專利名稱：一種治療仔豬白痢的中藥復(fù)方連翁止痢散及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于獸藥領(lǐng)域，涉及一種治療仔豬白痢的中藥復(fù)方制劑，具體來說，涉及一種連翁止痢散及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
仔豬白痢為仔豬外感暑濕之邪，濕熱郁結(jié)腸內(nèi)，胃腸氣血阻滯，正氣與暑濕熱毒相搏，腸道粘膜及腸壁脈絡(luò)受損，化為膿血而導(dǎo)致的濕熱痢，因此當(dāng)以清熱燥濕，涼血解毒止痢之法進(jìn)行治療，邪毒被祛，則諸證可解?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連、白頭翁、老鸛草和大黃炭的具有抗炎、抗菌和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。仔豬白痢是由大腸桿菌感染導(dǎo)致的腹瀉，該病的發(fā)生除與大腸桿菌在腸道內(nèi)定居和產(chǎn)生腸毒素的作用有關(guān)外，還與由于年齡、免疫狀態(tài)、生理機(jī)能、飼養(yǎng)條件等多種誘因造成的消化機(jī)能紊亂有關(guān)。在各種不利因素的影響下，仔豬消化道內(nèi)食物分解不全的產(chǎn)物或由于發(fā)酵產(chǎn)生的低級(jí)脂肪酸，刺激腸蠕動(dòng)加快而引起瀉下。病豬消化機(jī)能紊亂使腸道菌群失調(diào)，有害細(xì)菌大量繁殖，產(chǎn)生更多的有毒產(chǎn)物，如細(xì)菌內(nèi)毒素和腸毒素。這些有毒產(chǎn)物及食物分解不全的產(chǎn)物刺激腸粘膜發(fā)生炎癥過程，可促進(jìn)液體從腸壁向腸腔滲出，力口重了瀉下。食糜中的大量脂肪酸被向后推移，與大腸腔內(nèi)的堿性離子(鈉、鈣、鉀、鎂)結(jié)合，成為白色脂肪酸皂化物而使糞便變成灰白色，在臨床上即表現(xiàn)為白痢?，F(xiàn)有中藥技術(shù)在治療仔豬白痢方面缺乏系統(tǒng)性，有些因療效不確切而中斷使用，有些使用價(jià)格昂貴的藥物，本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，將上述中藥合用，制備成一種稱之為“連翁止痢散”的純中藥制劑，各藥材相互配合，發(fā)揮協(xié)同增效作用，使用方便、作用機(jī)理明確、毒副作用小、治療仔豬白痢不影響人類健康。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)中藥理論，“連翁止痢散”是由黃連、白頭翁、大黃炭、老鸛草四味中藥經(jīng)粉碎加工制備而成的散劑，具有清熱燥濕，解毒止痢的功效。方用味苦性寒之黃連為君，清熱燥濕，解毒止??；白頭翁為臣，助黃連止痢；老鸛草大為佐，使黃連、白頭翁解毒止痢倍增；黃炭為使，既可協(xié)君藥黃連解毒，又能取其炒炭之收斂功效以助君臣止瀉；四味相配，互相協(xié)同，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，共收清熱燥濕，解毒止痢之功。為提高藥材利用率，并結(jié)合市場(chǎng)的需求，通過體外溶出度的比較試驗(yàn)、與飼料混合后的均勻度比較試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了將連翁止痢散制成普通粉體和極細(xì)粉的優(yōu)缺點(diǎn)，為連翁止痢散制劑工藝提供試驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。一種治療仔豬白痢的中藥組合物，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連100-300g，白頭翁 100-300g，老鸛草 100-300g，大黃炭 100_300g。優(yōu)選的本發(fā)明的中藥組合物，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連200g，白頭翁200g，老鸛草200g，大黃炭200g。本發(fā)明還包括，本發(fā)明的中藥組合物的制備方法，該方法包括，將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎，混勻的步驟。優(yōu)選的制備方法是將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細(xì)粉，過篩，混勻，即得。特別優(yōu)選的制備方法是將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細(xì)粉，必要時(shí)加入輔料，混勻，制備成散劑。所述步驟如下(I)黃連、白頭翁、老鸛草、大黃炭的粗粉碎將水分含量彡12. 0%的藥材按比例粉碎(2)細(xì)粉碎將粗粉的混合均勻加入超微粉碎機(jī)組，使藥材粉碎至粒度>200目，制成超微粉。(3)過篩將細(xì)粉碎后的藥材過200目篩。(4)混合將藥材混合均勻，即得連翁止痢散。本發(fā)明的連翁止痢散的制備方法包括藥材的粉碎、過篩、過濾、混勻等步驟，本發(fā)明可以有效的提聞?dòng)行С煞值奶崛〉寐剩崧勆锢枚?，減少有效成分的損失，該制備方法適合于連翁止痢散的工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明連翁止痢散用于治療仔豬白痢，連翁止痢散按照科學(xué)的處方組成和工藝制備，在較低溫度的環(huán)境下通過粉碎過200目篩制備而得，降低了粗纖維等對(duì)動(dòng)物消化功能的不良影響，同時(shí)在一定程度上降低了有效成分的損耗。由于粉碎粒度達(dá)到75 左右，使藥材中的有效成分充分暴露，有利于豬的消化、吸收，大大提高了藥物的生物利用度，既節(jié)約了中藥資源，又可適當(dāng)提高藥效。連翁止痢散在使用時(shí)采用拌料飼喂，也可混水灌服，使用方便的特性有利于該藥的推廣應(yīng)用。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的連翁止痢散用于治療仔豬白痢效果良好。其用法用量為一次量，每Ikg體重，仔豬0. 25g，一日2次，連用3日。 本發(fā)明還包括，本發(fā)明的中藥組合物的檢測(cè)方法，包括，黃連的薄層鑒別，大黃炭的薄層鑒別，白頭翁藥材的薄層鑒別，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別。其中黃連的薄層鑒別，步驟如下( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状糏Oml溶解，作為供試品溶液；( 2 )對(duì)照品溶液的制備取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。(3)對(duì)照藥材溶液的制備取黃連對(duì)照藥材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成對(duì)照藥材溶液；(4)陰性對(duì)照溶液的制備取缺黃連陰性對(duì)照品0. 3g,同法制成陰性對(duì)照溶液；(5)薄層鑒別展開劑為正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)，點(diǎn)樣量I iil，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。其中，大黃的薄層鑒別，步驟如下( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時(shí)，濾過，蒸干，殘?jiān)铀甀OOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?ml使溶解，作為供試品溶液，(2)對(duì)照藥材溶液的制備取大黃對(duì)照藥材0. Ig,同法制成對(duì)照藥材溶液，(3)陰性對(duì)照溶液的制備
稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對(duì)照品0. 26g,同法制成陰性對(duì)照溶液，(4)薄層鑒別以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，點(diǎn)樣量4 Ul，展開，展距5cm，展畢，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。其中，白頭翁藥材的薄層鑒別，步驟如下供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過。殘?jiān)?0%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時(shí)間20分鐘。濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液；對(duì)照藥材溶液的制備另取白頭翁藥材lg，同法制備對(duì)照藥材溶液；陰性對(duì)照溶液的制備取缺失白頭翁的陰性對(duì)照樣品2g，同法制備陰性對(duì)照溶液；薄層鑒別以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，點(diǎn)樣量2 iil，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 °C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。其中，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別，步驟如下供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘?jiān)?0%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘。濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状糏Oml使溶解，作為供試品溶液；對(duì)照藥材溶液的制備對(duì)照溶液；取白頭翁皂苷B4對(duì)照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；陰性對(duì)照溶液的制備再取缺失白頭翁的陰性對(duì)照樣品3g，同法制成陰性對(duì)照液；薄層鑒別吸取上述溶液各2 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。本發(fā)明的檢測(cè)方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下2. I黃連的薄層鑒別( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状糏Oml溶
解，作為供試品溶液。
( 2 )對(duì)照品溶液的制備取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。(3)對(duì)照藥材溶液的制備取黃連對(duì)照藥材粉末0. 05g,加甲醇IOml,同法制成對(duì)照藥材溶液。(4)陰性對(duì)照溶液的制備取缺黃連陰性對(duì)照品0. 3g,同法制成陰性對(duì)照溶液。(5)薄層鑒別試驗(yàn)參照2005版獸藥典方法，制成供試品、對(duì)照品、對(duì)照藥材及陰性對(duì)照品溶液。試驗(yàn)主要進(jìn)行黃連薄層鑒別條件優(yōu)化包括展開劑、點(diǎn)樣量、預(yù)飽和時(shí)間、薄層板等因素對(duì)色譜分 離的影響。a展開劑的考察以硅膠G板，點(diǎn)樣量2iU，分別用以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6:3:1. 5:1. 5:0. 3)和正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2) [2]作為展開劑展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，斑點(diǎn)清晰集中，確定正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑。b點(diǎn)樣量的考察以硅膠G板，分別點(diǎn)樣2 ill和I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開齊U，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。IiU的點(diǎn)樣量，分離度更好，確定點(diǎn)樣量Iu I。c飽和時(shí)間的考察以硅膠G板，點(diǎn)樣I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。分別考察了展開劑預(yù)飽和時(shí)間0分鐘、10分鐘對(duì)色譜圖的影響。結(jié)果表明，展開劑預(yù)飽和時(shí)間為0分鐘和20分鐘對(duì)色譜分離無明顯影響。確定展開劑無需預(yù)飽和。d薄層板的考察以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，點(diǎn)樣量liU，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。對(duì)不同薄層板(G板、GF254板)進(jìn)行了考察，結(jié)果色譜行為差異不大。參照藥典選擇薄層G板。(6)小結(jié)通過薄層色譜(不同展開劑、不同點(diǎn)樣量、不同的預(yù)飽和時(shí)間、不同薄層板)優(yōu)化，采用色譜條件以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，硅膠G薄層板，點(diǎn)樣量liU，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。2. 2大黃的薄層鑒別(I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時(shí)，濾過，蒸干，殘?jiān)铀甀OOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?ml使溶解，作為供試品溶液。
(2)對(duì)照藥材溶液的制備取大黃對(duì)照藥材0. Ig,同法制成對(duì)照藥材溶液。(3)陰性對(duì)照溶液的制備稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對(duì)照品0. 26g,同法制成陰性對(duì)照溶液。(4)薄層鑒別試驗(yàn)參照2005版獸藥典M中大黃藥材的薄層鑒別方法，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 :5:1)的上層溶液為展開劑，主要考察了不同點(diǎn)樣量、不同預(yù)飽和時(shí)間、不 同薄層板、不同展距對(duì)色譜分離的影響。a點(diǎn)樣量的考察以硅膠G薄層板，分別點(diǎn)樣2 ill和4 iil，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。結(jié)果2iU的點(diǎn)樣量，斑點(diǎn)不清晰，確定點(diǎn)樣量4iU。b飽和時(shí)間的考察以娃膠G薄層板，點(diǎn)樣量I,以石油醚(30-60 °C )-甲酸乙酯_甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。分別考察了展開劑預(yù)飽和時(shí)間0分鐘和10分鐘對(duì)色譜分離效果的影響。結(jié)果表明，展開劑預(yù)飽和時(shí)間為Omin和IOmin對(duì)色譜分離無顯著差異。確定展開無需預(yù)飽和。c薄層板的考察以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，點(diǎn)樣量
4Ul，展開，展距5cm，展畢，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。對(duì)不同薄層板(G板、GF254板、H板)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，硅膠H板展開斑點(diǎn)成點(diǎn)性更好，確定選擇薄層H板。d展距的選擇以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點(diǎn)樣量4 u 1，展開，展距分別為5cm和10cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。展距IOcm時(shí)分離效果更好，確定展距10cm。(5)小結(jié)通過薄層色譜條件(不同點(diǎn)樣量、不同預(yù)飽和時(shí)間、不同薄層板、不同展距)優(yōu)化，采用色譜條件以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點(diǎn)樣量4 yl，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，陰性對(duì)照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。2. 3白頭翁藥材的薄層鑒別(I)方法一取本品0. 3g，加入70%乙醇10ml，振搖20min，過濾，濾液濃縮至1ml，
作為供試品溶液。另取對(duì)照藥材粉末O.lg，同法制成供試品溶液。取缺失白頭翁的散劑0. 2g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各Iu 1，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(70 30 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱5 10分鐘，日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，本品無相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)。(2)方法二 取本品I. 5g，加水10ml，加鹽酸4ml，回流提取lh，過濾，濾液濃縮至5ml，用50ml氯仿萃取一次，氯仿提取液濃縮至5ml，制得供試品溶液。另取白頭翁藥材0. 5g，同法制成對(duì)照藥材溶液；取缺失白頭翁的陰性對(duì)照品lg，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對(duì)照品藥材溶液和陰性對(duì)照溶液各I U 1，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，本品無相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)。 (3)方法三取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過。殘?jiān)?0%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時(shí)間20分鐘。濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液。另取白頭翁藥材lg，同法制備對(duì)照藥材溶液。取缺失白頭翁的陰性對(duì)照樣品2g，同法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液各I U 1，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的褐色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無干擾。確定方法三為供試品溶液制備制備方法。(4)薄層鑒別實(shí)驗(yàn)照方法三，分別制備供試品、對(duì)照品及陰性對(duì)照品溶液，進(jìn)一步優(yōu)化白頭翁薄層鑒條件，主要考察了不同展開劑、不同點(diǎn)樣量、不同飽和時(shí)間、不同薄層板、檢視方法對(duì)檢出效果的影響。a展開劑的考察以硅膠G 板，點(diǎn)樣 I iil，分別用氯仿-甲醇-水(60:40:10 ；65:35:10 ； 55:45:10)和正丁醇-醋酸乙酯-水(4:1:5)作為展開劑,展開,展距5cm,取出，晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果氯仿-甲醇-水(60:40:10)展開效果最佳，斑點(diǎn)清晰，Rf值大小適宜。確定氯仿-甲醇-水(60:40:10)作為展開劑。b點(diǎn)樣量的考察以硅膠G板，分別點(diǎn)樣I ill和2 iil，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果1 Ul點(diǎn)樣量，斑點(diǎn)不清晰且拖尾。確定點(diǎn)樣量為2iU。c飽和時(shí)間的考察以硅膠G板，點(diǎn)樣2 iU，以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。分別考察了預(yù)飽和時(shí)間0分鐘和20分鐘對(duì)色譜分離效果的影響。結(jié)果展開劑預(yù)飽和時(shí)間為0分鐘和20分鐘對(duì)色譜分離效果無顯著影響。確定展開無需預(yù)飽和。d薄層板及檢視方法的考察以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，點(diǎn)樣量
2Ul，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。對(duì)不同薄層板(G板、GF254板、H板)進(jìn)行了考察。結(jié)果薄層板的類型對(duì)白頭翁的薄層分離效果影響不大，且在紫外下均無特征斑點(diǎn)，但硅膠G板和GF254板成點(diǎn)性較好，考慮到硅膠G板較通用，確定選擇硅膠G薄層板在日光下檢視。(5)小結(jié)
通過供試品溶液制備方法、薄層色譜條件(不同展開劑、不同點(diǎn)樣量、不同預(yù)飽和時(shí)間、不同檢視方法)優(yōu)化，采用色譜條件以氯仿-甲醇-水￠0 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，點(diǎn)樣量2 yl，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。2. 4白頭翁皂苷B4的薄層鑒別取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘?jiān)?0%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘。濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状糏Oml使溶解，作為供試品溶液。再取缺失白頭翁的陰性對(duì)照樣品3g，同法制成陰性(同時(shí)按處方量制成的缺失白頭翁樣品)對(duì)照溶液；取白頭翁皂苷B4對(duì)照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國獸藥典》2010年版二部，附錄32頁)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)論通過供試品溶液制備方法、薄層色譜條件優(yōu)化，采用色譜條件以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯一個(gè)相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)。通過參照藥典與文獻(xiàn)方法，分別進(jìn)行了有效成分白頭翁皂苷B4和白頭翁對(duì)照藥材的檢出研究，結(jié)果兩種方法均能有效檢出藥物中的白頭翁。但因目前市場(chǎng)上無法購得中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)的白頭翁對(duì)照藥材，因?yàn)檫x用白頭翁皂苷B4對(duì)照品進(jìn)行白頭翁的薄層鑒別，該方法專屬性很好，沒有干擾，所以選擇以白頭翁皂苷B4作為對(duì)照來檢出復(fù)方的白頭翁，將白頭翁皂苷B4薄層鑒別的方法收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。2. 5老鸛草的薄層鑒別(I)供試品溶液的制備取復(fù)方4. 5g，加甲醇45ml，水浴回流30分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状?6ml溶解，作為供試品溶液。(2)對(duì)照藥材溶液的制備取老鸛草對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液。(3)陰性對(duì)照溶液的制備取缺失老鸛草陰性樣品3. 5g，同法制成陰性對(duì)照溶液。(4)薄層鑒別實(shí)驗(yàn)照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)，主要考察了不同展開劑、不同顯色劑對(duì)色譜分離的影響。a展開劑的考察 以硅膠G薄層板上，點(diǎn)樣量2iU，分別以氯仿-甲醇(10:1)，石油醚-丙酮(5:1)，石油醚-丙酮(2:1),甲苯-氯仿-丙酮(40:25:35)作為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干，置紫外365nm下檢視。在各展開條件下，對(duì)照藥材均無明顯斑點(diǎn)。b顯色劑的考察以硅膠G薄層板上，點(diǎn)樣量2 yl，石油醚-丙酮(2:1)為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別以10%硫酸乙醇、茴香醛顯色，日光下檢視，對(duì)照藥材無明顯斑點(diǎn)。(5)小結(jié)在不同展開體系和不同顯色劑條件下，對(duì)照藥材均無明顯斑點(diǎn)，不能從本品中有效檢出老鸛草藥材，老鸛草藥材的薄層鑒別方法尚待于進(jìn)一步研究，暫不列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的中藥組合物是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)篩選獲得的，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下本發(fā)明以實(shí)施例2所得連翁止痢散對(duì)大腸桿菌感染導(dǎo)致的仔豬白痢的臨床防治效果試驗(yàn)本試驗(yàn)選擇患有腹瀉，排乳白或灰白色漿糊狀腥臭糞便，尾根腹側(cè)、肛門周圍粘有糞便等典型仔豬白痢臨床癥狀的揚(yáng)州江都寶龍豬場(chǎng)的大約梅三元雜交瘦肉仔豬為初選對(duì)象，無菌采集8頭疑似仔豬白痢患豬的肛門棉拭子和2頭病死豬發(fā)炎小腸粘膜病料，按細(xì)菌學(xué)經(jīng)典檢驗(yàn)方法，經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、染色反應(yīng)、生化試驗(yàn)和抗原血清型凝集試驗(yàn)等鑒定證實(shí)，其病原主要是08:F4、0138:F4血清型的致病性大腸桿菌，據(jù)此確診該豬場(chǎng)仔豬所患疾病為致病性大腸桿菌引起的仔豬白痢病。選擇該豬場(chǎng)同日齡健康仔豬作為藥物耐受性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。通過選擇25 35日齡健康斷奶仔豬65頭作連翁止痢散耐受性試驗(yàn)，150頭患白痢斷奶仔豬作實(shí)驗(yàn)性療效試驗(yàn)和80頭25 40日齡患白痢斷奶仔豬作擴(kuò)大臨床療效試驗(yàn)。具體方法如下由于引發(fā)仔豬白痢的因素很多，在試驗(yàn)分組的設(shè)計(jì)過程中，應(yīng)充分考慮天氣、環(huán)境、母豬等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，從而確保試驗(yàn)盡可能在相同條件下進(jìn)行，以減少試驗(yàn)誤差，達(dá)到客觀評(píng)價(jià)藥物療效的目標(biāo)。因此，整個(gè)試驗(yàn)采用同窩對(duì)照試驗(yàn)原則，力求減少主、客觀因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)仔豬給予不添加任何抗菌素的全價(jià)飼料，按常規(guī)飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)。I藥物耐受性試驗(yàn)選取25 35日齡、體重5 6. 5kg的臨床健康斷奶仔65頭，逐頭稱重、編打耳號(hào)后，隨機(jī)分為3組，參照中華人民共和國獸藥典[4]和大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果[5]，其中2個(gè)給藥組各20頭仔豬，分別按連翁止痢散2g/Kg/d、lg/Kg/d的劑量分2次拌飼內(nèi)服，I個(gè)空白對(duì)照組25頭仔豬，給予相應(yīng)量的醫(yī)用淀粉，連續(xù)給藥5d。給藥后每天觀察，仔細(xì)記錄各頭仔豬的采食、飲水、排便和毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間、死亡情況，連續(xù)觀察10d。觀察期內(nèi)自由采食和飲水。觀察期結(jié)束后分別稱重，統(tǒng)計(jì)各組的日均增重，最后各組處死2頭存活仔豬，進(jìn)行眼觀病理學(xué)檢查。2實(shí)驗(yàn)性療效試驗(yàn)選擇該場(chǎng)25 35日齡、體重為5飛.5kg的自然患白痢斷奶仔豬150頭，經(jīng)確認(rèn)仔豬未用過任何藥物治療后，逐頭編打耳號(hào)、稱重后，將同窩仔豬隨機(jī)分為5組即連翁止痢散高、中、低劑量組，仔豬止痢散藥物對(duì)照(陽性藥物對(duì)照)組和陽性對(duì)照(患病不給藥)組，每組各30頭。所有試驗(yàn)組用藥途徑均為拌飼，分2次/d(間隔8 10h)，連用3d。按仔豬耳號(hào)建立病歷檔案，從給藥當(dāng)日起，每天觀察并按組逐頭記錄仔豬的精神狀態(tài)、飲食狀況、腹瀉程度和糞便性狀，好轉(zhuǎn)所需時(shí)間等，觀察期為7d。觀察期結(jié)束后于IOd分別稱重，統(tǒng)計(jì)各組的日均增重(已死亡豬的日均增重記為0)，詳細(xì)分組及給藥試驗(yàn)處理見表I。表I各試驗(yàn)組處理情況
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空Strtl253擴(kuò)大臨床療效試驗(yàn)選擇該場(chǎng)25 40日齡、體重為5 7. 5kg的自然患白痢斷奶仔豬80頭，經(jīng)確認(rèn)仔豬未用過任何藥物治療后，逐頭編打耳號(hào)，將同窩仔豬隨機(jī)分為2組即連翁止痢散治療組和仔豬止痢散治療(陽性藥物對(duì)照)組，每組40頭。兩種藥物都按體重0. 5g/Kg/d劑量(其中連翁止痢散根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)性治療試驗(yàn)結(jié)果確定劑量，仔豬止痢散按說明書給藥)分2次(間隔8 10h)拌飼給藥，連用3d。按仔豬耳號(hào)建立病歷檔案，用藥后每天觀察記錄療效情況，觀察期為7d。因本不同窩試驗(yàn)仔豬日齡和初始體重存在一定的個(gè)體差距，故不再進(jìn)行日均增重統(tǒng)計(jì)，其治療結(jié)果判斷以仔豬排出糞便性質(zhì)變化，作為藥物治療效果的判定標(biāo)準(zhǔn)，治療效果分痊愈、有效、無效3個(gè)級(jí)別，具體標(biāo)準(zhǔn)如下
痊愈治療后患豬糞便成型，干稀適度，顏色正常，尾根腹側(cè)及肛門周圍粘有糞便，仔豬活動(dòng)、精神和食欲恢復(fù)正常，觀察期內(nèi)無復(fù)發(fā)。有效治療后患豬糞便明顯變稠，拉稀次數(shù)明顯減少。仔豬食欲、活動(dòng)和精神狀態(tài)有明顯改善。無效治療后患豬精神、食欲、糞便無明顯改善，甚至加重或死亡。5 結(jié)果5. I藥物耐受性試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)期間，連翁止痢散2g/Kg/d劑量組和lg/Kg/d劑量組試驗(yàn)仔豬采食、飲水、排便均未見異常和任何副作用及中毒現(xiàn)象。給予醫(yī)用淀粉的空白對(duì)照組有3頭仔豬分別在試驗(yàn)開始后2 4d內(nèi)出腹瀉，在未經(jīng)治療的情況下，經(jīng)4 5(1逐步恢復(fù)，該組其余試驗(yàn)仔豬均未見出現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象。觀察期結(jié)束后分別稱重，日均增重統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示連翁止痢散中劑量組最高，為0. 259Kg/d，其次是連翁止痢散高劑量組為0. 258Kg/d，空白對(duì)照組最低為0.252，但3組間無明顯差異(P>0. 05)，詳細(xì)結(jié)果見表3。最后各組隨機(jī) 撲殺2頭仔豬，經(jīng)剖檢胃、腸、心、肝、脾、腎、輸尿管等臟器均未見明顯病理變化，說明連翁止痢散2g/Kg/d以下劑量對(duì)仔豬是安全的。表2耐受性試驗(yàn)各組生長性能n=20，2權(quán)利要求
1.一種治療仔豬白痢的中藥組合物，其特征在于，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連100-300g，白頭翁100-300g，老鸛草100-300g，大黃炭100_300g。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連200g，白頭翁200g，老鸛草200g，大黃炭200g。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，是散劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎，混勻即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細(xì)粉，過篩，混勻，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細(xì)粉，必要時(shí)加入輔料，混勻，制備成散劑。
7.—種權(quán)利要求I所述的中藥組合物的檢測(cè)方法，其特征在于， 包括，黃連的薄層鑒別，大黃炭的薄層鑒別，白頭翁藥材的薄層鑒別，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別。
8.權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，其中黃連的薄層鑒別，步驟如下 (1)供試品溶液的制備 取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状糏Oml溶解，作為供試品溶液； (2)對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液， (3)對(duì)照藥材溶液的制備 取黃連對(duì)照藥材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成對(duì)照藥材溶液； (4)陰性對(duì)照溶液的制備 取缺黃連陰性對(duì)照品0. 3g，同法制成陰性對(duì)照溶液； (5)薄層鑒別 展開劑為正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)，點(diǎn)樣量I yl，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。
9.權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，其中，大黃的薄層鑒別，步驟如下 (1)供試品溶液的制備 取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時(shí)，濾過，蒸干，殘?jiān)铀甀OOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?ml使溶解，作為供試品溶液， (2)對(duì)照藥材溶液的制備 取大黃對(duì)照藥材0. lg，同法制成對(duì)照藥材溶液， (3)陰性對(duì)照溶液的制備 稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對(duì)照品0. 26g，同法制成陰性對(duì)照溶液， (4)薄層鑒別 以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，點(diǎn)樣量4 yl，展開，展距5cm，展畢，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。
10.權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，其中，白頭翁藥材的薄層鑒別，步驟如下供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘?jiān)?0%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時(shí)間20分鐘，濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液； 對(duì)照藥材溶液的制備另取白頭翁藥材lg，同法制備對(duì)照藥材溶液； 陰性對(duì)照溶液的制備取缺失白頭翁的陰性對(duì)照樣品2g，同法制備陰性對(duì)照溶液；薄層鑒別以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，點(diǎn)樣量2 yl，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視； 其中，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別，步驟如下 供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘?jiān)?0%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘，濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状糏Oml使溶解，作為供試品溶液； 對(duì)照藥材溶液的制備對(duì)照溶液；取白頭翁皂苷B4對(duì)照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液； 陰性對(duì)照溶液的制備再取缺失白頭翁的陰性對(duì)照樣品3g，同法制成陰性對(duì)照液； 薄層鑒別吸取上述溶液各2 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療仔豬白痢的中藥復(fù)方連翁止痢散及其制備方法和應(yīng)用。以黃連100-300g，白頭翁100-300g，老鸛草200g，大黃炭200g為原料，按照科學(xué)的處方組成和工藝制備，在較低溫度的環(huán)境下通過粉碎過200目篩制備而得，降低了粗纖維等對(duì)動(dòng)物消化功能的不良影響，同時(shí)在一定程度上降低了有效成分的損耗。由于粉碎粒度達(dá)到75μm左右，使藥材中的有效成分充分暴露，有利于豬的消化、吸收，大大提高了藥物的生物利用度，既節(jié)約了中藥資源，又可適當(dāng)提高藥效。連翁止痢散在使用時(shí)采用拌料飼喂，也可混水灌服，使用方便的特性有利于該藥的推廣應(yīng)用。本發(fā)明還公開了連翁止痢散對(duì)大腸桿菌引起的仔豬白痢有較好的治療作用，具有良好的應(yīng)用和推廣前景。
文檔編號(hào)A61K36/718GK102772508SQ20121028944
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者付海寧, 龐云露, 沈巍, 王春元, 王艷玲, 賈德強(qiáng), 郝智慧, 鐘英杰 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué), 青島康地恩動(dòng)物藥業(yè)有限公司, 青島康地恩藥業(yè)股份有限公司