專利名稱：一種低分子量pei衍生物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分子量PEI衍生物及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種可降解含亞胺鍵的低分子量PEI衍生物、其制備方法和其在核酸藥物(DNA和RNA)輸送中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療，是將外源性基因物質(zhì)(DNA或RNA)導(dǎo)入細(xì)胞，促進(jìn)或者抑制特定蛋白的表達(dá)，或者取代、修復(fù)有問題的基因，從而達(dá)到疾病治療的目的?；蛑委熢谄浒l(fā)展過程中遇到了一系列技術(shù)瓶頸，其中最重要的瓶頸之一是基因物質(zhì)安全有效的體內(nèi)輸送。目前常用的基因 輸送載體可以分為病毒載體及非病毒載體。其中，病毒載體雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但由于病毒的變異會引起潛在的致病危險(xiǎn)，并且病毒表面成分會引起人體免疫反應(yīng)，同時(shí)病毒載體的制備和純化困難且擔(dān)載基因量??；而非病毒載體具有基因擔(dān)載密度和擔(dān)載量大、制備簡單，便于化學(xué)修飾等優(yōu)勢。因此，非病毒基因載體被認(rèn)為是更理想的基因物質(zhì)輸送載體。但是非病毒載體也存在著化學(xué)毒性大的缺點(diǎn)，例如聚乙烯亞胺(PEI)是目前研究最為廣泛的非病毒載體，其中分支狀分子量為25kDa的PEI轉(zhuǎn)染效率最高，但是PEI25kDa同時(shí)因其烷基骨架無法降解而導(dǎo)致其細(xì)胞累計(jì)毒性較大。多數(shù)的國內(nèi)外專家將其研究集中在可降解的PEI衍生物方面。猶他大學(xué)的Sung Wan Kim等人在《緩控釋雜志》(Journal of ControlledRelease2005，103:209-219)上發(fā)表“Polyethylenimine with acid-labile linkages asa biodegradable gene carrier (用酸降解連接劑聚PEI作為基因載體)”的文章,該文章采用戊二醛作為連接劑與低分子量PEI (1800Da)交聯(lián)，生成特征性的含有亞胺鍵連接的可降解聚乙烯亞胺類，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是:與基因形成的復(fù)合物被細(xì)胞攝取后，凝聚基因在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞體和溶酶體的酸性條件下，與低分子量PEI直接相連的亞胺鍵斷開，生成無細(xì)胞毒性的低分量PEI，但是含亞胺鍵的聚合結(jié)構(gòu)不能保證這一載體攜帶核酸進(jìn)入細(xì)胞之前足夠穩(wěn)定，另外，與PEI 25 KDa對照，其轉(zhuǎn)染活性也一般。Jin 等人申請一項(xiàng)題為 “Polycationic gene carriers formed of endogenousamino group-bearing monomers (內(nèi)源性氨基基團(tuán)的單體形成聚陽離子基因載體)”的PCT專利(W02009/100645A1)，該專利中采用人體內(nèi)源性專職凝聚基因的小分子單體精胺分別與1，4_ 丁二醇二氯甲酸酯、1，4_ 丁二酰氯和乙二醛等三個(gè)連接劑縮合得到分別含有氨酯鍵、酰胺鍵和亞胺鍵等聚精胺陽離子，這些聚精胺陽離子均表現(xiàn)出良好的核酸輸送能力，而且，聚合物通過生物響應(yīng)性降解能夠回歸到精胺內(nèi)源性單體的初始狀態(tài)，具有良好的生物相容性，但該技術(shù)的缺陷在于:含有氨酯鍵、酰胺鍵的降解速率比較慢，導(dǎo)致核酸物質(zhì)無法及時(shí)從內(nèi)涵體里逃逸，影響核酸輸送效率；含有亞胺鍵的降解速率比較快，但是載體的不穩(wěn)定性致使其輸送的核酸物質(zhì)尚未到達(dá)胞質(zhì)，便從胞外釋放出來，轉(zhuǎn)染效率大大降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種可降解含亞胺鍵的低分子量PEI衍生物、其制備方法及其在核酸藥物(DNA和RNA)輸送中的應(yīng)用。本發(fā)明使用低毒而無轉(zhuǎn)染活性的低分子量聚乙烯亞胺與安全性已知的藥物代謝產(chǎn)物鄰苯二甲醛或間苯二甲醛制備的可降解含亞胺鍵的低分子量PEI衍生物作為基因載體具有高效、低毒、可降解為起始狀態(tài)小分子的優(yōu)點(diǎn)，可以用于基因物質(zhì)(DNA和RNA)的輸送。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺(PEI)衍生物，其結(jié)構(gòu)式為:
權(quán)利要求
1.一種可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物，其特征在于，所述可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物的基本構(gòu)建單元為低分子量聚乙烯亞胺，所述低分子量聚乙烯亞胺選自重均分子量Mw = 800Da/數(shù)均分子量Mn = 600Da或重均分子量Mw = 1300Da/數(shù)均分子量Mn = 1200Da或重均分子量Mw = 2000Da/數(shù)均分子量Mn = 1800Da或重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亞胺。
3.—種可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)將低分子量聚乙烯亞胺與鄰苯二甲醛或間苯二甲醛按摩爾比為1: 1-1: 3.5的比例加到無水乙醇或氯仿溶劑中，得到反應(yīng)體系； (2)在無水無氧條件下，攪拌、搖動或震蕩反應(yīng)體系，使低分子量聚乙烯亞胺與鄰苯二甲醛或間苯二甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，然后進(jìn)行分離純化，即得可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物的制備方法，其特征在于，所述低分子量聚乙烯亞胺與鄰苯二甲醛或間苯二甲醛的摩爾比優(yōu)選為1: 2.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物的制備方法，其特征在于，所述低分子量聚乙烯亞胺選自重均分子量Mw = SOODa/數(shù)均分子量Mn =600Da或重均分子量Mw = 1300Da/數(shù)均分子量Mn = 1200Da或重均分子量Mw = 2000Da/數(shù)均分子量Mn = 1800Da或重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亞胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物的制備方法，其特征在于，所述分離純化包括以下步驟:將制備的可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物用超純水溶解后，置于活化后的透析袋中透析，所述透析袋的截留分子量為7k IOk ;透析結(jié)束后，用微孔濾膜過濾，所述微孔濾膜的孔徑為0.22 0.45 μ m，最后預(yù)凍、凍干。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物的制備方法，其特征在于，所述透析的時(shí)間為12 48小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述的可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物在基因物質(zhì)輸送中的用途。
9.一種基因物質(zhì)輸送復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物是按照如下方法步驟制備而得:將權(quán)利要求1所述可降解含亞胺鍵的低分子量聚乙烯亞胺衍生物溶液加入到DNA或RNA核酸溶液中，混合均勻，然后室溫下孵育，即得到該基因物質(zhì)輸送復(fù)合物。
10.如權(quán)利要求9所述的基因物質(zhì)輸送復(fù)合物，其特征在于，所述DNA或RNA核酸選自DNA 疫苗、siRNA 或 microRNA。
11.如權(quán)利要求9所述的基因物 質(zhì)輸送復(fù)合物，其特征在于，所述孵育的時(shí)間為20 120分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可降解含亞胺鍵的低分子量PEI衍生物、其制備方法及其在核酸藥物輸送中的應(yīng)用。所述的低分子量PEI衍生物結(jié)構(gòu)式為或其中，x為1～20，y為1～20。其制備方法為將低分子量的聚乙烯亞胺與鄰苯二甲醛或間苯二甲醛按摩爾比為1∶1-1∶3.5配置為無水乙醇溶液，在無水無氧環(huán)境下，室溫發(fā)生醛基與氨基的縮合反應(yīng)，得到低分子量PEI衍生物。該衍生物具有較高的轉(zhuǎn)染活性和較低的細(xì)胞毒性，在不同的細(xì)胞中均有較好的生物活性，是一種高效、低毒的基因輸送載體。
文檔編號A61K48/00GK103214672SQ20131011600
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者袁偉恩, 吳飛, 蘇靖, 徐東, 陳順, 王一格 申請人:上海交通大學(xué)