專利名稱：一種基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及呼吸道合胞病毒(RSV)，具體地說是一種基因NSl缺陷型呼吸道合 胞病毒(ANSI RSV)及其應用。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計，發(fā)病率占全身各種惡性腫 瘤的7-10%。它的發(fā)病常與遺傳有關，以及40-60歲之間、絕經(jīng)期前后的婦女發(fā)病率 較高。通常發(fā)生在乳房腺上皮組織的惡性腫瘤。是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危 及生命的最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌常見于婦女，據(jù)估計全世界每年新增病例超過 一百萬，僅2009年，美國有192370人新診斷為乳腺癌，大約有40170人因此死亡。對 于診斷為無淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺癌的病人，大約24%-30%復發(fā)，而對于已有淋巴結轉(zhuǎn)移 的乳腺癌病人，其復發(fā)率可高達50-60%。根據(jù)病灶是否局限于局部還是有轉(zhuǎn)移的不同， 其中5年存活率分別為26%和80%。目前，尚無較理想的藥物及方法治療乳腺癌。呼吸道合胞病毒屬于副黏液病毒科(Paramyxoviridae)，肺病毒亞科 (Pneumovirinae)中的肺炎病毒(Pneumovirus)，病毒的R N A全長大約為15kb，3'端為 前導序列，5'端為尾端結構，病毒全序列大約有10個病毒基因序列。目前，尚無運用 基因工程改造的呼吸道合胞病毒來治療乳腺癌報導。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術問題本發(fā)明目的是提供一種通過基因工程改造的呼吸道合胞 病毒用于治療乳腺癌。技術方案一種基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是所述基因NSl缺陷 型呼吸道合胞病毒是用Vero細胞合成、Vero細胞經(jīng)用攜帶有NSl-缺陷病毒cDNA、病毒 N，M2-1，P和L基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染而形成。所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，是用反向基因策略刪除呼吸道合胞病毒 中的基因NSl。所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒應用，是應用于治療乳腺癌，殺傷乳腺癌 細胞。所述經(jīng)過基因工程改造的呼吸道合胞病毒可為其他病毒，所說的其他病毒帶有 類似RSVNSl基因，該基因被刪除，從而具有殺傷癌癥的效果。本發(fā)明有如下顯著效果1、本發(fā)明基于殺瘤病毒療法.該發(fā)明中，呼吸道合胞病毒的NSl基因被刪除， 改良后的該病毒只殺死癌癥細胞，而對正常細胞沒有任何影響。2、呼吸道合胞病毒全序列大約有10個病毒基因序列，NSl基因序列為肺炎病毒 獨有，該基因緊接于3'端啟動子之后，相對其它病毒基因其mRNA含量最多。因為N S 1蛋白不存在呼吸道合胞病毒的顆粒中而只見于受感染細胞故被稱為非結構蛋白。研究證實，NSl能阻斷一型干擾素信號通路，表明NS 1能直接抑制宿主的免疫放應。通過 去掉NSl基因，NSl缺陷型呼吸道合胞病毒感染細胞后不再抑制干擾素(IFN)生成，從 而降低該病毒對正常細胞的感染性，因而NSl缺陷型呼吸道合胞病毒可變?yōu)榉浅０踩?但腫瘤細胞中IFN系統(tǒng)不完善，而且瘤細胞對IFN相對不太敏感，因此該病毒可在瘤細胞 中大量增殖而殺死腫瘤細胞。本發(fā)明創(chuàng)造性地刪除NSl基因，生成的N S 1基因缺陷呼吸道合胞病毒(ANSI RSV)具有選擇性殺傷癌癥細胞，而不影響正常細胞的特性。本發(fā)明特點之一為反向基 因策略(利用逆向分子生物學方法)去除NSl基因(病毒正鏈RNA上122到630堿基序 列).ANSI RSV營救則通過用攜帶有NSl-缺陷病毒cDNA，病毒N，M2_l，P和L基 因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細胞呼吸道合胞病毒NSl蛋白為一型I F N拮抗劑，而ANS1RSV 能生成更多的IFN，從而阻止病毒在正常細胞中的復制，從而選擇性地抗腫瘤。3、本發(fā)明也可以通過其他的方式，去除NSl基因，從而實現(xiàn)類似的功能.在臨 床治療上，可以通過靜脈注射基因工程的NSl基因缺陷呼吸道合胞病毒，或直接腫瘤局 部運用該病毒，達到治療的效果.4、本發(fā)明特別是對治療乳腺癌具有很好的效果，通過基因工程改良病毒，選擇 性地殺死癌癥細胞，而保護正常組織不受傷害，從而達到治療乳腺癌的目的。殺瘤病毒 在腫瘤細胞中不斷的復制，從而致使癌細胞裂解，或者誘導癌癥細胞凋亡。本發(fā)明改良 過的NSl基因缺陷呼吸道合胞病毒，具有這樣的功能。


圖1是呼吸道合胞病毒的基因序列。圖2A是免疫印跡確定病毒NSl蛋白。圖2B是病毒感染24小時后，細胞株MDA-MB_231and CCD-1059SK的顯微鏡
下形狀。圖2C是病毒感染24小時后，病毒空斑實驗檢測病毒滴度。圖2D是抗瘤體內(nèi)實驗，裸鼠兩側(cè)后褪皮下注射MDA-MB-231癌細胞，待形成 腫瘤塊后局部注射殺瘤病毒及相應對照，測量并記錄腫瘤的大小每組數(shù)據(jù)代表6個測量 及標準誤。圖2E是病毒體內(nèi)實驗統(tǒng)計，對照鼠被注射了等量的混懸病毒所用試劑或者 PBS,實驗后測量了腫瘤的大小.每組數(shù)據(jù)代表6個測量及標準誤。圖2F是不同組織來源勻漿液中，病毒滴度的測試。圖2G是RT-PCR檢測同一個體，不同組織中病毒F基因的表達，以確定病毒治 療的安全性。圖3A是MDA-MB-231和CCD-1059SK細胞株病毒感染后20小時，48小時檢
測細胞凋亡的變化。圖3B是病毒感染MDA-MB-231細胞，或添加IFN-β中和抗體后20小時或48
小時后，其細胞凋亡的變化。圖3C是Vero細胞感染病毒后其細胞凋亡的變化。圖4是細胞病變測試檢測Δ NSl RSV選擇性地殺傷不同株人乳腺癌細胞。
具體實施例方式本發(fā)明呼吸道合胞病毒(RSV)，采用逆向分子生物學方法去除NSl基因(病毒 正鏈RNA上122到630堿基序列)，被去除NSl基因的呼吸道合胞病毒稱為基因NSl缺 陷型呼吸道合胞病毒(ANSI RSV)。 ANSI RSV營救則通過用攜帶有NSl-缺陷病毒 cDNA，病毒N，M2-1，P和L基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細胞。NSl基因也可以通過其 他的方式，而達到同樣目的。為確認生成的病毒ANSI RSV是否缺乏NSl基因，本發(fā)明人用野生wt RSV和 ANSI RSV分別感染Vero細胞(一種IFN-β基因缺陷細胞)，NSl蛋白用免疫印跡檢 測，圖2Α顯示，NSl蛋白只現(xiàn)于野生RSV，而未見于ANSI RSV.該結果表明，ANSl RSV缺乏NSl基因。為驗證ANSI RSV能否選擇性地殺傷人乳腺癌細胞，MDA_MB_231乳腺癌細 胞系和正常細胞系CCD_1059SK(人正常乳房纖維細胞)按ATCC (American Type Culture
Collection)指導下培養(yǎng)，同時分別感染野生(wt)和基因工程ΔNSlRSV病毒，并對其形 態(tài)學改變，和病毒復制進行檢測。圖2Β顯示ANSI RSV選擇性的誘導MDA_MB_231 乳腺癌細胞病變，感染24小時后，癌癥細胞中ANSI RSV的滴度明顯高于正常細胞 CCD-1059SK(圖2C)，說明癌癥細胞MDA_MB_231有利于病毒的繁殖。為進一步驗 證該結果，本發(fā)明人用ANSI RSV感染了乳腺癌細胞株T-47DandMCF_7，表格1顯示 ANSI RSV選擇性的殺傷乳腺癌細胞。本發(fā)明進一步測試了該病毒能否在動物體上殺傷癌細胞。癌細胞株 (MDA-MB-231)皮下注射到4_6周大的BALB/c裸鼠左右大腿外側(cè)皮下，待其長成腫瘤 塊.ANSI RSVaXlO"1 pfu/ml)分三次局部注射入腫瘤組織，同時測量癌癥腫塊治療前后 的大小.圖2C、圖2D顯示ANSI RSV可以致使癌癥腫塊萎縮，而對照組則沒有觀察到 該現(xiàn)象。為檢驗該病毒的安全性，感染鼠同一個體不同組織器官組織均漿，進行病毒空 斑實驗，及RT-PCR檢驗，圖2E、圖2F顯示病毒局限于腫瘤部位。ANSI RSV同時可以誘導腫瘤細胞凋亡，但對正常人乳房纖維細胞 CCD-1059SK沒有作用。在實驗中，癌癥細胞株MDA-MB-231和正常細胞感染了 ANSI RSV,細胞凋亡用磷脂結合蛋白(araiexinV)結合技術檢測。圖3A結果顯示，相對于正 常細胞，ANSI RSV選擇性的誘導腫瘤細胞凋亡。以上的研究表明，RSV NSl基因誘導A549細胞產(chǎn)生IFN-β [9]。為進一步研 究IFN-β在病毒誘導凋亡中的作用，我們用特異性中和抗體中和IFN-β活性，結果發(fā)現(xiàn) ANSI RSV同樣誘導癌癥細胞凋亡(圖3B)。為進一步驗證該結果，該實驗在Vero細胞 (IFN-β基因缺陷細胞)上重復，細胞凋亡用磷脂結合蛋白(araiexinV)結合技術檢測， 結果顯示圖3C。 ANSI RSV誘導了 Vero細胞的凋亡，該結果說明IFN可能沒有參與病 毒誘導的凋亡。所述用反向基因策略(逆向分子生物學方法)刪除呼吸道合胞病毒中的 基因NS1。具體是以全長病毒正鏈cDNA為模板，設計一對帶有核酸內(nèi)切酶的PCR引 物分別對位于NSl基因的起始前端和NS2基因的起始端，用PCR方法逆向擴增出一段已 不含有NSl基因的(即從核酸序列上去除了鹼基122到630的一小段NSl基因)DNA片 段，然后克隆到質(zhì)粒中。該質(zhì)粒可用于后續(xù)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染制備NSl缺陷型RSV病毒。
權利要求
1.一種基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞 病毒是用Vero細胞合成、Vero細胞經(jīng)用攜帶有NSl-缺陷病毒cDNA、病毒N，M2-1， P和L基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染而形成。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是用反向基 因策略刪除呼吸道合胞病毒中的基因NSl。
3.—種基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒應用，其特征是應用于治療乳腺癌，殺傷乳 腺癌細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒及其應用，其是由基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒是用Vero細胞合成、Vero細胞經(jīng)用攜帶有NS1-缺陷病毒cDNA、病毒N，M2-1，P和L基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染而形成。所述基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒，是用反向基因策略刪除呼吸道合胞病毒中的基因NS1。本發(fā)明應用于治療乳腺癌，選擇性地殺傷乳腺癌細胞。
文檔編號A61P15/14GK102021148SQ20101024975
公開日2011年4月20日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權日2010年7月27日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 蔣禮先, 高利衛(wèi) 申請人:張衛(wèi)東, 蔣禮先, 高利衛(wèi)