專利名稱：Cd200在制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及⑶200或⑶200融合蛋白在制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種可累及多個臟器組織的自身免疫性疾病，免疫調(diào)節(jié)缺陷特別是免疫耐受喪失、自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物沉積、細(xì)胞因子失衡和炎癥應(yīng)答失控為其主要的免疫病理機(jī)制。而吞噬功能障礙使得凋亡細(xì)胞不能及時被清理以致大量自身抗原釋放誘發(fā)自身免疫被認(rèn)為是疾病啟動的重要環(huán)節(jié)，但 內(nèi)在機(jī)制不清。此外，⑶4+Q)25hlghFoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs),作為維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)組分，在SLE患者中存在數(shù)量和/或質(zhì)量上的缺陷，參與了 SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。⑶200是隸屬免疫球蛋白超家族的I型跨膜糖蛋白，可表達(dá)于多種細(xì)胞，包括B細(xì)胞、活化T細(xì)胞、樹突細(xì)胞(dendritic cells, DCs)以及神經(jīng)元細(xì)胞。⑶200分子由胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段三個結(jié)構(gòu)域組成，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域缺乏信號基序。CD200受體包括⑶200R1-4，其中⑶200R1親和力最高。⑶200受體主要分布于髓系來源的細(xì)胞如DCs、巨噬細(xì)胞，也表達(dá)于活化T細(xì)胞。已知⑶200/⑶200R1信號通路具有免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒、下調(diào)巨噬細(xì)胞功能等。Hoek等發(fā)現(xiàn)CD200缺乏的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞/髓系細(xì)胞的內(nèi)源性活化增加，對實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)的易感性增加。給予 CD200R_Ig 阻斷 CD200-CD200R的相互作用可增加小鼠對CIA的易感性。Broderick等也報道阻斷⑶200可導(dǎo)致小鼠早發(fā)實驗性自身免疫性視網(wǎng)膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU) oRosenblum等人在研究CD200敲除小鼠中紫外線介導(dǎo)半抗原耐受的實驗中發(fā)現(xiàn)，皮膚細(xì)胞表達(dá)的CD200在先天性自身免疫性脫發(fā)中發(fā)揮重要作用。盡管諸多證據(jù)顯示CD200/CD200R1在實驗性自身免疫性疾病中具有重要作用，這一信號通路在人類的自身免疫性疾病如SLE中的作用仍不明確。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供CD200或CD200融合蛋白在制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物中的應(yīng)用。其中，CD200可單獨或與其他片段融合成融合蛋白進(jìn)行應(yīng)用，所述的融合蛋白可優(yōu)選為CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-細(xì)胞因子，更優(yōu)選為CD200Fc融合蛋白。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種糾正SLE患者中誘導(dǎo)生成⑶4+⑶25highFoxP3+Treg細(xì)胞缺陷的方法，其為施用有效量的CD200或CD200融合蛋白。其中，所述的誘導(dǎo)生成⑶4+CD25highFoxP3+Treg細(xì)胞缺陷為TGF-P信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子誘導(dǎo)生成⑶4+⑶25highFoxP3+Treg細(xì)胞缺陷。再進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物，其為含有治療有效量的⑶200或⑶200融合蛋白。所述的融合蛋白可優(yōu)選為CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-細(xì)胞因子，更優(yōu)選為⑶200Fc融合蛋白。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供激動型抗⑶200R1抗體在制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物中的應(yīng)用。更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物，其含有治療有效量的激動型抗⑶200R1抗體。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，所述的藥物中還可含有常規(guī)的輔料，并將藥物制備成本領(lǐng)域常規(guī)的劑型，如片劑、注射劑等。本發(fā)明表明，SLE患者中⑶200+細(xì)胞和血清⑶200水平顯著增高，而⑶200R1 mRNA和蛋白水平均顯著下降，以⑶4+T細(xì)胞和DCs尤為顯著。SLE患者中，⑶200Fc可減少Th 17細(xì)胞比例并糾正⑶4+CD25highFOXP3+Treg的誘導(dǎo)缺陷。而拮抗性抗⑶200R1抗體可促進(jìn)抗⑶3/抗⑶28刺激的⑶4+T細(xì)胞增殖。此外，還發(fā)現(xiàn)SLE患者早期凋亡細(xì)胞的⑶200表達(dá)上調(diào)并可抑制DCs對其結(jié)合和吞噬的能力。當(dāng)體外給予足量的外源性⑶200分子時能夠糾正系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育缺陷和減少Thl7的發(fā)育分化并抑制DC的遷移趨化功能，而已有較多證據(jù)證實調(diào)節(jié)T細(xì)胞缺陷和Thl7細(xì)胞增多及DC的功能異常參與SLE的發(fā)病機(jī)制，表明CD200分子可能具有潛在的治療價值。而制備高親和力的CD200重組蛋白是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，應(yīng)用簡單，可通過體內(nèi)對調(diào)節(jié)T細(xì)胞和Thl7細(xì)胞及DC細(xì)胞的調(diào)節(jié)而多環(huán)節(jié)發(fā)揮治療作用，可制備成系統(tǒng)性紅斑狼瘡的新型治療藥物。拮抗性抗CD200R1抗體能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，表明激動型抗CD200R1能發(fā)揮抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用，而CD200發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用需通過受體實現(xiàn)。體外實驗中給予足量的⑶200分子是通過結(jié)合并激動⑶200R特別是⑶200R1實現(xiàn)的，因此，表明激動型抗CD200R1發(fā)揮抑制淋巴細(xì)胞增殖及多環(huán)節(jié)免疫調(diào)節(jié)作用，從而抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)過度亢進(jìn)的免疫狀態(tài)而發(fā)揮治療作用。


圖I所示為SLE患者和健康對照⑶200和⑶200R1的表達(dá)。其中，A, SLE患者PBMC中的⑶200表達(dá)上調(diào)。直方圖顯示PBMC中⑶200+細(xì)胞，灰色部分為同型對照；B，SLE患者(n=53)和健康對照(n=24)的PBMC及CD4+T細(xì)胞、CD14.單核細(xì)胞(CDM+Mo)、CDllcXD123highpDC(pDC)和 CDllc+CD1231nDC(mDC)等各亞群中 CD200+細(xì)胞比例；C, SLE 患者中，⑶3+⑶200+細(xì)胞比例與血清C3水平負(fù)相關(guān)；D，SLE患者PBMC中⑶200R1的表達(dá)下調(diào)。直方圖顯示PBMC中的⑶200R1+細(xì)胞，灰色部分為同型對照；E，SLE患者(n=53)和健康對照(n=24)的 PBMC 及 CD4+T 細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞(CDM+Mo)、CDllcXD123high pDC(pDC)和CDllc+CD1231nDC(mDC)等各亞群中 CD200R1+ 細(xì)胞比例；F，SLE 患者 PBMC 中 CD200mRNA 和⑶200RlmRNA表達(dá)均顯著低于健康對照；G，SLE患者中血清⑶200水平與血清C3水平負(fù)相關(guān)(r=_0. 45, p=0. 014)。圖2所示為漿樣樹突細(xì)胞PDC (⑶I lc_CD123high) (Gate2)和髓樣樹突細(xì)胞mDC (CD11c+CD1230 (Gate3)中 CD200 表達(dá)的流式圖。圖3 所示為純真 T 細(xì)胞(naive T) (CD4+CD45RA+)和記憶 T 細(xì)胞(CD4+CD45R0+)中⑶200R1表達(dá)的流式圖。圖4所示為PBMC中D0K2(左圖)和p-D0K2(右圖)表達(dá)的免疫印跡分析。⑶200Fc可誘導(dǎo)D0K2 (右圖泳道2)磷酸化，這一作用可通過與拮抗性抗⑶200R1抗體的預(yù)孵育而阻斷(右圖泳道3)。圖5所示為⑶200Fc和拮抗性抗⑶200R1抗體對于抗⑶3/抗⑶28刺激的⑶4+T細(xì)胞增殖的影響。其中，A, SLE和健康對照中，⑶200Fc對于抗⑶3/抗⑶28刺激的⑶4+T細(xì)胞增殖無顯著影響。B，SLE患者中，拮抗性抗⑶200R1抗體可促進(jìn)抗⑶3/抗⑶28刺激下的CD4+T細(xì)胞增殖，并呈量效關(guān)系。健康對照中無此發(fā)現(xiàn)。流式散點圖為代表圖，共進(jìn)行了5例SLE和5例健康對照的實驗。圖6A，SLE患者(n=30) PBMC中早期自發(fā)凋亡地淋巴細(xì)胞比例(Annexin V+PF) 顯著高于健康對照(n=15) (p=0. 027)。B，早期凋亡細(xì)胞⑶200表達(dá)顯著高于活細(xì)胞CD200 (Annexin V_PI_)，而同種熒光標(biāo)記的CD4無此趨勢(n=45) (p〈0. 001)。C，以早期凋亡細(xì)胞與活細(xì)胞中⑶200的陽性率之比定義的⑶200相對表達(dá)率，SLE患者顯著高于健康對照(p=0. 037)。圖7所示為⑶200Fc抑制DC遷移、結(jié)合并吞噬早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+PF)。其中，A，不成熟DC(PKH67染色，綠色)與靶細(xì)胞(PKH26染色，紅色)共孵育，熒光顯微鏡檢，白色箭頭不成熟DC貼近靶細(xì)胞；黃色箭頭不成熟DC吞噬靶細(xì)胞；左上靶細(xì)胞為⑶200_活細(xì)胞；右上靶細(xì)胞為⑶200+活細(xì)胞；左下靶細(xì)胞為⑶200_凋亡細(xì)胞；右下靶細(xì)胞為⑶200+凋亡細(xì)胞。B，熒光顯微鏡計數(shù)結(jié)合并吞噬了靶細(xì)胞的DC的比例。計數(shù)10個視野內(nèi)的所有細(xì)胞(平均40-50個細(xì)胞/HP，共約計數(shù)400-500個細(xì)胞)。C，流式細(xì)胞儀定量吞噬了靶細(xì)胞的DC(PKH26/PKH67雙陽性)。D，transwell實驗中DC遷移的比例(n=5)。圖8所示為⑶200Fc減少SLE患者Thl7細(xì)胞的分化。SLE患者(n=9)或健康對照(n=6)的PBMC分別與⑶200Fc共培養(yǎng)48h，流式細(xì)胞儀檢測Thl7細(xì)胞比例。圖中所示數(shù)據(jù)以Thl7細(xì)胞所占⑶4+T細(xì)胞的比例表示。A圖顯示一例SLE患者和一例健康對照PBMC分別與⑶200Fc和IgG對照孵育后的Thl7表達(dá)流式代表圖；B圖顯示9例SLE患者PBMC與⑶200Fc和IgG對照孵育的Thl7分化的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。圖9所示為⑶200Fc可糾正SLE患者中TGF- P誘導(dǎo)⑶4+CD25飛細(xì)胞分化為CD4+CD25highFoxP3+Treg細(xì)胞的缺陷。分選SLE和健康對照PBMC中的CD4+CD25_T細(xì)胞，培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基，給予抗⑶3/抗⑶28抗體刺激，并加入IL-2和TGF- ^聯(lián)合培養(yǎng)，給予⑶200Fc處理7天，數(shù)據(jù)來源于5個獨立的實驗。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。FITC、PE、APC 或 PE-Cy7 標(biāo)記的鼠抗人 CD4 (RPA-T4)、CDllc (3. 9)、CD25 (BC96)、CD200R(0X-108)和CD123(6H6)及相應(yīng)同型對照均購自美國BioLegend公司；CD200 (0X104)、IFN- y (B27)、IL-4 (MP4-25)、IL-17 (eBio64DEC17)、Foxp3 (PCHlOl)及相應(yīng)同型對照購自美國eBioscience公司；重組人IL_2、IL_4、TGF_ P I和GM-CSF及相應(yīng)對照購自美國P印roTech公司；重組人CD200_Fc、抗人CD200R1抗體及對照、CD200 Duoset ELISA試劑盒均購自美國R&D公司KD4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞磁珠分選試劑盒(Miltenyi Biotec130-091-301)購自德國美天旎公司；Cell Trace CFSE細(xì)胞增殖試劑盒和凋亡試劑盒(Vybrant Apoptosis Assay Kit # 2)購自美國 Invitrogen公司;PKH26、PKH67、ionomycin和 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)購自美國 Sigma-Aldrich 公司。實施例I流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD200和⑶200R1的表達(dá)I)患者與健康對照選取2009 2011年在北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕科就診的SLE患者161例(見表I)，診斷均符合由美國風(fēng)濕學(xué)會(American College of Rheumatology, ACR) 1987年修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)?；颊呔鶠榕裕挲g12 55歲(平均29. 0±10. 2歲)。另選取性別年齡匹配的健康對照95人。該研究通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會倫理審批。表I SLE患者的特征(n=161)
權(quán)利要求
1.CD200或CD200融合蛋白在制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的CD200融合蛋白為CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-細(xì)胞因子。
3.一種糾正SLE患者中誘導(dǎo)生成⑶4+⑶25highFOXP3+Treg細(xì)胞缺陷的方法，其特征在于，施用有效量的⑶200或⑶200融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)生成⑶4+CD25highFOXP3+Treg細(xì)胞缺陷為TGF-P信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子誘導(dǎo)生成⑶4+CD25highFOXP3+Treg細(xì)胞缺陷。
5.一種治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物，其特征在于，含有治療有效量的CD200或CD200融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于，所述的CD200融合蛋白為CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-細(xì)胞因子。
7.激動型抗CD200R1抗體在制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物中的應(yīng)用。
8.一種治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物，其特征在于，含有治療有效量的激動型抗CD200R1 抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及CD200或CD200融合蛋白在制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物中的應(yīng)用。當(dāng)體外給予足量的外源性CD200分子時能夠糾正系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育缺陷和減少Th17的發(fā)育分化并抑制DC的遷移趨化功能，表明CD200分子具有潛在的治療價值。而制備高親和力的CD200重組蛋白是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，應(yīng)用簡單，可通過體內(nèi)對調(diào)節(jié)T細(xì)胞和Th17細(xì)胞及DC細(xì)胞的調(diào)節(jié)而多環(huán)節(jié)發(fā)揮治療作用，可制備成系統(tǒng)性紅斑狼瘡的新型治療藥物。
文檔編號A61P37/02GK102698266SQ20121015030
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者張烜, 李揚(yáng), 趙麗丹 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院