專利名稱：用于免疫受損人群的糖結合物疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及使用葡萄球菌和腸球菌糖結合物疫苗來預防或者治療免疫受損個體的細菌感染。
B.背景技術在健康個體中，葡萄球菌和腸球菌很少導致全身感染，因此被視為機會性致病原。通過各種機制，具有完善免疫系統(tǒng)的正常成人和動物對這些細菌感染可以獲得天然的抵抗力。除了可能的免疫學機制外，還包括粘膜和皮膚屏障。由于損傷，比如燒傷、外傷或留置醫(yī)療器械的手術等，會對這些天然屏障造成破壞，從而增加葡萄球菌和腸球菌感染的風險。此外，免疫反應受損的個體，比如接受化療和放療的癌癥患者、糖尿病人、AIDS患者、酗酒者、濫用藥物者、器官移植術后的患者以及嬰兒發(fā)生葡萄球菌和腸球菌感染的風險也會增加。
葡萄球菌是人體前鼻孔、皮膚和胃腸道的共生菌。據估計，葡萄球菌感染占全部醫(yī)院獲得性感染的50％以上。僅金黃色葡萄球菌就占了醫(yī)院獲得性感染的15-25％，僅次于表皮葡萄球菌，其占此類感染的35％。葡萄球菌感染，尤其是金黃色葡萄球菌造成的感染具有高發(fā)病率和高死亡率。
葡萄球菌和腸球菌是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染，包括菌血癥、轉移性膿腫、膿毒性關節(jié)炎、心包炎、骨髓炎和傷口感染等的主要病因。例如，與菌血癥相關的金黃色葡萄球菌總死亡率為25％。在1995年對于住院患者進行的一項研究發(fā)現，與金黃色葡萄球菌相關的住院死亡率、住院時間以及醫(yī)療費用是其他住院的二倍。在血液透析患者中，金黃色葡萄球菌菌血癥是主要的致死、致病原因，其每年發(fā)生率為3～4％。對于甲氧苯青霉素的單獨耐藥百分率越來越高，以及早期報告的對萬古霉素耐藥會加重金黃色葡萄球菌感染的嚴重程度。因此，非常有必要對金黃色葡萄球菌進行免疫預防。
金黃色葡萄球菌的莢膜多糖(CPS)是這種機會性致病原造成全身感染的毒性因子。與其他的莢膜性細菌，例如肺炎鏈球菌類似，金黃色葡萄球菌的莢膜多糖通過抑制多形核嗜中性細胞(PMN)的噬菌細胞調理素殺滅作用來協(xié)助侵入。這使得細菌在血液中持續(xù)存在，它們在那里產生多種不同的病毒因子，包括毒素和細胞外酶。在已知的11種金黃色葡萄球菌中，5型和8型占全部臨床分離菌的85％。剩余的分離菌中大多數攜帶一種最近鑒別出的抗原，稱作336型。在體外，5型、8型和336型莢膜多糖的抗體會誘導人多形核嗜中性細胞的種類特異性噬菌細胞調理素殺滅作用，并在動物感染模型中起到保護作用。
在人體內，葡萄球菌已經發(fā)展出非常復雜的致病機制，包括細胞內和細胞外因子。例如，金黃色葡萄球菌具有其他表面抗原，通過幫助細菌逃避宿主白細胞的噬菌細胞殺滅作用以利于其在血流中的存活。這些表面抗原包括細胞壁成分，例如磷壁酸質、蛋白質A和莢膜多糖(CPS)。正是部分由于這些細菌的易變性及其產生細胞外產物以提高其感染性和致病性的能力，使得葡萄球菌菌血癥及其并發(fā)癥，例如心內膜炎、膿毒性關節(jié)炎、以及骨髓炎仍然嚴重，并在醫(yī)院感染中頻頻見到。
抗生素，例如盤尼西林已經在人體中成功的用于對抗葡萄球菌和腸球菌，但是最近這些抗生素的效果都被細菌產生耐藥性的能力所減弱了。例如，在引入甲氧苯青霉素，一種更新的合成性抗生素后不久，就分離出了耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌株。從醫(yī)院感染中分離出的葡萄球菌的抗生素耐藥性頻率持續(xù)增加，并且盡管已經發(fā)展出預防程序并對細菌流行病學和抗生素開發(fā)進行了深入研究，耐藥性金黃色葡萄球菌株仍然繼續(xù)導致院內傳染。目前腸球菌對于萬古霉素出現了耐藥，并且在某些中心中已經鑒定出對萬古霉素中間耐藥的耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌生物體。耐藥性的交叉轉移最終會導致產生廣泛傳播且更加難以清除的生物體。
抗生素治療和治愈葡萄球菌感染的初始效果使得治療這些感染的免疫學方法被忽略了。盡管已經出現了多重抗生素耐藥的金黃色葡萄球菌菌株，卻未能發(fā)展其他策略，例如疫苗。另外，已經對將被動免疫用于免疫受損個體，例如有較高細菌感染風險的新生兒進行了測試。在建議對這類人群使用被動免疫方面，資料未能支持一個有根據的結論，Baker等人，New Engl.J.Med.35213-219(1992)；Fanaroff等人，New Engl.J.Med.3301107-1113(1994)。使用主動接種疫苗作為保護免疫受損人群的一種有效方法目前尚未實現使用任何已批準的疫苗。在免疫受損患者中常常發(fā)現在健康被免疫者體內具有免疫原性的疫苗產生免疫性的能力減弱或者不具有免疫原性，因此所提供的保護程度不足。例如，血液透析患者對于乙型肝炎疫苗的免疫反應顯示被降低至健康被免疫者中所觀察到結果的50-80％。類似的，老年患者對于這種疫苗的免疫反應降至46％。Pirofski和Casadevall，Clin.Microbiol.Rev.111-26(1998)。
細菌莢膜多糖的免疫原性通常很差。已知它們在人體內的免疫原性與它們的分子大小和被免疫者的年齡相關。小于2歲的嬰兒、老人以及其他免疫受損患者是典型的莢膜多糖疫苗低反應者。盡管對于在正常個體中導致急性疾病的某些主要細菌致病原，即肺炎鏈球菌、奈瑟氏腦膜炎球菌和嗜血性流感菌已經發(fā)展出多糖疫苗，但沒有一種被描述能夠特異的用于治療機會性細菌。此外，當在免疫受損個體中對這些疫苗進行測試時，觀察到免疫反應迅速衰減，導致缺乏有效的保護。對于肺炎鏈球菌，所測試的疫苗包括多種菌株，其在免疫健全成人中有效，但在免疫反應差的免疫受損個體，例如老年人和艾滋病患者中無效。對于金黃色葡萄球菌5型結合物疫苗而言，血液透析患者所產生的最大抗體水平低于健康被免疫者。并且，抗體水平在透析患者體內的衰減比在健康被免疫者體內快得多。6個月后，透析患者體內的抗體水平降低了39％，而健康個體中只降低了14％。Welch等人，J.Am.Soc.Neph.7247-253(1996)。
活疫苗的免疫原性通常更高，但是在對免疫受損患者進行免疫時提出了一個問題。盡管用于此類疫苗的病毒和細菌菌株經過了減毒，某些菌株仍能回復并導致疾病。對于免疫受損患者，例如化療患者、血液透析患者、嬰兒、休克性外傷患者、手術病人以及其他抵抗力差或免疫系統(tǒng)部分受損患者尤其首選采用細菌成分進行免疫。
正常情況下，多糖抗原產生T細胞依賴性免疫反應，并且它們會導致體液抗體，再次注射時觀察不到免疫反應的增強。為了產生完全的免疫反應，將多糖與蛋白載體結合可以改變細菌莢膜多糖抗原，使其成為T細胞依賴性免疫原，從而提高它們的免疫原性并促進它們在嬰兒和免疫受損患者中的使用。
免疫受損個體發(fā)生細菌感染的風險常常較高，例如插管等操作。由于免疫反應差，暴露于感染性細菌株往往會導致嚴重的感染。許多細菌株已經對多種或者目前所有的抗生素都產生耐藥的事實增加了免疫受損個體發(fā)生細菌感染時產生不良后果的可能性。因此，非常需要對免疫受損患者進行疫苗接種，以抵抗常見的臨床致病細菌株。但是，已知細菌抗原，例如葡萄球菌和腸球菌多糖抗原的免疫原性很差?？梢酝ㄟ^結合至蛋白載體來提高它們的免疫原性，但是目前所能獲得的結合疫苗均未能顯示在免疫受損患者體內有效，并且這些疫苗在免疫受損群體中不能產生有效免疫反應的觀點已經廣為接受。

發(fā)明內容
本發(fā)明者發(fā)現將某些葡萄球菌和腸球菌多糖與糖肽細菌表面抗原相結合，這里用“糖結合物”表示，可以有效的保護免疫受損個體抵抗細菌感染。例如，與重組體外蛋白A(rEPA)，一種與大腸桿菌中表達的銅綠假單胞菌外毒素A的無毒變體相結合的含有金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖的二價疫苗在健康成人和終末期腎病(ESRD)患者中具有免疫原性，且能夠良好的耐受，并且更重要的，它能夠在ESRD血液透析患者中預防菌血癥。在傳統(tǒng)理論看來，這種效果是完全出乎意料的，傳統(tǒng)理論認為免疫受損個體無法對免疫原性差的抗原，例如多糖抗原產生有效的免疫反應，多糖的免疫原性通常較低。
免疫學上說來，在高風險成人群體中，進行血液透析的ESRD患者情況最嚴重。他們通常是老年患者，許多人患有糖尿病(-50％)，并且無一例外遭受尿毒癥的折磨。尿毒癥和高糖血癥對于宿主的防御機制，尤其是調理素噬菌作用具有較大的削弱作用。這些情況會通過削弱補體或噬菌細胞功能導致主要的免疫功能受損。ESRD患者典型的具有嗜中性細胞功能低下和噬菌作用受損，繼發(fā)于補體激活的白細胞減少癥，自然殺傷細胞活性降低，T和B淋巴細胞功能減低，以及T淋巴細胞對標準抗原的反應低減。根據本發(fā)明的疫苗保護這種高度免疫受損目標人群的能力無法事先預計。
本發(fā)明包括保護免疫受損人員至少免受葡萄球菌和腸球菌之一造成的感染。疫苗包括一個多糖或糖肽細菌表面抗原的糖結合物和一個免疫載體。本發(fā)明的方法需要將疫苗用于免疫受損個體，其劑量在免疫受損個體中產生的血清型特異性抗體水平可以與正常健康對象體內對疫苗反應所獲得的抗體水平相比。該疫苗包括(a)金黃色葡萄球菌5型和8型抗原的糖結合物。
(b)一種帶負電的葡萄球菌多糖抗原的糖結合物，其含有β連接的氨基己糖作為主要的碳水化合物成分并且不含有O-乙?；鶊F。
(c)一種葡萄球菌糖肽抗原的糖結合物，其含有氨基酸和一個不含O-乙?；鶊F且不含己糖的α構像N-乙?；被禾?。
(d)一種酸性葡萄球菌多糖抗原的糖結合物，其取自將抗血清凝集至ATCC55254的表皮葡萄球菌的分離物。
(e)一種糞腸球菌抗原的糖結合物，其含有摩爾比為1∶2的2-乙酰胺-2-脫氧葡萄糖和鼠李糖。
(f)一種糞腸球菌抗原的糖結合物，其含有一個包括6-脫氧糖的三糖重復。
(g)一種腸球菌抗原的糖結合物，其含有摩爾比為1∶2的2-乙酰胺-2-脫氧半乳糖和半乳糖。
(h)一種腸球菌抗原的糖結合物，其與ATCC202016的抗體發(fā)生反應，或者(i)一種腸球菌抗原的糖結合物，其與ATCC202017的抗體發(fā)生反應。
疫苗在免疫受損個體中對疫苗中含有的抗原產生一定水平的血清型特異性抗體，在預計的實驗偏差限度內，該水平與用含有糖結合物的疫苗免疫正常健康患者所獲得的水平相同。
具體實施例方式
已經發(fā)現，通過使用含有一個免疫載體、一個來自臨床致病性葡萄球菌或腸球菌株的多糖或糖肽表面抗原結合物的疫苗免疫受損的個體，能夠對其產生有效的保護。在當前的上下文關系中，“臨床有意義”的細菌株指的是在人類中具有免疫原性。該疫苗可以用于主動保護將要接受具有即刻發(fā)生細菌感染風險條件的免疫受損個體。這些條件將包括，例如，插管或手術過程。值得注意的是，本發(fā)明者發(fā)現對免疫受損個體在采用根據本發(fā)明的疫苗進行接種時能夠引發(fā)有效的免疫反應。
免疫受損個體可能在免疫系統(tǒng)的細胞免疫和體液免疫中的一支或兩者都發(fā)生缺陷。這些分支都對抗感染。尤其是細菌感染，主要通過兩種機制被清除殺菌活性，需要抗體和補體兩者的作用，以及調理素噬菌作用，其在補體和抗體之外還需要噬菌細胞。這些過程中的每一步都可能發(fā)生缺陷，在不同程度上影響整個過程的功能性，任意一種此類缺陷都會造成“免疫受損”的宿主。
ESRD患者為預測一種疫苗保護免疫受損個體的能力提供了良好的模型，因為在這種患者體內，免疫反應的許多方面都受到了損害。例如，許多這種病人患有糖尿病或高血糖癥，會干擾補體的固定。補體無法固定會限制這些患者體內抗體的作用。另外，作為糖尿病的后果之一，噬菌細胞的趨化性運動會減弱，而造成它們無法到達感染的部位。血液透析患者也遭受尿毒癥的折磨，這會影響粒細胞的功能和補體固定，導致調理素噬菌作用效率低下。糖尿病和尿毒癥還會影響B(tài)細胞的功能，造成對免疫接種的反應低于最佳免疫反應。
在本文中，多糖或糖肽表面抗原主要含有碳水化合物殘基。只含有碳水化合物殘基的抗原稱作多糖抗原。某些細菌的表面抗原另外含有一小部分氨基酸殘基，通常少于抗原重量的40％，在這種情況下它們被稱作糖肽抗原。根據本發(fā)明的細菌表面抗原可以是包膜多糖，或者也可以含有磷壁酸。
按照本發(fā)明，許多葡萄球菌和腸球菌表面抗原都被鑒定為適合用于制備結合物疫苗。尤其是這些還包括在多種金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌、腸球菌和糞腸球菌菌株上發(fā)現的多糖和糖肽抗原。
按照本發(fā)明，用于制備結合物疫苗的抗原包括金黃色葡萄球菌的5型和8型抗原。調查顯示大約85-90％的分離物是5型或8型莢膜多糖。用含有5型和8型莢膜多糖抗原的疫苗免疫接種過的正常個體可以免受85-90％金黃色葡萄球菌株的感染。Moreau等人，Carbohydr.Res.201285(1990)；和Fournier等人，Infect.Imm.4587(1984)已經闡明了5型和8型多糖抗原的結構。在它們的重復單位中都具有FucNAcp以及ManNAcA，可以用于導入巰基。該結構如下5型-＞4)-β-D-ManNAcAp(1-＞4)-α-L-FucNAcp(1-＞3)-β-D-FucNAcp(1-3)Oac8型-＞3)-β-D-ManNAcAp(1-＞3)-α-L-FucNAcp(1-＞3)-β-D-FucNAcp(1-4)Oac根據本發(fā)明的一種優(yōu)選疫苗包括5型和8型抗原兩者的結合物。尤其令人驚奇的是這種二價疫苗能夠為免疫受損個體提供優(yōu)良水平的保護。Welch等人(1996)，supra，揭示了一種單價5型疫苗，其在ESRD患者中產生的免疫反應有限?；赪elch等人所報告的糟糕結果，尤其是再加上本領域中的一條教訓，即在疫苗中加入第二個抗原成分實際上會減弱每一種成分個體的效果時，無法對使用根據本發(fā)明的二價5型/8型金黃色葡萄球菌疫苗所能獲得的保護進行預測。Fattom等人，17126-133(1999)。
在U.S.patents No.5,770,208和No.6,194,161中描述了制備根據本發(fā)明的結合物過程中所用到的另一種葡萄球菌抗原。這種帶負電的抗原含有β-連接的氨基己糖作為主要的碳水化合物成分，并且不含有能夠用核磁共振分光鏡檢測到的O-乙?；鶊F?？乖軌蚺c在ATCC55804下沉積的金黃色葡萄球菌336型抗體特異結合。攜帶這種抗原的金黃色葡萄球菌株幾乎占據了全部非5、非8型臨床致病性金黃色葡萄球菌株。因此，將這種抗原與金黃色葡萄球菌5型多糖抗原和金黃色葡萄球菌8型多糖抗原聯(lián)合使用具有獨特的優(yōu)勢，可以覆蓋近乎100％的金黃色葡萄球菌感染。
還有許多臨床致病性表皮葡萄球菌。為了保護或者治療這些菌株所造成的感染，首選采用U.S.Patent Nos.5,961,975和5,886,140所公布的名為1型抗原所制備的結合物疫苗。該抗原是一種酸性多糖抗原，獲得該抗原的程序包括將粘附抗血清至ATCC55254的表皮葡萄球菌分離物(I型分離物)進行細胞培養(yǎng)；從細胞中提取多糖抗原，產生多糖抗原的粗提取物；將該粗提取物純化，形成蛋白含量小于1％的純化抗原；將純化抗原加到分離柱上并用氯化鈉梯度洗提；以及用I型分離物的特異抗體鑒定含有多糖抗原的片斷。
在WO 00/56357中還描述了根據本發(fā)明用于制備結合物疫苗的另一種葡萄球菌抗原。這種抗原含有氨基酸以及一個α構像的N-乙?；被禾?，不含有能夠被核磁共振分光鏡檢測到的O-乙?；鶊F。它能夠與在ATCC202176下沉淀的葡萄球菌株抗體特異結合。抗原的氨基酸分析顯示存在絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、纈氨酸以及蘇氨酸，摩爾比例為39∶25∶16∶10∶7。氨基酸占抗原分子重量的32％。
除了使用這些葡萄球菌抗原制備的結合物疫苗外，根據本發(fā)明首選采用WO 99/18996中描述的腸球菌抗原制備的結合物疫苗。該申請公布了5種不同的抗原，其中兩種分離自糞腸球菌株，3種分離自腸球菌株。按照布達佩斯條約，已經用美國式培養(yǎng)收集沉積了2種糞腸球菌株和3種腸球菌株中每一種的代表，并且分別賦予Accession Nos.202013(糞腸球菌EFS1)，202014(糞腸球菌EFS2)，202015(腸球菌EFM3)，202016(腸球菌EFM4)，以及202017(腸球菌EFM5)。用于本發(fā)明的抗原可以從沉積的菌株中分離，或者根據本發(fā)明，沉積菌株能夠用于鑒定其他表達本發(fā)明抗原的菌株，從它們中可以提取并純化抗原。糞腸球菌抗原之一，EFS1，含有2-乙酰胺-2-脫氧葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖和2-乙酰胺-2-脫氧半乳糖，其摩爾比計算值大約為1∶2∶2∶2；另一種糞腸球菌抗原，EFS2，含有一個三糖重復，其中含有一個6-脫氧糖；還有一種腸球菌抗原，EFM3，含有2-乙酰胺-2-脫氧半乳糖和半乳糖。
按照引用文獻中所描述的方案進行分離培養(yǎng)，已經從某些葡萄球菌和腸球菌中獲得了充分純化形式的、可重獲數量的前述每一種抗原。特別的，純化的抗原含核酸低于1％。這里所說的“可重獲”數量指的是抗原的分離數量可以為敏感性低于放射標記的方法，例如免疫測定所檢測到，并且可以用于進一步的操作，包括將抗原本身轉移入溶液。
為了在根據本發(fā)明的免疫受損人群中用作疫苗，抗原被結合至一個免疫載體。免疫載體是一種物質，通常是一種多糖或蛋白質，它可以提高T細胞和B細胞之間的相互作用，用于誘導針對抗原免疫反應，并因此能夠提高主動免疫和在志愿者中制備用于隨后被動免疫的高滴度抗血清的免疫原性。根據本發(fā)明，合適的免疫載體包括破傷風類毒素和白喉類毒素，以及重組技術生產的上述類毒素的遺傳去毒變體，葡萄球菌外毒素或類毒素，銅綠假單胞菌外毒素A或其衍生物，特別包括重組技術生產的無毒變異銅綠假單胞菌株外毒素A，例如Fattom等人，Inf.and Imm.611023-1032(1993)所描述的，以及常用作免疫載體的其他蛋白質。
為了將抗原結合至載體蛋白，首先將抗原進行衍生。有多種方法可以用于衍生抗原并將其共價連接至免疫載體。活化的抗原羧基可以用ADH、胱胺或PDPH進行衍生，然后可以通過碳化二亞胺介導的反應將部分酰胺化的抗原連接至載體蛋白的羧基，或通過硫醇化抗原與SPDP-衍生的載體蛋白之間的二硫化物互換將抗原連接至載體蛋白。
根據Kohn等人，FEBS Lett.154209210(1993)的方法，使用溴化氰或1-氰基-4-二甲胺-吡啶四氟硼酸鹽可以活化抗原上的羥基，然后按照本領域中公知的技術，用六碳雙工能隔離物脂肪酸二酰肼(ADH)對抗原進行衍生。然后通過1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)二亞胺碳(EDAC)將該物質連接至白喉類毒素(Dtd)，來自銅綠假單胞菌的重組外蛋白A(rEPA)，破傷風(TTd)或另一種合適的載體蛋白。產生的結合物可以通過大小排除色譜從未反應的抗原中分離出來。無論用何種方法將抗原結合至載體蛋白，抗原與載體蛋白的共價連接都會顯著提高抗原的免疫原性，并導致在小鼠體內進行首次和二次激發(fā)后抗體相對于抗原的水平增加。
根據本發(fā)明的抗原-免疫載體結合物是化合物的活性成分，其進一步包括一個藥學可接受的活性成分載體，并可以用作疫苗誘導細胞免疫反應和/或在體內產生抗體，該抗體能夠在免疫受損患者體內對抗細菌感染，尤其是葡萄球菌和/或腸球菌感染。在這一點上，藥學可接受載體是一種可以用作給藥媒介的材料，因為該材料是惰性的或者醫(yī)療上可接受的，并且在疫苗給藥的范圍內能夠與活性成分兼容。除了合適的賦形劑外，藥學可接受載體還可以含有傳統(tǒng)的疫苗添加劑，比如稀釋劑、輔劑和其他免疫刺激劑、抗氧化劑、防腐劑和增溶劑。
根據本發(fā)明的疫苗可以與或不與輔劑一起使用。如果使用了輔劑，則對輔劑進行選擇以避免輔劑誘導的毒性。另外根據本發(fā)明的疫苗還可含有一個β-葡聚糖或粒細胞集落刺激因子，尤其是如1999年9月14日遞交的U.S.application serial No.09/395,360中所描述的β-葡聚糖。
根據本發(fā)明的抗原/免疫載體結合物成分可以“基本上由結合物組成”。在這一點上，短語“基本上由…組成”指的是當把化合物作為疫苗用于患者時，該成分不含有任何干擾對抗原(以及其他抗原，如果存在的話)引起免疫反應的材料。
有大量免疫受損的人群將從使用根據本發(fā)明的疫苗中獲益。這些包括終末期腎病(ESRD)患者；進行免疫抑制治療的腫瘤患者，艾滋病患者，糖尿病人，在擴展護理機構中的老年人，進行免疫抑制治療的自身免疫病患者，移植病人，以及燒傷病人。免疫系統(tǒng)分為兩支，即細胞和體液免疫。這兩支都對抗感染性疾病。尤其是細菌感染，主要通過兩種機制被清除包括抗體和補體兩者的殺菌作用，以及除補體和抗體外還需要噬菌細胞的調理素噬菌作用。這些過程中的每一步都可能發(fā)生缺陷，在不同程度上影響整個過程的功能性。任意一種此類缺陷都會造成“免疫受損”的宿主。這種無功能或受損的機制可以作為糖尿病的后果實例而發(fā)生。糖尿病或高血糖癥會干擾補體的固定。所以即使一個人擁有充足的抗體，補體無法固定也會限制抗體的作用。另外，作為糖尿病的后果之一，噬菌細胞的趨化性運動會減弱，而造成它們無法到達感染的部位。血液透析患者遭受尿毒癥的折磨，這會影響粒細胞的功能和補體固定，導致調理素噬菌作用效率低下。此外，糖尿病和尿毒癥還會影響B(tài)細胞的功能，造成對免疫接種的反應低于最佳免疫反應。
參考下列說明實例對本發(fā)明做了進一步的描述。
實例1在ESRD患者中進行的金黃色葡萄球菌5型/8型多糖疫苗劑量研究20名靠慢性不臥床腹膜透析或血液透析維持的男性終末期腎病(ESRD)患者，每位患者都接受單次肌肉內注射合成疫苗，該疫苗含有目標劑量分別為25微克、形式為重組假單胞菌外蛋白(rEPA)結合物的5型和8型金黃色葡萄球菌CPS。這種25微克的劑量與健康對象中所用的相同。由于預計在這種慢性病人群中免疫反應較弱，在首次給藥六(6)周后第二次給入劑量為0.5mL的二價疫苗。另外還有五(5)名健康成年男性接受等體積的生理鹽水安慰劑。在注射前和注射2和6周后評定抗5型和8型CPS IgG的水平。
如表1中所示，在ESRD患者中觀察到了真實的免疫反應，盡管在ESRD患者中的這種免疫反應比在正常成人患者中少。六(6)周后第二次給藥實際上對每種血清型的特異抗體水平都沒有影響。
表1.在成年男性ESRD患者中，標準劑量為25微克每種CPS的金黃色葡萄球菌T5/T8CPS疫苗的免疫原性

在表1結果的基礎上，接著進行了在血液透析維持的ESRD患者中的劑量研究。采用體積為1.0mL，含有75微克5型CPS和55微克8型CPS(分別與等重量的rEPA結合)的配方。33名，包括兩種性別并靠血液透析維持的成年ESRD患者被單次肌肉內給藥金黃色葡萄球菌5型/8型CPS結合物疫苗/IA。最初16名患者的小組接受的給藥劑量為1.0mL(75微克5型和55微克8型)。觀察該組的安全一周后，另外17名患者接受的給藥劑量為1.5mL(118微克5型和83微克8型)。兩個劑量都具有良好的耐受性。在注射后第2和第6周以及3，6，9和12個月監(jiān)測血清型特異性IgG的水平。
與表1相比較，兩種劑量水平都在注射后6周提高了血清型特異性抗體的峰水平，并且重要的是，它們恢復抗8型反應器的分數顯著增大(表2)。兩種CPS類型的血清型特異性抗體達到了正常健康患者接受1.5mL給藥所能獲得的水平，并且在一年后保持幾何平均數比基線值高6.03倍(8型)至10.28倍(5型)(對于兩種血清型P＜0.0001)。
表2.在血液透析維持的ESRD成人中，加大劑量的金黃色葡萄球菌T5/T8CPS疫苗的免疫原性

實例2用金黃色葡萄球菌5型/8型多糖疫苗保護ESRD患者在加利福尼亞的73家透析中心中招募患者。包括標準為年齡大于或等于18歲，在登記前使用天然脈管瘺或合成性/異種移植物通路進行血液透析至少8周的ESRD患者，加入時Karnofsky評分至少為50，并且預期能夠完成所需的隨訪復診。排除標準為在免疫接種前2周內有符合感染的癥狀和體征，有HIV感染史，過敏或先前由多糖或多糖結合物疫苗造成過敏反應，過去一年中有藥物濫用，使用免疫抑制或免疫調解藥物，以及在疫苗接種前6個月內患有惡性腫瘤或治療惡性腫瘤。
符合條件的患者被隨機指定為接受疫苗注射或安慰劑。通過(1)血管通路(天然通路瘺或合成性/異種移植物)和(2)是否存在鼻帶金黃色葡萄球菌進行分類隨機化。
疫苗(Staph VAX，由Nabi，Rockville，MD提供)由在0.01％聚山梨醇酯80和磷酸鈉-緩沖鹽水，pH7.4中結合至等重量重組銅綠假單胞菌無毒外毒素A(rEPA)的金黃色葡萄球菌5型和8型CPS(100微克/型/毫升)組成?；谠贓SRD患者中進行的研究選擇了該劑量(Nabi，未發(fā)表的資料)。疫苗和安慰劑(磷酸鈉-緩沖鹽水)以1mL清澈液體的形式提供在同樣的小瓶中，各自帶有獨特的編碼。
在相隔大約1周的兩次篩查就診中，評價患者是否符合條件，并對前鼻孔進行金黃色葡萄球菌培養(yǎng)。兩次培養(yǎng)陽性即定義為攜帶者。通過三角肌或股前肌肉內注射給藥疫苗或安慰劑。
在注射后30分鐘評價患者并建議在第一周每天記錄局部(紅斑，水腫，疼痛，燒灼，觸痛，發(fā)熱)和全身反應(發(fā)熱，全身不適，肌肉痛，頭痛，惡心，嘔吐)。在注射后一周，患者返回透析中心并記錄疫苗反應。評價患者的不良事件直至注射后6周。記錄死亡和所有菌血癥直至研究結束或患者退出。主要的結果度量為患者首次發(fā)作金黃色葡萄球菌血癥。在進行抗生素治療前先取得血培養(yǎng)。
在疫苗接種之前和接種后6，26，54和67周獲取血清。如Fattom等人，Infect Immun199058；67-74和Fattom等人，Infect Immun1993611023-32所述，通過ELISA測定金黃色葡萄球菌5型和8型CPS抗體。疫苗反應定義為抗體濃度至少為25微克/毫升，并且比疫苗接種前至少高2倍。
在美國和歐洲進行的調查提示金黃色葡萄球菌血癥的發(fā)病率為0.03-0.04/血液透析患者-年。參見，例如Kessler等人，Nephron19926495-100；Quarles等人，Am J Kidney Dis 19856412-9；Roubicek等人，Nephrologie 199516229-32；以及Bloembergen和Port，Adv RenReplace Ther19963201-7。在調整的I型誤差為0.042的條件下(Fleming-O’Brien法，Biometrics 197935549-56)，確定了一個每組900名患者的樣本規(guī)模，以便足夠有80％的把握檢測到疫苗接種后3-54周觀察窗期間疫苗組金黃色葡萄球菌血癥的發(fā)病率下降了60％。但是，由于與保護相關的抗體在本項研究前不可預知，并且由于ESRD患者體內的抗體水平迅速衰減，對其他時間窗進行了評價。
效率評價基于疫苗接種兩周后的數據進行。使用StatXact軟件，通過具體的、分類的個人-時間發(fā)病率計算來比較疫苗和對照組之間的金黃色葡萄球菌血癥率。參見StatXact-4軟件說明書，劍橋，馬薩諸塞；Cytel，Inc；1998，以及Breslow和Day，癌癥研究中的統(tǒng)計學方法，Vol.II；隊列研究的設計和分析，紐約；牛津大學出版社；1987。通過由基線鼻攜帶和血管通路形式定義的兩類創(chuàng)造了4個單元。通過Kaplan-Meier方法描述并通過分類log-rank檢驗來比較至首次發(fā)作金黃色葡萄球菌血癥的時間。采用重復方法邏輯衰減模型(SAS PROCGENMOD)描述感染機會的時間依賴性，由此估計效率的時間趨勢。Zeger和Liang，離散和連續(xù)結果的縱向數據分析，Biometrics198642121-30。模型包括隨社會階層、年齡和性別所作的調整。
使用基于雙樣本排列檢驗的另一項分析來確定隨訪3-54周期間任何鄰近時期的最高疫苗效率。Edington ES.隨機化檢驗.紐約；MarcelDekker；1980。從全部1798名患者中產生了總共10,000個模擬數據組來檢查疫苗接種后54周內至少6個月的所有可能注射后時期。計算鄰近間隔中個人-時間效率檢驗的P值，作為模擬效率大于研究所取得數值的比例。
通過Fisher’s exact檢驗來比較疫苗組和安慰劑組中經歷了疫苗反應和死亡的患者數量。沒有對安全性測定的多樣性進行調整。
在73個血液透析中心招募的1991名篩查患者中總共有1804名被隨機化并接受疫苗(n＝894)或安慰劑(n＝910)。在187名未進行免疫的篩查患者中，其原因為未能符合條件或不符合方案(n＝81)，收回同意(n＝71)，健康狀況改變(n＝22)，以及其他原因(n＝13)。疫苗接種者和對照提供的研究中間時間分別為75周和74周，每一組中76％的患者進行至少54周的研究。通過效率分析排除了6名患者3名對照在2周內死亡，并且在注射前2周內有兩名疫苗接種者和一名對照患上感染。沒有患者被排除在安全性評價外。兩個小組的預處理人口統(tǒng)計學和臨床特征都相似，并且能夠代表加利福尼亞的多樣性?；颊咧?3％是高加索人，31％是西班牙人，23％是黑人，以及13％的亞洲人。在894名接種疫苗者和910例對照中，女性患者分別占46％和44％，并且糖尿病比例分別為52％和51％。在接種疫苗時，兩組中69％的患者有移植物通路，兩組中都有22％的鼻攜帶者。兩組的平均年齡為58.3歲。
死亡人數在疫苗組和對照組之間并沒有統(tǒng)計學顯著的差異，并且沒有一例死亡被認為與疫苗有關。而接種疫苗者的局部反應、不適和肌痛比對照組有統(tǒng)計學顯著的增加(表1)。
表3.疫苗反應一覽表*疫苗組 安慰劑組 P值反應(N＝893) (N＝907)局部反應硬化121(13.5)40(4.4) ＜0.001紅斑93(10.4) 44(4.9) ＜0.001注射部位疼痛290(32.5)128(14.1)＜0.001局部發(fā)熱85(9.5) 33(3.6) ＜0.001任何局部反應338(37.8)179(19.7)＜0.001全身反應頭痛243(27.2)227(25.0)0.31肌痛253(28.3)199(21.9)0.002不適226(25.3)188(20.7)0.02惡心168(18.8)141(15.5)0.07嘔吐64(7.2) 73(8.0) 0.53發(fā)熱41(4.6) 42(4.6) 1.00任何全身反應431(48.3)393(43.3)0.04*疫苗組中有一名患者，安慰劑組中有3名患者未記錄資料。圓括號中的數值是該組的百分比。注射部位疼痛包括疼痛、燒灼感和觸痛。P值來自將疫苗組和安慰劑組進行比較的Fisher’s exact檢驗。
局部反應通常為輕至中度，并且在2天內消退。疫苗組的152例死亡中有9例(5.9％)，對照組的146例死亡中有11例(7.5％)被確定為由葡萄球菌血癥造成或與葡萄球菌血癥暫時相關(Fisher’s exact檢驗P＝0.65)。
在接種疫苗后1-2周內、開始隨訪疫苗效果前，疫苗組內有1例菌血癥患者，安慰劑組無菌血癥患者。在3至40周的時期內，接種疫苗者中發(fā)生11例，618.9人-年，對照組中發(fā)生26例，627.0人-年。疫苗使菌血癥減少了57％(95％置信區(qū)間為10.2至80.9，P＝0.02)。40周后，效果有所降低，在54周時降至26％(95％置信區(qū)間為24.1至56.9，P＝0.23；表2)。
表4.注射后數周發(fā)生金黃色葡萄球菌血癥的累積數量和疫苗的效果*疫苗組 安慰劑組 效果百分比注射后的(95％置信 P值周數 感染人數人-年 感染人數 人-年區(qū)間)18％104 135.2 5138.0 1.0(-279.，83.8)53％206 300.6 13 306.6 0.17(-32.8，85.3)63％308 461.9 22 469.7 0.02(13.8，85.8)57％4011 618.9 26 627.0 0.02(10.2，80.9)26％5025 766.5 34 775.3 0.30(-28.4，57.5)26％5427 818.4 37 827.4 0.23(-24.5，56.8)25％9137 1165.0 49 1161.6 0.24(-17.8，52.2)*數據記錄了有效人群的1798名患者中首次發(fā)生的菌血癥。排除了來自注射后1和2周的結果。疫苗效果的計算公式為100×(1-[疫苗組中發(fā)生葡萄球菌血癥的個人-時間率/安慰劑組中發(fā)生葡萄球菌血癥的個人-時間率])。P值是在疫苗組和安慰劑組之間進行比較的發(fā)生率比＝1的exact檢驗。
從注射后第54天開始，在187天的時期內間斷觀察到75％的有效率(疫苗組中5例感染，437.4人-年，相較于對照組中20例感染，444.2人-年，P＝0.01)。
在第3周至第91周間進行的個人-時間效果一致性檢驗顯示效果在通過兩類劃分的四單元之間沒有顯著差異(一致性exact檢驗P＝0.15)。但是，評價這種相互作用的效力有限。在兩個小組中，研究起始時通過移植物而不是瘺作為血管通路的患者發(fā)生菌血癥的風險有增加趨勢(表3)。鼻攜帶金黃色葡萄球菌也傾向于和對照組中菌血癥的風險增加相關(個人-時間率7.6相對于3.1/100人-年，P＝0.06，個人-時間率的exact比較)，但在接種疫苗者中無此現象。
表5.在3-54周發(fā)生金黃色葡萄球菌血癥患者的數量和百分比，按照血管通路類型、鼻攜帶狀態(tài)和治療組劃分*

*圓括號中的數值是分類的百分比。
金黃色葡萄球菌的類型分布在疫苗組和對照組之間是相似的。疫苗組37例分離物中有13例，安慰劑組49例分離物中有12例無法重獲分型。在疫苗組中，8例(33％)為5型，11例(46％)為8型，5例(21％)為336型。在安慰劑組中，10例(27％)為5型，20例(54％)為8型，7例(19％)為336型。在本研究中從菌血癥患者體內分離的金黃色葡萄球菌的類型分布與其他人報告的結果一致。發(fā)現疫苗組37例金黃色葡萄球菌分離物中有7例，安慰劑48例金黃色葡萄球菌分離物中有12例(對照中有1例分離物未檢測)對甲基青霉素耐藥。疫苗組和安慰劑組分離物對甲基青霉素耐藥的分布相似，符合抗生素耐藥和抗生素敏感的金黃色葡萄球菌都被抗體介導的調理素噬菌作用所殺滅的體外結果。
在第3和第40周之間，有37例金黃色葡萄球菌血癥發(fā)生(疫苗組中11例，安慰劑組中26例)。疫苗組11例分離物中有2例，安慰劑組26例分離物中有6例無法重獲分型。在疫苗組中，5例為5型，3例為8型，1例為336型。在安慰劑組中，6例為5型，11例為8型，3例為336型(P＝0.50，exact chi-square)。在第3和54周之間，有2例疫苗接種者和6例安慰劑患者發(fā)生一次以上的菌血癥(P＝0.11，exactCochran-Mantel-Haenszel檢驗)。
疫苗組和安慰劑組的免疫前抗體濃度沒有統(tǒng)計學顯著的差異。在安慰劑組中，抗體濃度保持在免疫前的水平。在疫苗組中，6周(第一個評價時間點)時抗體濃度的幾何平均值為230微克/毫升5型CPS，206微克/毫升8型CPS，并在此之后降低(表4)?？贵w峰濃度至少為80微克/毫升(估計的保護水平)的患者百分比為5型80％，8型75％。無反應者中包括27名患者(3％)，他們的資料無法獲得。
表6.5型CPS和8型CPS特異抗體濃度的幾何平均值*疫苗組 安慰劑組評價時間5型 8型5型 8型NN(微克/毫升) (微克/毫升)(微克/毫升) (微克/毫升)治療前 892 5.9 8.6 9105.7 8.6第6周 884 230 206 9005.6 8.6第26周 838 120 100 8595.8 8.9第54周 763 74.2 64.57765.7 8.9第67周 507 78.1 65.85126.2 9.4*疫苗組中有2例患者的治療前數值丟失。由于消耗，兩組中的患者數量都隨著時間而減少。
當抗體濃度的幾何平均值低于大約80微克/毫升時，疫苗的效果不具有統(tǒng)計學顯著意義。這種保護水平的估計值來自于免疫前和免疫后6、26、54周所產生數據的內推。對于疫苗組和安慰劑組而言，5型和8型抗體濃度的幾何平均峰值在那些有或無菌血癥的個體中沒有顯著差異。
結果顯示，單次注射金黃色葡萄球菌5型和8型結合物是安全而有免疫原性的，并且能夠保護由ESRD患者組成的免疫受損人群抵抗金黃色葡萄球菌血癥大約40周。該人群發(fā)生金黃色葡萄球菌血癥的風險特別高。近乎90％的血液透析患者對疫苗有反應，并且超過75％的患者獲得了至少80微克/毫升(保護水平估計值)的抗體濃度。在40周后疫苗效果的降低與患者人群體內特異抗體濃度的減少相平行。血液透析患者體內抗體濃度的下降快于健康患者。ESRD患者體內抗體水平的迅速下降可以通過使用激發(fā)劑量的疫苗進行中和。
ESRD患者體內的最低保護抗體水平計算值為大約80微克/毫升，比嗜血流感菌b型CPS抗體和肺炎鏈球菌CPS抗體的保護水平(分別為0.15和1微克/毫升)高2-3log。保護抗體水平的差異可能會造成噬菌細胞功能受損以及ESRD患者的潛在疾病。因此，確定這類患者人群的保護抗體水平為測定疫苗在其他風險患者中的臨床效果提供了替代品。
鼻攜帶與血液透析患者中金黃色葡萄球菌血癥風險的增加相關。金黃色葡萄球菌是最常見的血管通路部位感染致病原，并且是通路相關菌血癥的最高發(fā)原因。盡管數量少，但鼻攜帶仍然使對照，而不是疫苗接種者，發(fā)生菌血癥的風險更高。這提示疫苗接種能夠保護并對抗與鼻攜帶相關的金黃色葡萄球菌感染風險的增加。
在免疫接種后40周內，二價疫苗能夠誘導統(tǒng)計學顯著的保護，對抗所有金黃色葡萄球菌血癥。在加入其他抗原，尤其是336型抗原后效率有所增加。
在需要血液透析維持的終末期腎病(ESRD)患者中進行的雙盲、隨機化、安慰劑對照研究評價了金黃色葡萄球菌5型和8型CPS重組銅綠假單胞菌無毒外毒素A(rEPA)結合疫苗(StaphVAX)的安全性、免疫原性和效果。在73個血液透析中心中的成年患者接受單次肌肉內注射疫苗(n＝894)或生理鹽水(n＝910)。間斷測定5型和8型CPS的IgG抗體水平兩年，并記錄金黃色葡萄球菌血癥的發(fā)病情況。通過比較金黃色葡萄球菌血癥在疫苗組和對照組中的發(fā)病率測定效果。
疫苗反應通常為輕至中度，并且大多數在2天內消退。每種CPS在86％的患者中引起顯著的抗體反應。在免疫接種后第40周，疫苗組中的金黃色葡萄球菌發(fā)病率為11/892，在對照組中為26/906(效果的個人-時間估計值為57％，P＝0.02，95％置信區(qū)間為10至81)。更長間隔的疫苗效果與0沒有顯著差異。估計的CPS特異抗體保護水平為大約80微克/毫升。結合疫苗賦予血液透析患者大約40周抵抗金黃色葡萄球菌血癥的免疫能力，在此之后它的效果將隨著抗體水平的下降而衰退。
在此將提到的所有涉及內容以全文形式引入作為參考。
這里所描述和闡明的技術和結構可以進行多種修改和變化，而不會偏離本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.一種保護免疫受損人員抵抗至少一種葡萄球菌和腸球菌感染的方法，其包括將包括一種多糖或糖肽細菌表面抗原的糖結合物以及免疫載體的疫苗用于免疫受損人員，其中所說的疫苗包括(a)金黃色葡萄球菌5型和8型多糖抗原的糖結合物；(b)一種帶負電的葡萄球菌多糖抗原的糖結合物，其包括β連接的氨基己糖作為主要的碳水化合物成分，并且不包括O-乙酰基團；(c)一種葡萄球菌糖肽抗原的糖結合物，其包括氨基酸和一個不含O-乙?；鶊F且不含己糖的α構像N-乙?；被禾?；(d)一種酸性葡萄球菌多糖抗原的糖結合物，其取自將抗血清凝集至ATCC55254的表皮葡萄球菌的分離物；(e)一種糞腸球菌抗原的糖結合物，其包括摩爾比為1∶2的2-乙酰胺-2-脫氧葡萄糖和鼠李糖；(f)一種糞腸球菌抗原的糖結合物，其包括一個包括6-脫氧糖的三糖重復；(g)一種腸球菌抗原的糖結合物，其包括摩爾比為1∶2的2-乙酰胺-2-脫氧半乳糖和半乳糖；(h)一種腸球菌抗原的糖結合物，其與ATCC202016的抗體發(fā)生反應，或者(i)一種腸球菌抗原的糖結合物，其與ATCC202017的抗體發(fā)生反應。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所說的疫苗包括金黃色葡萄球菌5型和8型多糖抗原中至少一種的結合物。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所說的疫苗包括金黃色葡萄球菌5型和8型多糖抗原兩者的結合物。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所說的疫苗包括一種多糖抗原，其含有β連接的氨基己糖，不包括O-乙?；鶊F，并且能夠與在ATCC55804下沉積的336型金黃色葡萄球菌抗體相結合。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所說的疫苗另外還包括金黃色葡萄球菌5型和8型多糖抗原的結合物。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所說的疫苗包括一種酸性多糖抗原，該抗原取自將抗血清粘附至ATCC55254的表皮葡萄球菌分離物。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所說的疫苗包括一種葡萄球菌糖肽抗原，該抗原包括氨基酸和一個不含O-乙?；鶊F且不含己糖的α構像N-乙酰化氨基己糖。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所說的多糖結合物疫苗包括一種糞腸球菌抗原，該抗原包括摩爾比為1∶2的2-乙酰胺-2-脫氧葡萄糖和鼠李糖。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所說的多糖結合物疫苗包括一種糞腸球菌抗原，該抗原包括一個包括6-脫氧糖的三糖重復。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所說的多糖結合物疫苗包括一種腸球菌抗原，該抗原包括摩爾比為1∶2的2-乙酰胺-2-脫氧半乳糖和半乳糖。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所說的細菌表面抗原是一種莢膜多糖抗原。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所說的細菌表面抗原是一種磷壁酸抗原。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所說的細菌表面抗原是一種糖肽抗原。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所說的免疫受損人員選自終末期腎病(ESRD)患者，進行免疫抑制治療的腫瘤患者，艾滋病患者，糖尿病患者，新生兒，擴展護理機構中的老年人，進行免疫抑制治療的自身免疫病患者，燒傷患者以及急性護理背景中的其他患者。
15.根據權利要求1所述的方法，其中所說的免疫受損人員患有終末期腎病。
16.根據權利要求1所述的方法，其中所說的免疫受損人員是新生兒。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所說的免疫載體是白喉類毒素、破傷風類毒素及其重組技術生產的遺傳解毒變體，或者重組技術生產的銅綠假單胞菌外毒素A或葡萄球菌外毒素或類毒素的無毒突變體。
18.根據權利要求1所述的方法，其中所說的疫苗另外含有一種輔劑或免疫刺激劑。
19.根據權利要求1所述的方法，其中所說的疫苗另外含有一種β-葡聚糖或粒細胞集落刺激因子。
全文摘要
本文公開了用于在免疫受損個體中預防或治療細菌感染的葡萄球菌和腸球菌糖結合物疫苗。這種疫苗含有一個免疫載體以及一種來自臨床致病細菌株的多糖或糖肽表面抗原的結合物。該疫苗可以用于在具有發(fā)生即刻細菌感染風險的環(huán)境中，例如在插管或者手術過程中對免疫受損個體進行主動保護。
文檔編號A61K39/085GK1638794SQ02818423
公開日2005年7月13日 申請日期2002年9月19日 優(yōu)先權日2001年9月19日
發(fā)明者A·I·法托姆, R·B·納索 申請人:Nabi生物醫(yī)藥公司