為分析純，2、菌種庫的建立及鑒定2. 1、百日咳菌種庫的建立及檢定將原始種子批的凍干菌種啟開后接種于包-姜氏(含25%羊血)培養(yǎng)基上，于 35 37°C，培養(yǎng)不超過72小時(shí)，以后各代不超過48小時(shí)，傳至第4代，培養(yǎng)M小時(shí)，刮下菌苔，于脫脂牛奶內(nèi)混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20°C保存，為主代種子批菌種。主代種子批菌種檢定啟開1支主代種子批菌種，于改良B-G固體培養(yǎng)基上，37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，檢查菌落生長情況為光滑凸起，灰白色不透明露滴狀小菌落，菌落周圍有不清晰溶血環(huán)。傳3代，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，菌苔生長不透明，灰白色，光滑，濕潤；刮取菌苔，進(jìn)行以下檢定
2. 1. 1菌落形態(tài)為光滑凸起，灰白色不透明露滴狀小菌落，菌落周圍有不清晰溶血環(huán)。2. 1. 2革蘭氏染色革蘭氏陰性短小卵圓形桿菌。2. 1.3血清學(xué)特性標(biāo)準(zhǔn)診斷血清購自中國藥品生物制品檢定所。試管凝集試驗(yàn)百日咳I相標(biāo)準(zhǔn)血清批號(hào)93-1 ；刮取菌苔，用比濁法測定菌液濃度，并用0. 85% NaCl溶液稀釋至30億/ml。血清稀釋度200X、400X、800X、1600X、 3200 X,6400 X ,12800 X ,每管加入以上稀釋度血清0. 5ml，加菌液(30億/ml)0. 5ml，使之實(shí)際血清稀釋度為400X、800X、1600X ,3200X ,6400X、12800X，混勻，置3°C過夜，再靜置室溫2小時(shí)，判斷凝集效。玻片凝集試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)分型因子血清批號(hào)84-1 (1、2、3型)，將標(biāo)準(zhǔn)分型血清分別與刮下的菌苔進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。2. 1.4生化檢定各管加菌液(60億/ml)0. 5ml，混勻后置;35_37°C培養(yǎng)7日，2. 1. 5皮膚壞死試驗(yàn)用在37°C培養(yǎng)48小時(shí)的菌苔混懸液稀釋，豚鼠皮內(nèi)注射0. 1ml，觀察72小時(shí)，記錄出血性壞死部位，用“ + ”表示。2. 1.6菌種毒力試驗(yàn)用體重16 18g之小鼠隨即分為3組，每組免疫10只，在麻醉狀態(tài)下從鼻腔滴入經(jīng)培養(yǎng)20 28小時(shí)以PBS稀釋的菌液0. 05mL，觀察14天，記錄小鼠生死情況，按 ReedMuench 法計(jì)算 LD50，2. 1.7免疫效力試驗(yàn)分別用標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品的不同稀釋度免疫小鼠(8只/組)，每只小鼠腹腔注射 0.5ml。免疫14天后，每只小鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml含8萬個(gè)菌的菌液(1832 ；同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組毒力測定，對(duì)照組每稀釋度攻擊10只小鼠。攻毒后，記錄小鼠14天內(nèi)死亡情況，計(jì)算出對(duì)照組LD5tl ；并計(jì)算待檢菌種的IU值。2. 2、白喉棒狀桿菌菌種庫的建立及檢定將凍干的原始白喉棒狀桿菌菌種(38007)啟開后，接種于改良林氏培養(yǎng)基中管， 34°C培養(yǎng)M 48小時(shí)，再傳代于改良林氏培養(yǎng)基中管中，連續(xù)傳4代，離心后將菌體放置于脫脂牛奶內(nèi)混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20°C保存，為主代種子批菌種。白喉棒狀桿菌菌種檢定將凍干的主代種子批白喉棒狀桿菌菌種(38007)啟開后，接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34°C培養(yǎng)M 48小時(shí)，按照《中國生物制品規(guī)程》2000版中白喉菌種的檢定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)凍干的白喉棒狀桿菌的主代種子批進(jìn)行以下菌種檢定。2. 2. 1培養(yǎng)及形態(tài)特性將培養(yǎng)好的白喉棒狀桿菌分別接種于以下三種不同的培養(yǎng)基上，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)特性的檢查。方法和判定呂氏斜面培養(yǎng)菌苔呈灰白色，表面光滑突起；菌落圓形，邊緣整齊。亞碲酸鉀平板培養(yǎng)菌落呈灰黑色具金屬光澤。
血瓊脂平板培養(yǎng)菌落呈灰白色，不透明，不產(chǎn)生α溶血素。2. 2. 2鏡檢及染色特性方法和判定將培養(yǎng)好的白喉棒狀桿菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察為深紫色，說明革蘭氏染色陽性，并且具有異染顆粒，桿狀的菌體呈一端或兩端膨大，菌體排列呈柵欄、X或Y。2. 2. 3生化特性將菌液接種于各生化培養(yǎng)基中，35 37°C培養(yǎng)7日。2. 2. 4特異性中和反應(yīng)將接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34°C培養(yǎng)M 48小時(shí)的白喉主代種子批的細(xì)菌接種于呂氏培養(yǎng)基上，進(jìn)行毒力測定。方法和判定Elek平板毒力試驗(yàn)用濃度為1000Lf/ml的白喉抗毒素制成抗毒素濾紙條，平整鋪于Elek瓊脂培養(yǎng)基或適宜的白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基的雙碟上，倒置雙碟約1小時(shí)。用白金接種環(huán)挑取呂氏培養(yǎng)物，與濾紙垂直劃線接種。置于37°C孵箱，培養(yǎng)48 72小時(shí)，觀察菌種生長邊緣是否有白色沉淀線。2. 3、破傷風(fēng)芽孢桿菌菌種庫的建立及檢定將凍干的原始破傷風(fēng)厭氧芽孢桿菌菌株(L58)菌種啟開后，接種于半固體碎肉培養(yǎng)基中管，放置于34°C孵箱，培養(yǎng)48小時(shí)，連續(xù)傳4代，離心后將菌體放置于脫脂牛奶內(nèi)混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20°C保存，為主代種子批菌種。將破傷風(fēng)厭氧芽孢桿菌菌株(L58)主代種子批菌種啟開后，接種于半固體碎肉培養(yǎng)基中管，放置于34°C培養(yǎng)48小時(shí)， 收集菌體，用于以下菌種檢定內(nèi)容。2. 3. 1培養(yǎng)及形態(tài)特性由于破傷風(fēng)是專性厭氧桿菌，將培養(yǎng)好的破傷風(fēng)桿菌接種于不同培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)基形態(tài)特征檢測。方法和判定在庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉湯呈渾濁，產(chǎn)生氣體，具腐敗性惡臭。血瓊脂平板培養(yǎng)菌落呈彌漫生長。半固體培養(yǎng)基經(jīng)48-72小時(shí)培養(yǎng)，穿刺線呈毛刷樣生長，表現(xiàn)菌體鞭毛動(dòng)力。2. 3. 2鏡檢及染色特性方法和判定將破傷風(fēng)桿菌的初期培養(yǎng)菌體進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，革蘭氏染色呈陽性，少見芽孢。培養(yǎng)48小時(shí)以后，可見芽孢，菌體呈鼓槌狀，芽孢位于頂端為正圓形。2. 3. 3生化特性將菌液接種于各生化培養(yǎng)基中，35 37°C培養(yǎng)7日，2. 3. 4產(chǎn)毒試驗(yàn)方法和判定破傷風(fēng)桿菌經(jīng)液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)，過濾取培養(yǎng)液注射至少4只體重18 22g小鼠，每只小鼠尾根部皮下注射0. 1ml，于注射后12 M小時(shí)觀察小鼠，出現(xiàn)尾部僵直豎起、 后退強(qiáng)直痙攣或全身肌肉痙攣等癥狀。2. 3. 5特異性中和反應(yīng)
方法和判定取適量產(chǎn)毒培養(yǎng)濾液與相應(yīng)稀釋的破傷風(fēng)抗毒素經(jīng)體外中和后，注射4只體重 18-22g小鼠，同時(shí)設(shè)立不結(jié)合破傷風(fēng)抗毒素的培養(yǎng)濾液注射小鼠，作為陽性對(duì)照。注射后每日觀察，陽性對(duì)照出現(xiàn)明顯破傷風(fēng)癥狀并死亡，試驗(yàn)組小鼠存活。


圖1為吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗成品生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式例1無細(xì)胞百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類毒素的制備1. 1、無細(xì)胞百日咳原液的制備1. 1. 1百日咳I相菌種58003 (CS)接種與BG血培養(yǎng)基大管培養(yǎng)3 4代培養(yǎng)時(shí)間選擇38 44小時(shí)，控制pH值8. 5左右時(shí)，百日咳桿菌的菌體濃度和血凝活性較高。1. 1. 2接種發(fā)酵罐培養(yǎng)將配制好SSM培養(yǎng)基加入IOL發(fā)酵罐，接種細(xì)菌的培養(yǎng)濃度為3.0X108/ml，培養(yǎng)溫度為37°C，通氣量40 60L/min，壓力0. lkg/cm2，攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為350rpm。培養(yǎng)至 26個(gè)時(shí)開始測量發(fā)酵液的pH，濃度，血凝，每隔池取樣測量以上參數(shù)，共檢測發(fā)酵時(shí)間為50 小時(shí)。1.1.3硫酸銨鹽析收集培養(yǎng)物并加入低濃度的硫酸銨進(jìn)行一次鹽析、7日后經(jīng)3500rPm離心40分鐘， 棄上清，沉淀中加入PBS (0. 05MPB、IMNaCl、0. lg/L硫柳汞、pH8. 0)進(jìn)行一次浸提，每天攪拌 2次，每次40分鐘。經(jīng)7000rPm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、 經(jīng)9000rPm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS (0. 05MPB、mNaCl、0. lg/L硫柳汞、pH8. 0) 二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時(shí)，包袋透析，銨根檢測合格后，透析內(nèi)液經(jīng)16000rPm離心3小時(shí)收上清。1. 1. 4密度梯度離心經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心18 20小時(shí)除去內(nèi)毒素，收集糖濃度為4 0Z0 12%之間的樣品。其中含有PT和FHA組分。1.1. 5戊二醛脫毒戊二醛解毒的濃度為％，在22士2°C的溫度下解毒時(shí)間4小時(shí)。將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50μ gPN/ml，然后加入戊二醛使之最終戊二醛濃度為0.5%，置于20°C脫毒。每1小時(shí)振搖一次。然后加入賴氨酸溶液，使之最終濃度為0.2%，置于20°C作用3小時(shí)。1. 1.6無細(xì)胞百日咳原液包透析袋，每袋200 300ml，置于2 8°C。透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測。合格后可收液，否則繼續(xù)透析，透析過程每日換透析液2次。1. 1. 7檢測及肯定的檢測結(jié)果經(jīng)檢測可以確定上述制備方法最終制備得到的產(chǎn)品中包含目標(biāo)抗原PT和FHA，且含量達(dá)到相應(yīng)的要求。1.2精制白喉類毒素的制備1.2. 1菌種培養(yǎng)采用改良的林氏液體培養(yǎng)基，采用靜止培養(yǎng)和深層培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式。深層培養(yǎng)方式可以補(bǔ)加氨基酸，調(diào)整PH，通過攪拌和控制通氧量及溫度，使得產(chǎn)毒水平大幅度增加。a)大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)菌時(shí)發(fā)酵溫度控制在M 35°C ；b)pH的變化控制為開始發(fā)酵時(shí)pH為7. 8 8. 2，以后隨著培養(yǎng)時(shí)間會(huì)逐步下降， 約12小時(shí)以后，pH會(huì)從8. 0逐步降到7. 0，然后再逐步回升到8. 0，通過補(bǔ)入適當(dāng)?shù)奶羌右钥刂芇H，在這種條件下說明細(xì)菌生長茂盛，產(chǎn)毒較好。如果pH不斷下降，說明細(xì)菌生長不佳。c)根據(jù)培養(yǎng)條件補(bǔ)充碳源和氮源，麥芽糖作為碳源，在pH發(fā)生變化時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充。在白喉?xiàng)U菌深層培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)氨基氮從1. 4 1. 6mg/ml下降到0. 4 0. 7mg/ml時(shí)，補(bǔ)充谷氨酸鈉，胱氨酸及生長因子可使產(chǎn)毒單位從150Lf/ml提高到400Lf/ml?？刂婆囵B(yǎng)時(shí)間在45 50小時(shí)之間，這時(shí)的白喉毒素的Lf/ml產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，并且pH值也基本恒定在8. 0左右的生產(chǎn)條件下較為合適。1.2. 2上清硫酸銨鹽析采用硫酸銨分段沉淀法，第一段加入硫酸銨對(duì)-27% (w/v)，過濾后收集濾液，第二段加入硫酸銨15-18% (w/v)，過濾后收集沉淀。經(jīng)過透析去除-NH4離子，再經(jīng)過除菌過濾，獲得大于1500Lf/ml的精制白喉類毒素。1.2. 3 脫毒我們采用的解毒方式是首先將生產(chǎn)的精制毒素，毒素濃度過大，不宜解毒完善，精制后的毒素經(jīng)適當(dāng)稀釋至濃度為40Lf/ml左右時(shí)，再進(jìn)行解毒，解毒效果較完全，毒性不易發(fā)生逆轉(zhuǎn)。然后再進(jìn)行解毒的工藝，這樣可以減少所生產(chǎn)的毒素?fù)p失。精制毒素的解毒選擇了 0. 5%的甲醛濃度，經(jīng)調(diào)pH至7. 0 7. 2，在37 39°C下脫毒，經(jīng)一步脫毒和兩步的加深脫毒試驗(yàn)的比較，采用加入賴氨酸(9. 125% )，脫毒42天左右，控制了毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，并且能有效的保持抗原性。1.2. 4除菌過濾將上述收集的類毒素純化液用0. 2um的膜包進(jìn)行過濾除菌。1.2. 5得到原液包透析袋，每袋200 300ml，置于2 8°C。透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測。合格后可收液，否則繼續(xù)透析，透析過程每日換透析液2次。1. 2. 6檢測及肯定的檢測結(jié)果經(jīng)檢測可以確定所述制備方法最終制備得到的產(chǎn)品中包含目標(biāo)抗原，且含量達(dá)到相應(yīng)的要求。1.3破傷風(fēng)類毒素的制備1. 3. 1菌種在半固體中管培養(yǎng)菌種在半固體碎肉培養(yǎng)基中管培養(yǎng)，放置于34°C培養(yǎng)48小時(shí)，收集菌體。1.3. 2發(fā)酵罐培養(yǎng)由于破傷風(fēng)是專性厭氧菌，培養(yǎng)中必須保證厭氧條件。
a)培養(yǎng)基與空氣接觸面盡量要小，菌種培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基中管培養(yǎng)基要達(dá)到管長的三分之二 ；b)蜂窩性有利于厭氧菌生長，可在液體培養(yǎng)基中加入很少量脫脂棉；c)在培養(yǎng)時(shí)加入少量的半胱氨酸，抗壞血酸及葡萄糖；d)培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌的接種量不可過少，避免造成細(xì)菌不易繁殖；e)毒素培養(yǎng)方式選用大罐靜止培養(yǎng)結(jié)合通氣攪拌，當(dāng)培養(yǎng)到M-30小時(shí)開始通氣(10-20升/分)，間隔6小時(shí)攪拌一次，每次3-5秒(轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分)，培養(yǎng)溫度為 34°C。一般最適溫度為34 35°C，過高或過低均可使破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒量下降。1.3. 3上清硫酸銨鹽析硫酸銨二段沉淀法。第一段過濾收集濾液，第二段過濾收集沉淀。第一段加入硫酸銨13-16% (w/v)，第二段加入硫酸銨10-12% (w/v)，精制室溫保持15°C 士，經(jīng)過該方法提純精制的破傷風(fēng)毒素都可達(dá)到1500Lf/ml以上，符合國家藥典中的要求。1.3. 4 脫毒破傷風(fēng)毒素解毒時(shí)，在適宜的情況下加入甲醛，可使毒素失去毒性而保持其抗原性，按照40%的甲醛量計(jì)算，加入甲醛量為0. 15%，放置于37°C溫箱中加溫脫毒25天。1.3. 5除菌過濾將上述收集的類毒素純化液用0. 2um的膜進(jìn)行過濾除菌。1.3. 6得到原液包透析袋，每袋200 300ml，置于2 8°C。透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測。合格后可收液，否則繼續(xù)透析，透析過程每日換透析液2次。1. 3. 7檢測及肯定的檢測結(jié)果經(jīng)檢測可以確定所述制備方法最終制備得到的產(chǎn)品中包含目標(biāo)抗原，且含量達(dá)到相應(yīng)的要求。2、無細(xì)胞百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類毒素加入氫氧化鋁吸附配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至2%ig/ml，百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類毒素加入氫氧化鋁，于20-25°C攪拌吸附4小時(shí)。3、稀釋配成半成品配置成每Iml稀釋原液含百日咳原液18 μ g PN、精制白喉類毒素25Lf、破傷風(fēng)類毒素7Lf，配制成百白破疫苗的半成品，調(diào)節(jié)pH值至5. 8 7. 2。4、分裝成品上述半成品采用洗烘灌聯(lián)動(dòng)機(jī)組分裝，玻璃管制注射劑瓶盛裝，分裝規(guī)格為 0. 5ml/瓶，分裝過程中自動(dòng)加鹵化丁基橡膠塞，分裝完成后，在分裝后6小時(shí)內(nèi)凍干；凍干完成即進(jìn)行真空壓塞和軋蓋；完成軋蓋的制品進(jìn)行透視檢查及貼簽；完成貼簽的制品即凍干疫苗成品，送2 8°C冷庫保存。每瓶0.5ml、1.0ml、2. 0ml、5. 0ml。每1次人用劑量0. 5ml，含無細(xì)胞百日咳疫苗效價(jià)應(yīng)不低于4. 0IU,白喉疫苗效價(jià)應(yīng)不低于30IU，破傷風(fēng)疫苗效價(jià)應(yīng)不低于40IU。
權(quán)利要求
1.一種制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其通過將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類毒素和破傷風(fēng)毒素混合最終制備得到可用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述方法包括如下步驟(1)采用包括戊二醛解毒步驟的方法來制備包含有效抗原PT和FHA的無細(xì)胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50ygPN/ml，然后加入戊二醛使其最終濃度為0. 5%，置于20°C脫毒，每1小時(shí)振搖一次，然后加入賴氨酸溶液，使其最終濃度為0. 2%，置于20°C作用3小時(shí)；(2)采用包括甲醛解毒步驟的方法來制備白喉類毒素和破傷風(fēng)毒素，其中制備白喉類毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為選擇0. 5%的甲醛，經(jīng)調(diào)pH至7. 0 7. 2，在37 39°C 下脫毒，然后加入賴氨酸(9. 125%)，脫毒42天左右；制備破傷風(fēng)毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為甲醛0. 15%，放置于37°C溫箱中加溫脫毒25天。
2.權(quán)利要求1所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于用于制備百日咳原液的菌種為百日咳I相菌種58003 (CS)。
3.權(quán)利要求1所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于百日咳I相菌種58003(a)的接種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為將配制好SSM培養(yǎng)基加入IOL發(fā)酵罐，接種細(xì)菌的培養(yǎng)濃度為3. OX 108/ml，培養(yǎng)溫度為37°C，通氣量40 60L/min，壓力0. lkg/cm2，攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為350rpm。
4.權(quán)利要求1所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無細(xì)胞百日咳原液的方法還包括硫酸銨鹽析、密度梯度離心步驟。
5.權(quán)利要求4所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無細(xì)胞百日咳原液的硫酸銨鹽析是二次鹽析。
6.權(quán)利要求5所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于硫酸銨鹽析的具體操作條件如下收集培養(yǎng)物并加入低濃度的硫酸銨進(jìn)行一次鹽析，7日后經(jīng)3500rpm 離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS進(jìn)行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘，經(jīng) 7000rpm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rpm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS 二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時(shí)，包袋透析，銨根檢測合格后，透析內(nèi)液經(jīng)16000rpm離心3小時(shí)后收取上層清液。
7.權(quán)利要求4所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無細(xì)胞百日咳原液的密度梯度離心是經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心18 20小時(shí)除去內(nèi)毒素，收集糖濃度為4% 12%之間的樣品。
8.權(quán)利要求1所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于在制備無細(xì)胞百日咳原液時(shí)，進(jìn)行戊二醛脫毒后，將所得原液包透析袋，每袋200 300ml，置于2 8°C，透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測。
9.權(quán)利要求1所述的制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備得到的百日咳原液、白喉類毒素和破傷風(fēng)毒素后，配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至2%ig/ml，將百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類毒素加入氫氧化鋁，于 20-25°C攪拌吸附4小時(shí)。
10.權(quán)利要求9所述的方法制備得到的吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于獲得百日咳有效抗原PT和FHA，經(jīng)過檢測這兩種有效抗原的純度達(dá)到85 %以上，且含無細(xì)胞百日咳疫苗效價(jià)應(yīng)不低于4. 0IU,白喉疫苗效價(jià)應(yīng)不低于30IU，破傷風(fēng)疫苗效價(jià)應(yīng)不低于 40IU。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用百日咳、白喉、破傷風(fēng)菌種培養(yǎng)類毒素制備百白破疫苗的方法，所述方法采用硫酸銨鹽析、密度梯度離心、戊二醛脫毒的方式來制備包含有效抗原PT和FHA的無細(xì)胞百日咳原液，通過將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類毒素和破傷風(fēng)毒素混合最終制備得到可用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102526717SQ20111038261
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者侯文禮, 馮曉, 廖常茹, 趙志鵬, 鐘澤榮 申請(qǐng)人:成都康華生物制品有限公司