專利名稱：TGF－β特異性共價(jià)閉合反義分子的制作方法
發(fā)明的背景1、發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用靶向TGF-β的共價(jià)閉合反義分子進(jìn)行的反義治療。本發(fā)明還涉及向細(xì)胞傳遞反義分子的方法。本發(fā)明還涉及治療由TGF-β的產(chǎn)生所引起的疾病的方法。
2、本領(lǐng)域的一般背景和狀況腎小管間質(zhì)性纖維化(Renal tubulointerstitial fibrosis)的特征是積累細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)，是進(jìn)行性腎病的一般性結(jié)果(Kuncio等，Kidney Int.39，550-556(1991))。具單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)的受阻腎是為研究腎小管間質(zhì)性纖維化伴隨腎損傷而建立的一種動(dòng)物模型系統(tǒng)(Klahr等.，Kidney Int.54，286-300(1998))。由輸尿管結(jié)扎所產(chǎn)生的機(jī)械干擾會(huì)導(dǎo)致腎盂積水，腎實(shí)質(zhì)損失和小管改變，如擴(kuò)張、萎縮和凋亡(Gonzalez-Avila等，Pathobiology66，196-204(1998)；Truong等，Kidney Int.50，200-207(1996))。雖然并沒(méi)有完全闡明腎小管間質(zhì)性纖維化的進(jìn)展機(jī)制，但已暗示許多細(xì)胞因子在UUO腎中作為背小管間質(zhì)性纖維化的介體。在這些細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在腎纖維化中起重要的作用，如在血管球硬化(glomerulosclerosis)和痛小管間質(zhì)性纖維化中所證明的那樣(Schiffer等，J.Clin.Invest.108，807-816(2001)；WANG等，Kidney Int.60，96-105(2001))。TGF-β1參與對(duì)組織損傷正常修復(fù)起反應(yīng)的ECM的積累，且通過(guò)異常地過(guò)量產(chǎn)生ECM，如蛋白聚糖、膠原、纖連蛋白和糖蛋白而引起纖維變性的改變(Branton等，Microbes Infect.1，1349-1365(1999)；Okuda等，86，453-462(1990))。TGF-β1還通過(guò)上調(diào)蛋白酶抑制劑和下調(diào)基質(zhì)降解蛋白酶的合成來(lái)抑制新合成的基質(zhì)蛋白的降解。因此，對(duì)TGF-β1的合成和作用進(jìn)行有效阻斷似乎是一種防止纖維變性條件的有希望的方法，如幾篇報(bào)道所提示的那樣(Border等，Nature，360，361-364(1992)；Akagi等，Kidney Int.50，148-155(1996)；Isaka等，Nat.Med.2，418-423(1996)；Isaka等，Kidney Int.55，465-475(1999))。
反義寡核苷酸(AS寡核苷酸)通過(guò)以序列特異性方式降低基因表達(dá)在研究基因產(chǎn)物的功能方面具有價(jià)值，然而，使用寡核苷酸仍然存在幾個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題，如對(duì)核酸酶不穩(wěn)定、序列非特異性和弱的細(xì)胞吸收。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種化學(xué)修飾的寡核苷酸，如硫代磷酸脂和甲基磷酸酯寡核苷酸以增強(qiáng)對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性。但是，每種修飾的寡核苷酸各自都存在問(wèn)題，如缺乏序列特異性、對(duì)RNaseH不敏感和延長(zhǎng)部分血栓形成時(shí)間。而且，擔(dān)心在DNA修復(fù)和復(fù)制期間，循環(huán)水解的修飾核苷酸可摻入基因組中，在基因組DNA中引起突變。我們以前報(bào)道了具有共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)的帶型反義(RiAS)寡核苷酸，其在特異性切除靶c-myb mRNA方面非常穩(wěn)定和有效，而且?guī)缀鯖](méi)有與其它修飾的AS寡核苷酸相關(guān)的問(wèn)題(Moon等，J.Biol.Chem.275，4647-4653(2000)和PCT/KR00/00305)，在此全文納入作為參考。
美國(guó)專利號(hào).5,683,874披露了形成的一種共價(jià)閉合型的核酸序列，但需要平行的和反平行的核酸序列存在于環(huán)的對(duì)邊以形成三螺旋結(jié)構(gòu)。然而，這種結(jié)構(gòu)主要是用于結(jié)合基因組啟動(dòng)子區(qū)域，且不結(jié)合由RNase H靶向降解的互補(bǔ)mRNA，因此，該’874專利沒(méi)有披露和提示且有或沒(méi)有這種平行或反平行序列的共價(jià)封閉反義結(jié)構(gòu)可有效切除靶核酸表達(dá)。
通過(guò)與脂質(zhì)體形成復(fù)合體可以增強(qiáng)反義寡核苷酸的細(xì)胞吸收。雖然脂質(zhì)體具有一些優(yōu)點(diǎn)，如低毒性、缺乏免疫原性和生產(chǎn)簡(jiǎn)單，但是脂質(zhì)體表現(xiàn)出相對(duì)差的細(xì)胞吸收。已經(jīng)表明，與人免疫缺陷病毒(HIV)的tat多肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域融合的蛋白能有效地傳遞到鼠的所有組織中，包括腦(Schwarze等，Science 285，1569-1572(1999))。
tat肽在脂質(zhì)體表面上共價(jià)結(jié)合增加了細(xì)胞內(nèi)的傳遞(Torchilin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,8786-8791(2001))，另外，tat蛋白的一個(gè)小區(qū)域，含有2個(gè)賴氨酸和6個(gè)精氨酸的殘基49-57具有核定位特性。
繼續(xù)需要制備具有特異性、安全和有效的治療性反義分子以及有效傳遞反義分子的系統(tǒng)。
發(fā)明概述本發(fā)明滿足了上述需要。
本發(fā)明的一方面涉及以RiAS分子特異性靶向TGF-β1(TGF-β1 RiAS)。本發(fā)明的另一方面，設(shè)計(jì)了TGF-β1 RiAS并測(cè)試其防止腎纖維化和組織損傷的反義活性。本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明涉及反義分子傳遞混合物以改進(jìn)細(xì)胞吸收。具體地，將TGF-β1 RiAS與tat樣肽混合，然后與脂質(zhì)體復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)TGF-β1 RiAS、tat或tat樣肽與陽(yáng)離子脂質(zhì)體形成的三復(fù)合體能有效阻斷UUO腎中的TGF-β1表達(dá)和保持組織完整。
本發(fā)明涉及特異性抑制TGF-β1表達(dá)的純化的共價(jià)閉合反義分子。該共價(jià)閉合反義分子可以有至少兩個(gè)被莖結(jié)構(gòu)分開(kāi)的環(huán)，其中至少一個(gè)環(huán)包含抑制TGF-β表達(dá)的靶反義序列。具體地，該TGF-β可以是TGF-β1。
上述討論的共價(jià)閉合反義分子可以包含與SEQ ID NO1大體相似的序列。
本發(fā)明還涉及制備上述反義化合物的方法，該方法包括將至少兩個(gè)線性反義分子與莖環(huán)結(jié)構(gòu)相互連接，該莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有彼此充分互補(bǔ)的5’或3’末端。這樣制備了一種共價(jià)閉合分子。在這個(gè)方法中，線性反義分子可以特異于同一靶核酸或不同的核酸。在一方面，該互補(bǔ)區(qū)域可以是大約1-100個(gè)堿基、1-50個(gè)堿基、1-20個(gè)堿基等，但是并不限制序列的長(zhǎng)度。
本發(fā)明還涉及抑制TGF-β表達(dá)的方法，包括將含有TGF-β表達(dá)細(xì)胞的樣品與上述共價(jià)閉合反義分子接觸。
本發(fā)明還涉及治療由TGF-β表達(dá)所引起的疾病的方法，包括用上述共價(jià)閉合反義分子向需要的患者給藥，所述疾病非限制地可以是纖維化、腎纖維化、腎小管間質(zhì)性纖維化、肝纖維化或肺纖維化。
本發(fā)明涉及治療單側(cè)輸尿管阻塞(unilateral ureteric obstruction)的方法，包括用含有上述共價(jià)閉合反義分子的組合物給藥。
本發(fā)明還涉及預(yù)防在損傷部位積累細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的方法，包括用上述共價(jià)閉合反義分子給藥。
本發(fā)明涉及含有共價(jià)閉合反義分子、tat或tat樣肽和載體組分的組合物。該載體可以是脂質(zhì)體，且共價(jià)閉合反義分子可以靶向TGF-β。
本發(fā)明還涉及傳遞共價(jià)閉合反義分子到細(xì)胞的方法，包括用含有共價(jià)閉合反義分子、tat或tat樣肽和載體組分的組合物與該細(xì)胞接觸。本發(fā)明的一方面，tat或tat樣肽和載體組分可以在接觸細(xì)胞前混合。
通過(guò)對(duì)本發(fā)明的描述，參考附圖和所附的權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的這些和其它目的將會(huì)得到更充分的了解。
圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明通過(guò)下文的詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明將會(huì)得到更充分的了解，僅是以說(shuō)明的方式描述，因此并不限制本發(fā)明。其中

圖1顯示對(duì)TGF-β1(TGF-β1 RiAS)的帶型反義分子的示意圖，具體地是116mer(SEQ ID NO3)。已假設(shè)TGF-β1單體寡核苷酸(SEQ ID NO1)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該莖環(huán)由各寡核苷酸的兩末端互補(bǔ)序列形成。莖的5’末端有5’-GATC-3’的4個(gè)堿基的單鏈突出端。兩個(gè)TGF-β1單體分子連接以產(chǎn)生具有二重對(duì)稱的共價(jià)閉合分子。RiAS寡核苷酸由兩個(gè)環(huán)和間插莖組成，各個(gè)環(huán)含有對(duì)TGF-β1的反義序列。
圖2顯示了TGF-β1 RiAS寡核苷酸對(duì)核酸外切酶III的抗性。在15％的變性聚丙稀酰胺凝膠上分析寡核苷酸，第1泳道58merTGF-β1 AS寡核苷酸；第2泳道116merTGF-β1 RiAS；第3泳道58mer用核酸外切酶III處理的TGF-β1 AS寡核苷酸；第4泳道116mer用用核酸外切酶III處理的TGF-β1 RiAS。
圖3A-3B顯示了TGF-β1 RiAS引起的TGF-β1 mRNA的特異性減少。用寡核苷酸(0.1或0.3μg)-tat-脂質(zhì)體的三復(fù)合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用于RT-PCR分析。(A)進(jìn)行RT-PCR以檢測(cè)TGF-β1 RiAS的反義活性。(B)下面的圖顯示的帶是用內(nèi)源雜交引物探測(cè)的Southern印跡的結(jié)果。第1泳道對(duì)照；第2泳道0.1μg TGF-β1 RiAS；第3泳道0.3μg TGF-β1 RiAS；第4泳道0.4μg SC RiAS；第5泳道0.3μg SCRiAS。
圖4A-4B顯示了反義寡核苷酸通過(guò)輸尿管傳遞入腎。用FITC在3’末端標(biāo)記的反義寡核苷酸，在輸尿管結(jié)扎后通過(guò)輸尿管將其灌注到左腎中。將灌注固定的腎組織塊冷凍切片，用合成的包埋劑封固該組織用于顯微觀察(放大250倍)。A，與tat肽和脂質(zhì)體絡(luò)復(fù)合的FITC-寡核苷酸；B，僅是FITC-寡核苷酸。
圖5顯示了2只代表性兔的UUO腎的縱解剖圖。將雄性SD兔麻醉，通過(guò)輸尿管給予TGF-β1 RiAS或?qū)φ展嘧?。在?天，檢測(cè)動(dòng)物，分析縱解剖后的形態(tài)變化。A未灌輸；B僅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
圖6A-6E顯示了采用抗-TGF-β1抗體進(jìn)行的TGF-β1的免疫組織化學(xué)。用腎的冷凍切片組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，用合成的包埋劑封固該固定的脫水組織用于顯微觀察。棕色染色顯示了存在TGF-β1。A未灌輸；B僅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
圖7A-7E顯示了用TGF-β1 RiAS處理的UUO腎中的小管萎縮和擴(kuò)張的組織學(xué)觀察。在PAS染色的組織切片中顯示出小管的萎縮和擴(kuò)張。用TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBS或僅輸尿管阻塞處理后，腎的切片顯示出小管萎縮和擴(kuò)張。A未灌輸；B僅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
圖8A-8E顯示了用TGF-β1 RiAS處理的UUO腎中凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。進(jìn)行了TUNEL測(cè)定來(lái)檢測(cè)腎小管細(xì)胞的凋亡程度。用TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBS或僅輸尿管阻塞處理的UUO腎。A未灌輸；B僅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在本申請(qǐng)中，所用“一”和“一種”既指單個(gè)也指多個(gè)對(duì)象。
如本文所用，“反義”或“AS”指反義核酸(DNA或RNA)及其類似物，且指具有一系列核苷酸堿基序列的一系列化學(xué)形式，核苷堿基序列通過(guò)氫鍵與靶序列的核苷堿基相互作用從而識(shí)別多核苷酸靶序列或序列部分。靶序列可以是單鏈或雙鏈RNA，或者是單鏈或雙鏈DNA。
這種RNA或DNA類似物包括但不限于2’-烷基糖修飾物，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲縮醛(formacetal)、3’-硫代甲縮醛(thioformacetal)、砜、氨基磺酸鹽和硝基氧主鏈修飾物，酰胺和類似物，其中堿基部分已經(jīng)修飾。另外，分子的類似物可以是糖基部分經(jīng)修飾或被另一合適部分取代而形成的聚合物，該形成的聚合物包括但不限于嗎啉代類似物和肽核酸(PNA)類似物。這種類似物包括上述與糖或堿基的連接基團(tuán)和/或結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)的修飾物的各種組合，以便改進(jìn)RNaseH-介導(dǎo)的靶RNA的破壞，結(jié)合親和性、核酸酶抗性和/或靶特異性。
如本文所用“反義治療”是通用術(shù)語(yǔ)，包括含有在體內(nèi)或體外使靶基因失活或使靶RNA序列切除的反義片斷的共價(jià)閉合反義核酸分子的特異性結(jié)合。
如本文所用，“細(xì)胞增殖”是指細(xì)胞分裂。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)”既包括由于較快細(xì)胞分裂和由于較慢細(xì)胞凋亡速度，如細(xì)胞死亡而增加的細(xì)胞數(shù)量。不受控制的細(xì)胞增殖是癌性或異常細(xì)胞類型的標(biāo)志。正常的、非癌性細(xì)胞以用于特定類型的細(xì)胞的頻率特價(jià)有規(guī)律地分裂。例如，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌性狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞分裂和增殖就不受控制。而且，在損傷后，細(xì)胞外的細(xì)胞基質(zhì)過(guò)度生長(zhǎng)。增殖或生長(zhǎng)的抑制作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的失控分裂或厚組織的形成。
如本文所用，“纖維化”是指隨以前的組織損傷或疾病而產(chǎn)生的厚的、堅(jiān)硬的傷痕組織。
如本文所用，“基因”既指基因的完整核苷序列，也或指基因的序列部分。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抑制”和“減少”可交替地用來(lái)表示基因表達(dá)或細(xì)胞增殖或組織生長(zhǎng)或任何其它表型特征的降低。
如本文所用，“基本互補(bǔ)”是指與自身互補(bǔ)并特異性結(jié)合靶RNA的反義化合物具有約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的反義序列。一般來(lái)說(shuō)，并不需要絕對(duì)互補(bǔ)。具有足夠互補(bǔ)性而與靶核酸形成穩(wěn)定二聚體或三聚體的任何反義分子都被認(rèn)為是合適的。因?yàn)榉€(wěn)定的二聚體形成依賴于雜交反義分子的序列和長(zhǎng)度以及反義分子與靶序列之間的互補(bǔ)程度，在與比常規(guī)使用的大約13-30個(gè)堿基的短線狀寡核苷酸更長(zhǎng)的寡核苷酸互補(bǔ)時(shí)，系統(tǒng)能耐受更小的保真度。
如本文所用，“基本相似”是指與另一種核酸具有約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的核酸序列。對(duì)于與具有相同靶的另一種反義分子具有基本相似序列的反義分子，該基本相似分子的作用能力是重要的，只要基本相似分子顯示靶抑制活性。
當(dāng)三聚體結(jié)構(gòu)的形成包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)時(shí)，應(yīng)了解這種形成并不需要實(shí)施和取得本發(fā)明的有利特征。例如，不需要如美國(guó)專利號(hào)5,683,874公開(kāi)的在環(huán)的對(duì)邊設(shè)計(jì)帶有平行或反平行序列的寡核苷酸環(huán)結(jié)構(gòu)。
如本文所用，“靶”或“靶的”是指針對(duì)其制備反義分子的特定單個(gè)基因。在某些上下文中，“靶的”是指使反義分子與內(nèi)源表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子結(jié)合或使內(nèi)源表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子與反義分子結(jié)合，從而消除靶基因的表達(dá)。該靶核苷序列可以選自與各種惡性有關(guān)的基因，包括與各種疾病的引發(fā)和進(jìn)展有關(guān)的基因，如免疫疾病、傳染病、代謝性疾病、遺傳病和纖維變性病或由基因，包括屬于TGF-β超家族的基因，具體的是TGF-β1的異常表達(dá)所引起的任何其它疾病。
在生物化學(xué)和生物活性方面，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的反義分子優(yōu)于常規(guī)的線性合成的AS-寡核苷酸。常規(guī)的AS-寡核苷酸能用DNA合成儀容易地合成，但它們需要選擇靶位點(diǎn)。選擇靶位點(diǎn)的過(guò)程有時(shí)稱為“AS-寡核苷酸設(shè)計(jì)”。該過(guò)程耗時(shí)且常不確定。另外，合成的AS-寡核苷酸對(duì)核酸酶不穩(wěn)定，經(jīng)常有序列錯(cuò)誤，生產(chǎn)成本高，甚至在與脂質(zhì)體復(fù)合后表現(xiàn)出差的細(xì)胞吸收。
如本文所用，“tat肽”和“tat-樣肽”是相關(guān)的術(shù)語(yǔ)。具體地，tat肽是指帶有可能修飾的tat蛋白的一部分，tat-樣肽指以與tat肽相似的方式促進(jìn)核酸插入細(xì)胞的肽。在一方面，tat-樣肽可以與tat肽具有序列相似性。在另一方面，tat-樣肽可以是三聚體或與tat肽具有電荷相似性，只要本發(fā)明的反義化合物可以容易地轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。在本申請(qǐng)中，如果提到tat肽能促進(jìn)反義分子轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，那么可假定tat-樣肽也可以使用。
TGF-β1TGF-β1是25kDa的同型二聚體，由兩個(gè)通過(guò)二硫鍵連接在一起的12.5kDa亞基組成。TGF-β1最初用其使兔成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變的能力來(lái)定義。TGF-β1是具有細(xì)胞-和劑量-依賴活性的多能細(xì)胞因子。雖然TGF-β1是大多數(shù)細(xì)胞類型的生長(zhǎng)抑制劑，但是它能作為一些細(xì)胞類型的刺激劑。TGF-β1的分布普遍存在。關(guān)于TGF-β1的綜述，參見(jiàn)Massague，J.Ann.Rev.Cell Biol.6，597.(1990)；Letterio等，Ann.Rev.Immunol.16，137(1998)。經(jīng)證實(shí)，TGF-β1對(duì)大量的細(xì)胞型具有調(diào)節(jié)作用，月調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、骨形成、乳房發(fā)育、傷口愈合、血細(xì)胞形成、血管發(fā)生、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。就免疫系統(tǒng)而論，TGF-β1抑制T和B細(xì)胞增殖并在體內(nèi)和體外起消炎分子的作用。TGF-β1抑制巨噬細(xì)胞成熟和激活，還抑制自然殺傷細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)的活性并阻斷細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
事實(shí)上，所有的細(xì)胞都具有TGF-β1受體，其在這些細(xì)胞中調(diào)控各種功能。到目前為止，已鑒定了9種與TGF-β1結(jié)合的膜蛋白(參見(jiàn)第8頁(yè)中的綜述)，分布最廣泛的是TGF-β1受體I和II，分子量分別為53kDa和70kDa的蛋白，I和/或II型受體的喪失與細(xì)胞對(duì)TGF-β1反應(yīng)的喪失相關(guān)。已經(jīng)克隆了II型受體，證實(shí)其含有一功能性絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)域。體內(nèi)產(chǎn)生的TGF-β1是無(wú)活性的，由成熟的25kDa二聚體組成的潛活形式，與其75kDa的前肽二聚體(一種潛伏型相關(guān)前肽)非共價(jià)連接，TGF-β1與鼠、牛、豬和恒河猴細(xì)胞發(fā)生種交叉反應(yīng)。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β1)超家族轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族包括一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白，這些蛋白對(duì)胚胎發(fā)育期間的各種分化過(guò)程有影響。該家族包括但不限于繆勒氏管抑制物(MIS)，其是正常雄性發(fā)育所需的(Behringer等，Nature，345167，1990)；果蠅Decapentaplegic(DPP)基因產(chǎn)物是背腹軸形成和成蟲(chóng)盤(pán)(imaginal disks)的形態(tài)發(fā)生所需的(Padgett等，Nature，32581-84，1987)；爪蟾(Xenopus)Vg-1基因產(chǎn)物定位于卵的植物極(Weeks等，Cell，51861-867，1987)；活化素(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135957-964，1986)能誘導(dǎo)爪蟾胚胎中胚層和腹面結(jié)構(gòu)的形成(Thomsen等，Cell，63485，1990)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP，如BMP-2、3、4、5、6、7和8，成骨素，OP-1)能誘導(dǎo)軟骨和骨重新形成(Sampath等，J.Biol.Chem，26513198，1990)。TGF-β1基因產(chǎn)物能影響各種分化過(guò)程，包括脂肪形成、肌發(fā)生、軟骨形成、血細(xì)胞生成和上皮細(xì)胞分化(綜述參見(jiàn)Massague，Cell 49437，1987)，在此全文納入作參考。
TGF-β超家族的蛋白最初是合成為一個(gè)大的前體蛋白，隨后該前體蛋白在C末端大約110-140個(gè)氨基酸的一串堿性殘基處受到蛋白酶剪切。蛋白的C末端區(qū)域在結(jié)構(gòu)上都是相關(guān)的，基于它們的同源性程度，將不同的家族成員分成不同的亞組。雖然在具體亞組內(nèi)的同源性為70-90％的氨基酸序列同一性，但在亞組間的同源性明顯較低，一般僅為20％-50％。在各種情況下，活性的種似乎是C末端片斷的二硫鍵連接的二聚體。已對(duì)大多數(shù)家族的成員進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)同源二聚體種具有生物活性，但對(duì)其它家族成員，如抑制素(Ung等，Nature，321779，1986)和TGF-β’s(Cheifetz等，Cell，48409，1987)，也檢測(cè)了異源二聚體，比各自的同源二聚體似乎具有不同的生物學(xué)特性。
TGF-3基因超家族的成員包括但不限于TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(小雞)、TGF-β1、TGF-β5(爪蟾)、BMP-2、BMP-4、果蠅DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蠅60A、GDF-1、爪蟾Vgf、BMP-3、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。這些基因在Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998中有討論，在此全文納入作參考。
優(yōu)選地，TGF-β蛋白超家族的成員是TGF-β。更優(yōu)選地，成員是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7或BMP-8.更優(yōu)選地，成員是人或豬TGF-β。更優(yōu)選地，成員是人或豬TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3.最優(yōu)選地，成員是人或豬TGF-β1。
共價(jià)閉合的反義寡核苷酸在反義治療領(lǐng)域中，使用長(zhǎng)的反義分子的常規(guī)方法已經(jīng)令人失望，因?yàn)锳S-寡核苷酸越長(zhǎng)其特異性就越小，就越難合成且細(xì)胞吸收效率低。的確，化學(xué)修飾的第二代AS-寡核苷酸，如硫代磷酸脂修飾的寡核苷酸隨著其長(zhǎng)度的延伸序列特異性降低。而且，隨著AS-寡核苷酸長(zhǎng)度的增加，線性AS-寡核苷酸的合成變得越來(lái)越困難且序列保真度顯著降低。另一方面，共價(jià)閉合的反義寡核苷酸分子表現(xiàn)出較大的穩(wěn)定性，即使分子較長(zhǎng)，且與短線性寡核苷酸相比該分子含有額外的靶位點(diǎn)。
本發(fā)明的RiAS可以通過(guò)連接至少兩個(gè)含有反義序列的線性寡核苷酸來(lái)制備，反義序列以相同或不同基因?yàn)榘校蛟趩我痪€性寡核苷酸內(nèi)有多個(gè)靶。該連接可以發(fā)生在末端，優(yōu)選發(fā)生在磷酸化的5’末端，其中在該5’末端有幾個(gè)堿基彼此基本互補(bǔ)，于是發(fā)生雜交和連接，導(dǎo)致帶型寡核苷酸的形式。該分子的長(zhǎng)度不限于，具體可以是約20-1000個(gè)核苷，約20-700個(gè)核苷，約20-600個(gè)核苷，約20-500個(gè)核苷，約20-400個(gè)核苷，約20-300個(gè)核苷，優(yōu)選約20-150個(gè)核苷，更優(yōu)選約20-120個(gè)核苷。
在本發(fā)明的特定具體實(shí)施方案中，TGF-β1 mRNA的帶型反義分子表現(xiàn)出以序列特異性方式消除靶mRNA并能緩解UUO腎中的球組織損傷。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，TGF-β1 RiAS寡核苷酸可以用作治療劑來(lái)治療與組織纖維化或UUO有關(guān)的各種腎病。這項(xiàng)研究的結(jié)果證實(shí)了帶型反義分子具有增強(qiáng)特性。將TGF-β1 RiAS有效地傳遞入小管上皮細(xì)胞中能有效地抑制小管TGF-β1的表達(dá)，因而能阻止隨之發(fā)生的小管損傷，如UUO腎的萎縮、擴(kuò)張和凋亡。
Tat和Tat樣肽一般地，由于在其聚合骨架上帶負(fù)電荷，因此反義寡核苷酸表現(xiàn)出差的細(xì)胞吸收。當(dāng)與脂質(zhì)體復(fù)合時(shí)，寡核苷酸的細(xì)胞吸收顯著提高(Wheeler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11454-11459(1996))。然而，含有脂質(zhì)體的非病毒傳遞載體對(duì)許多類型的細(xì)胞不提供令人滿意的吸收效率，特別是對(duì)初級(jí)培養(yǎng)物的細(xì)胞。因此，研制出一種改良的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于體外細(xì)胞系研究和體內(nèi)應(yīng)用都有利。我們?cè)O(shè)計(jì)出一種簡(jiǎn)單的混合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含反義寡核苷酸、tat-樣肽和脂質(zhì)體或任何其它載體以提高RiAS寡核苷酸的細(xì)胞吸收。已經(jīng)表明tat蛋白的一短片段具有核酸濃縮、膜滲透和核定位的特性。這些特性可以用來(lái)增強(qiáng)核苷酸分子和結(jié)合蛋白的細(xì)胞吸收(Efthymiadis等，J.Biol.Chem.273，1623-1628(1998)；Schwartz等，Curr.Opin.Mol.Ther.2，162-167(2000))。發(fā)現(xiàn)該tat肽比具有相似特性的可比短肽，如SV40大T抗原肽更有效(數(shù)據(jù)在別處報(bào)導(dǎo))。
在本申請(qǐng)中，具體舉例的tat肽具有氨基酸序列RKKRRQRRRPPQC(SEQ ID NO4)。但是，應(yīng)了解其它的序列也包括在本發(fā)明的tat肽的范圍之內(nèi)。例如也可使用RKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO5)(tat蛋白的49-59)。此外，還可以使用86tat蛋白。對(duì)tat蛋白進(jìn)行修飾是允許的，例如但不限于RKKRRQRRRPPQ的羧基修飾(如tat-RGD)。另外，其它的序列也可以使用，如tat蛋白的第一外顯子(48-72氨基酸)部分。
在本發(fā)明的另一方面，可以使用其它的tat-樣肽，例如但不限于Antp、W/R、NLS，AlkCWK16、DiCWK18、轉(zhuǎn)運(yùn)子(Transportan)、K16RGD、VP22、SCWKn、(LARL)n、HA2、RGD、L-低聚體、SV40等，只要肽有利于將反義化合物插入細(xì)胞中。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體可以與tat或tat-樣蛋白或任何其它的載體肽共價(jià)連接，且可以與tat或tat-樣蛋白或任何其它可用的載體復(fù)合或混合。
TGF-β1相關(guān)疾病本發(fā)明涉及治療或預(yù)防由TGF-β1表達(dá)引起的任何病癥或TGF-β1在部位停止表達(dá)引起的任何病癥，該治療和預(yù)防是有益的，且能治療或緩解疾病的癥狀。這些疾病可以包括但不限于皮膚損傷，如硬皮??；骨髓纖維化，如骨髓增生性疾病，腎纖維化，肝纖維化，肺纖維化，化學(xué)療法/放射療法誘發(fā)的纖維化，狹窄，移植(異體移植物排斥)，北洛尼氏病，慢性胰腺炎，血管病，肝硬化(酒精、HCV)，哮喘，肺氣腫，腸疾病，克隆氏病，高雪氏病，血管病，心臟纖維化，系統(tǒng)性硬化等。
腎小球硬化和纖維化TGF-β1在UUO腎中的主要產(chǎn)源是間質(zhì)成纖維細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞(Isaka等，Kidney Int.58，1885-1892(2000))。當(dāng)通過(guò)輸尿管灌注寡核苷酸復(fù)合體時(shí)，我們檢測(cè)到小管上皮細(xì)胞中的熒光信號(hào)。以前報(bào)道，用HVJ脂質(zhì)體將反義寡核苷酸通過(guò)輸尿管反向灌注會(huì)導(dǎo)致間質(zhì)成纖維細(xì)胞的選擇性轉(zhuǎn)染(Tsujie等，Kidney Int.57，1973-1980(2000))。在另一報(bào)道中，當(dāng)用導(dǎo)管將與HVJ/脂質(zhì)體復(fù)合的SV40大T抗原基因通過(guò)腎動(dòng)脈導(dǎo)入腎時(shí)，在頸動(dòng)脈球細(xì)胞中檢測(cè)到基因表達(dá)(Tomita等，Biochem.Biophys.Res.Commun.15，129-134(1992))。研究了脂質(zhì)體(DOTMA/DOPE)-介導(dǎo)的基因傳遞的三種不同途徑，包括腎內(nèi)骨盆逆行(intra-renalpelvic retrograde)、實(shí)質(zhì)注射和腎動(dòng)脈注射(Lai等，Gene Ther.4，426-431(1997))。通過(guò)骨盆逆行和腎動(dòng)脈注射，而不通過(guò)實(shí)質(zhì)注射檢測(cè)皮質(zhì)和骨髓外細(xì)胞中的β-半乳糖苷酶活性。我們和其它人的觀察都證明傳遞途徑和載體向性是檢測(cè)腎中靶細(xì)胞類型的重要因素。
在本研究中，用TGF-β1 RiAS處理顯著降低了腎中的TGF-β1表達(dá)和小管凋亡，因而改善了球狀組織損傷。由于組織纖維化是發(fā)生在腎、肝和肺中的許多類型的人疾病進(jìn)展的關(guān)鍵特性，因此，可以預(yù)期在這些疾病中，施用針對(duì)TGF-β1的帶型反義寡核苷酸可以治療這些器官的纖維化損傷。
單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)UUO是臨床性疾病，由許多先天性或獲得性疾病過(guò)程引起。其與受阻腎的功能顯著降低有關(guān)(Klahr，S.Kidney Int.54，286-300(1998))。鑒別介導(dǎo)小管損傷的因子在受傷腎的保護(hù)和恢復(fù)方面具有價(jià)值，機(jī)械阻塞導(dǎo)致UUO腎過(guò)度產(chǎn)生前纖維變性和促凋亡的介體，特別是TGF-β1(Kaneto等，Kidney Int.44，313-321(1993))。已有報(bào)道，TGF-β1主要在皮層和外骨髓的腎小管細(xì)胞中表達(dá)，但在管周間質(zhì)細(xì)胞中也表達(dá)(Fukuda等，Am.J.Physiol.Renal Physiol.281，F(xiàn)513-F521(2001))。TGF-β1也參與暴露于機(jī)械牽張的小管細(xì)胞的凋亡(Miyajima等，Kidney Int.58，2301-2313(2000))。
治療組合物在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療各種疾病，其特征是過(guò)量形成細(xì)胞外基質(zhì)，如纖維化或任何其它疾病，其中TGF-β超家族的一個(gè)成員正?；虍惓５乇磉_(dá)，在這場(chǎng)合需要抑制基因的表達(dá)。這樣，可以用本發(fā)明的治療化合物向病人或易患病的人給藥，通過(guò)提供該化合物抑制TGF-β超家族一個(gè)成員的表達(dá)。具體地，該疾病與腎、肝和肺及其它的纖維化有關(guān)。
治療化合物的配制一般是本領(lǐng)域已知的，且可方便地參考《雷明頓制藥科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA。例如，每千克體重可以給予的0.05μg-20mg?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳的治療效果。例如，每天可以給予幾個(gè)均分劑量或者根據(jù)治療情況的緊急性按比例減少劑量?；钚曰衔锟梢砸员憷姆绞浇o予，如通過(guò)口服、靜脈內(nèi)(如水溶性)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或栓劑途徑或植入(如使用低釋放分子通過(guò)腹腔途徑或使用細(xì)胞，如體外敏化的單核細(xì)胞或樹(shù)狀細(xì)胞并過(guò)繼地轉(zhuǎn)移到受體)。根據(jù)給藥途徑，可能需要將肽包被在一種材料中以保護(hù)其免受酶、酸和其它可能使成分失活的自然條件的作用。
例如，反義分子的低親脂性會(huì)使它們?cè)谖改c道中被能剪切肽鍵的酶破壞，和在胃中被酸水解。為了用除胃腸外給藥的方式給予反義分子，將其用能防止其失活的材料包被或與能防止其失活的材料一起給藥。例如，反義分子可在輔劑中給藥或與酶抑制劑共給藥或在脂質(zhì)體中給藥。本文設(shè)想的輔劑包括間苯二酚，非離子型表面活性劑，如聚氧乙烯油基醚和n-十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(diisopropylfluorophosphate)(DEP)和抑胰肽酶。脂質(zhì)體包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳液和常規(guī)的脂質(zhì)體。
活性化合物也可以非腸道或腹腔注射方式給藥。也可以在甘油液態(tài)聚乙二醇、其混合物和油中制備分散液。在保存和使用的一般條件下，這些制劑含防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
適合注射使用的藥物形式包括無(wú)菌的水溶液(如果水溶性)或分散體和用于即時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散體的無(wú)菌粉末。在所有的情況下，該形式必須是無(wú)菌且必須是可容易注射的流體形式。在制造和貯存條件下其必須穩(wěn)定且必須防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，該溶劑或分散介質(zhì)含有如水、乙醇、多羥基化合物(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油。合適的流動(dòng)性可以通過(guò)如下方法維持，如使用包衣，如卵磷脂，維持分散體需要的顆粒大小和使用表面活性劑(superfactant)?？梢允褂酶鞣N抗細(xì)菌和抗真菌劑來(lái)防止微生物的作用，例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、theomersal等。在許多情況下，優(yōu)選使用等滲劑，如糖或氯化鈉。通過(guò)使用延遲吸收的試劑組分，如單硬脂酸鋁和明膠可以延長(zhǎng)注射組合物的吸收。
無(wú)菌注射液通過(guò)將所需量的活性化合物摻入具有上述各種其它成分的合適溶劑來(lái)制備，如果需要，接著行過(guò)濾消毒。一般地，分散體是通過(guò)將各種無(wú)菌活性成分摻入含有堿性分散介質(zhì)和上述所需的其它成分的無(wú)菌載體來(lái)制備。對(duì)于用來(lái)制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這些技術(shù)從其以前無(wú)菌過(guò)慮溶液中產(chǎn)生活性成分的粉末加上任何其它所需的成分。
當(dāng)反義分子如上所述被合適地保護(hù)時(shí)，該活性成分可以口服給藥，如與惰性稀釋劑或與可吸收的食用載體一起給藥，或者可以將其封裝在硬或軟殼明膠膠囊中，或者將其壓制成片劑，或者與飲食的食品直接混合。對(duì)于口服給藥，可以將活性化合物與賦形劑混合并用于可攝入的片劑、含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、包藥干膠片等。
這些組合物和制劑應(yīng)至少含有1％重量的活性化合物。當(dāng)然，該組合物和制劑的百分比可以變化，合適地可以是單位重量的約5-80％。在該治療用組合物中的活性化合物的量是獲得的合適劑量。本發(fā)明制備的優(yōu)選組合物或制劑的口服劑量單位形式含有約0.1μg-2000mg的活性化合物。
上述片劑、丸劑、膠囊等還可以含有下列物質(zhì)粘合劑，如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠，賦形劑，如磷酸二鈣，崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等，潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂；還可以加入甜味劑，如蔗糖、乳糖或糖精，或調(diào)味劑，如胡椒、冬青油或櫻桃味調(diào)味品。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，其除了含有上述物質(zhì)外，還含有液態(tài)載體。其它的各種物質(zhì)可以用作包衣，或者以不同方式改良劑量單位的物理形式。例如，可以用蟲(chóng)膠糖或兩者包被片劑、丸劑或膠囊。糖漿或酏劑也可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的甲基羥苯丙酯、顏料和調(diào)味劑，如櫻桃味或柑桔味。當(dāng)然，在制備任何劑量單位形式中使用的任何材料應(yīng)該是使用量的藥學(xué)上純的和實(shí)質(zhì)上無(wú)毒性的。另外，活性化合物可以摻入持續(xù)釋放制劑和制成物中。
在本文中使用的“藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和試劑對(duì)于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域熟知的。除了與活性成分不相容外，可以在治療組合物中使用任何常規(guī)介質(zhì)或試劑。也可以將補(bǔ)充的活性成分摻入組合物中。
配成劑量單位形式的腸胃外組合物特別有益于方便給藥和劑量的均一性，本文使用的劑量單位形式是指適合作為單一劑量以向待治療的哺乳動(dòng)物給藥的物理分散單位；每單位含有計(jì)算的預(yù)定量的活性材料以產(chǎn)生與所需藥物載體結(jié)合的所需治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格直接依賴于(a)活性材料的獨(dú)特性質(zhì)和達(dá)到的特定治療效果；和(b)在混合用于治療活受試者疾病的活性材料的現(xiàn)有技術(shù)中原有的局限性，活受試者患有疾病且其身體健康受到損害。
在劑量單位形式中，有效量的主要活性成分與合適的藥學(xué)上可接受的載體混合，以使給藥方便和有效。例如，劑量單位形式可含有主要活性成分的量的范圍大約為0.5μg-200mg，以比例形式表示即活性成分一般以允0.5μg/mL的載體存在。在組合物含有輔助活性成分的情況下，參考通常劑量和所述成分的給藥方式確定劑量。
共價(jià)閉合的反義分子傳遞載體本發(fā)明的反義傳遞載體可以包括有利于將本發(fā)明的該反義化合物傳遞到感興趣細(xì)胞的各種化合物或方法。本發(fā)明中使用的核苷酸傳遞方法或載體可以包括但不限于陽(yáng)離子脂質(zhì)體、PEG-脂質(zhì)、PEG、聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、樹(shù)狀聚合物、聚(D，L-乳酸)、病毒體、電穿孔、磁轉(zhuǎn)染(magnetofection)、裸DNA、脂質(zhì)-聚陽(yáng)離子-DNA(LPD)、葉酸結(jié)合納米顆粒、與整合素α，β3-靶向配體結(jié)合的陽(yáng)離子納米顆粒(NP)、(經(jīng)改良的)DNA結(jié)合病毒、短的兩親肽、基因激活基質(zhì)(GAM)、聚(α-(4-氨基丁基)-L-羥乙酸)(PAGA)、含有咪唑的聚合物、脫乙酰殼多糖、明膠、非端膠原、聚((D)，(L)-乳酸-共-羥乙酸)(PLGA)、基于環(huán)式糊精的聚合物體、組氨酸和賴氨酸(HK)聚合物、糖靶向傳遞系統(tǒng)、多孔聚合微球體等。
各種傳遞系統(tǒng)是已知的，且可以用于施用本發(fā)明化合物，如用脂質(zhì)體封裝、微顆粒、微膠囊、能表達(dá)反義化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、構(gòu)建作為逆轉(zhuǎn)錄病毒部分的核酸或其它載體等。導(dǎo)入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服路徑。化合物或組合物可以以任何方便的途徑給藥，如灌輸或推注，通過(guò)上皮或粘膜與皮膚的襯層(mucocutaneouslinings)(如口粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并可以與其它生物活性劑一起給藥。給藥可以是全身的或局部的。另外，還可以將本發(fā)明的藥物化合物或組合物通過(guò)任何合適途徑，如心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射而導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以通過(guò)心室內(nèi)導(dǎo)管進(jìn)行心室內(nèi)注射，如與貯器連接的導(dǎo)管，如Ommaya貯器。還可以使用肺部給藥，例如通過(guò)使用吸入器或噴霧器，且具有霧化劑的制劑。
在特定的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物反義化合物或組合物局部給藥到需要治療的區(qū)域是理想的，其實(shí)施的方式例如但不限于在外科手術(shù)、局部應(yīng)用期間進(jìn)行局部灌輸，如與外科手術(shù)后的傷口敷料結(jié)合灌輸，通過(guò)注射、通過(guò)導(dǎo)管、通過(guò)栓劑或通過(guò)植入。所述的植入可以是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，如sialastic膜或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)用蛋白質(zhì)，包括本發(fā)明的抗體或多肽給藥時(shí)，必須注意要使用蛋白質(zhì)不吸附的材料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物或組合物可在小泡中傳遞，具體是在脂質(zhì)體中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，化合物或組合物可在控釋系統(tǒng)中傳遞。在一實(shí)施方案中，可使用泵。在另一實(shí)施方案中，可使用聚合材料。在又一實(shí)施方案中，可將控釋系統(tǒng)置于治療靶，如腦的附近，因此僅需要全身劑量的一部分。
如果其給藥可被受體動(dòng)物耐受并適合于向該動(dòng)物給藥，那么該化合物就是所述的“藥物學(xué)上或生理學(xué)上可接受的”。如果給藥的量是生理學(xué)上有意義的，那么該試劑就是所述的以“治療有效量”給藥。假如其存在導(dǎo)致受體患者生理學(xué)上的可檢測(cè)改變，那么該試劑是生理學(xué)上有意義的。
本申請(qǐng)?jiān)敿?xì)描述的具體實(shí)施方案并不對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。事實(shí)上，除了本文所描述的外，根據(jù)上述說(shuō)明和附圖，本發(fā)明的各種改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這些改進(jìn)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。下實(shí)施例僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1-細(xì)胞系和動(dòng)物大鼠肝癌細(xì)胞系H4-IIE從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，37°c、維持在含有10％熱激活胎兒牛血清(JBI，Daegu，Korea)和青霉素(100U/mL)/鏈霉素(100μg/mL)的EMEM培養(yǎng)基中，置于5％CO2增濕培養(yǎng)箱。。
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由SLC(Hamamatsu，Shizuoka，Japan)提供。6個(gè)一組在標(biāo)準(zhǔn)食物和水情況下自由圈養(yǎng)。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的雄性SD鼠體重為200-250g。用戊巴比妥(5mg/100g體重)腹腔內(nèi)注射麻醉后，切開(kāi)腹部中線使左腎暴露。將鼠靠近左腎的輸尿管結(jié)扎，接著用24-規(guī)格導(dǎo)管注射器逆向注射TGF-β1RiAS或?qū)φ展押塑账帷?br> 實(shí)施例2-大鼠TGF-β1 RiAS的構(gòu)建用自動(dòng)DNA合成儀ExpediterTM8909(Applied Biosistems，F(xiàn)oster City，CA)合成寡核苷酸。用DNAsis程序(Hitachi Software，San Bruno，CA)通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)的順序重疊模擬選擇AS寡核苷酸的靶位點(diǎn)(Matsuda等，Mol.Biol.Cell 7，1095-1106(1996))，TGF-β1的反義序列和顛倒(scrambled)寡核苷酸的序列如下反義序列5’-GAT CCA GGA CTG TGT GTG ATG TCT TTG GTT TTG TCA TAG ATT GCGTTG TTG CGG CCT G-3’(SEQ ID NO1)；和反顛倒序列5’-GAT CCG CTG TCG TGCTGG TCT TGA GTT AAT TCG TTG TTG TTG TCT GAG TTG GTA TGC G-3’(SEQ ID NO2)。見(jiàn)表1。
表1源于TGF-β1序列的帶型反義寡核苷酸的序列
*搜索TGF-β1 RiAS寡核苷酸的靶位點(diǎn)來(lái)尋找在二級(jí)結(jié)構(gòu)外的TGF-β1序列區(qū)域。以連續(xù)重疊的方式進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬。
有假設(shè)認(rèn)為T(mén)GF-β1反義寡核苷酸和顛倒寡核苷酸都形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由各個(gè)寡核苷酸兩端的互補(bǔ)序列形成莖。莖的5’端有單鏈序列5’-GATC-3’的4個(gè)堿基。將具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的兩個(gè)TGF-β1反義低聚體連接，通過(guò)該分子5’端存在的4個(gè)互補(bǔ)堿基序列形成帶型反義分子。加入1單位的T4 DNA連接酶(Takara Shuzo，Kyoto，Japan)，產(chǎn)生具有二聯(lián)體對(duì)稱的共價(jià)連接分子。因此，TGF-β1 RiAS由兩個(gè)環(huán)和一個(gè)中間莖組成。各個(gè)環(huán)含有TGF-β1反義序列。在15％變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳RiAS寡核苷酸，檢測(cè)它們對(duì)核酸外切酶III的抗性和在丙烯酰胺凝膠上的延遲。將兩個(gè)顛倒寡核苷酸也共價(jià)連接，形成帶型對(duì)照寡核苷酸，其表示SC RiAS以方便實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例3-通過(guò)脂質(zhì)體/tat肽復(fù)合體轉(zhuǎn)染RiAS向含有Opti-MEM懸液、tat肽和反義寡核苷酸的管中加入溶于100ul Opti-MEM(GibcoBRL，Rockville，MD)的4微克DOTAP/DOPE(Avanti，Alabaster，AL)。混合物溫育10min。在96孔板的每個(gè)孔中裝入10,000個(gè)細(xì)胞，用100μl寡核苷酸-tat-脂質(zhì)體的三重復(fù)合體處理。使用的反義寡核苷酸的量為0.1μg或0.3μg。37℃在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H4-IIE細(xì)胞5h。然后向細(xì)胞中加入i00μl Opti-MEM和20％FBS，37℃繼續(xù)培養(yǎng)16h后用于測(cè)試。
實(shí)施例4-RNA的分離和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)用TripureTM分離試劑(Roche，Indianapolis，IN)分離總RNA。收集細(xì)胞，且添加0.4ml的Tripure試劑、10μl糖原(1mg/ml)和80μl氯仿，獲得總RNA。用AccessTMRT-PCR試劑盒(Promega，Madison，WI)在單個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行RT-PCR。將RNA、PCR引物、禽成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶(5單位/μl)、Tfl DNA聚合酶(5單位/μl)、dNTP(10mM，1μl)和MGSO4(25mM，2.5μl)加到PCR管中，加入水，將最后體積調(diào)節(jié)到50μl。48℃合成cDNA 45min，在DNA熱循環(huán)儀(MJ Research，Watertown，MA)中擴(kuò)增30循環(huán)(94℃，30s；56℃，1min；68℃，2min)。在1.5％的瓊脂糖凝膠上證實(shí)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，用凝膠文件編制程序(Bio-Rad，Hercules，CA)進(jìn)行定量。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，與用熒光素-11-dUTP(Amersham，Arlington Heights，IL)標(biāo)記的內(nèi)部寡核苷酸雜交。用ECL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)信號(hào)。
實(shí)施例5-將FITC-寡核苷酸傳遞入腎中根據(jù)制造商的推薦，用LabelITTM熒光素核酸標(biāo)記試劑盒(Mirus，Madison，WI)使線性寡核苷酸標(biāo)記上熒光素。將含有FITC標(biāo)記的寡核苷酸復(fù)合體、tat多肽和DOTAP/DOPE的混合液通過(guò)輸尿管灌輸?shù)阶竽I中。24h后摘除左腎，液氮下將其包埋在Tissue-TekTMOCT化合物(Miles，Elkhart，IL)中。將灌輸固定腎的組織塊切成10um厚的冷凍切片，且封固在Poly-PrepTM玻片(Sigma，St.Louise，MO)上。用合成的MountantTM(Shandon，Pittsburgh，PA)封固該組織以用于顯維鏡觀察。用熒光顯微鏡觀察腎的冷凍切片，估算基因轉(zhuǎn)移的效率。
實(shí)施例6-用于檢測(cè)凋亡的TUNEL測(cè)試為了檢測(cè)UUO腎細(xì)胞中的片段DNA，用微注改進(jìn)的原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(Roche)進(jìn)行TUNEL測(cè)試。將玻片去石蠟，用溶于甲醇的0.3％H2O2處理30min以淬滅內(nèi)源過(guò)氧化酶活性。在10mM檸檬酸鹽緩沖液中煮沸水玻片10min，用PBS清洗，與帶有熒光素-dUTP的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)溫育1h。用終止緩沖液終止反應(yīng)。然后用PBS洗玻片，且與抗熒光素抗體連接的堿性磷酸酶室溫溫育30min，沖洗除去未結(jié)合的酶縱合物后，將玻片用NBT/BCIP(Sigma)顯色1-5min。在高功率顯微鏡(400×)下對(duì)陽(yáng)性腎管狀細(xì)胞計(jì)數(shù)。
實(shí)施例7-對(duì)TGF-β1的免疫染色連續(xù)地將低溫切片在4℃下與Bouin’s固定劑溫育5min，在-20℃下與丙酮溫育10min，與甲醇溫育15min，與2％低聚甲醛溫育2min，與4％低聚甲醛溫育4min，與7％乙醇溫育10min，然后與梯度乙醇再水合。用PBS洗組織切片，與含有0.3％H2O2的甲醇溫育30min以除去內(nèi)源過(guò)氧化酶活性。在含有10％PBS的PBS中進(jìn)行阻斷反應(yīng)1h，將組織切片面與溶于含有0.5％BSA和2％FCS的PBS抗TGF-β1抗體(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)4℃溫育過(guò)夜。第二天，將組織切片與抗兔HRP綴合物(Sigma)室溫溫育1h。組織切片與聯(lián)苯胺二胺(Sigma)溫育5min，與乙醇水合，用合成的MountantTM封固，然后顯微鏡觀察。
實(shí)施例8-統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，用斯圖頓特測(cè)試確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為P＜0.05就是顯著的。
實(shí)施例9-結(jié)果實(shí)施例9.1-TGF-β1的穩(wěn)定RiAS寡核苷酸的構(gòu)建信使RNA在細(xì)胞質(zhì)中形成二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。在其自身堿基中發(fā)生堿基配對(duì)并與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合使得mRNA的這些結(jié)構(gòu)復(fù)雜。因此，在設(shè)計(jì)反義寡核苷酸中選擇有效的靶位點(diǎn)被認(rèn)為是重要的步驟。我們以前已經(jīng)證明，以連續(xù)和重疊的方式模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)可以有效地用于沿著靶mRNA尋找反義靶序列(Moon等，J.Biol.Chem.275，4647-4653(2000)；Matsuda等，Mol.Biol.Cell 7，1095-1106(1996))。檢測(cè)TGF-β1 mRNA的整個(gè)長(zhǎng)度試圖尋找能容易地接近反義分子的反義靶位點(diǎn)。
上述TGF-β1特異性反義寡核苷酸形成在5’端具有GATC的突出端序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。兩個(gè)相同的AS寡核苷酸共價(jià)連接，形成帶型反義分子，稱為T(mén)GF-β1 RiAS(圖1)。如預(yù)見(jiàn)的那樣，與單聚體的線狀前體(圖2)相比，該二聚體TGF-β1 RiAS寡核苷酸在變性的聚丙烯酰胺凝膠上表現(xiàn)出延遲。該RiAS寡核苷酸對(duì)核酸外切酶III具有抗性，在聚丙烯酰胺凝膠上(第4泳道)形成主要帶(116mer)。相反，TGF-β1RiAS的線狀前體在2h內(nèi)被核酸外切酶III完全降解(第3泳道)。這些結(jié)果證明TGF-β1 RiAS具有帶型閉合結(jié)構(gòu)，沒(méi)有核酸外切酶可攻擊的開(kāi)口端。
實(shí)施例9.2-在體外由TGF-β1 RiAS導(dǎo)致的TGF-β1 mRNA的特異性減少我們接著測(cè)試了TGF-β1 RiAS是否能以序列特異性的方式有效地清除靶mRNA。將TGF-β1 RiAS與tat肽和脂質(zhì)體復(fù)合以提高轉(zhuǎn)染效率。用TGF-β1 RiAS或SC RiAS分別以0.1或0.3μg的濃度轉(zhuǎn)染H4-IIE大鼠肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)24h。從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離總RNA，用RT-PCR擴(kuò)增TGF-β1 mRNA以檢測(cè)TGF-β1 RiAS的反義活性。用TGF-β1RiAS處理過(guò)的H4-IIE細(xì)胞顯示在0.1μg時(shí)TGF-β1 mRNA減少了約30％，在0.3μg時(shí)減少70％以上(圖3A)。相反，當(dāng)用SC RiAS處理H4-IIE細(xì)胞時(shí)，TGF-β1的表達(dá)并沒(méi)有受到明顯的影響。如該圖的下圖所顯示，作為對(duì)照的GAPDH表達(dá)不受TGF-β1 RiAS處理的影響。用DNA寡核苷酸與擴(kuò)增的DNA片斷的中間雜交進(jìn)行的Southern印跡也證實(shí)了這些結(jié)果(圖3B)。
實(shí)施例9.3-RITC標(biāo)記的AS寡核苷酸有效傳遞入腎組織為了成功地獲得體內(nèi)的反義活性，需要使靶組織有效地吸收反義寡核苷酸。用FITC標(biāo)記TGF-β1 RiAS的58mer線性前體分子，且用于組織體內(nèi)吸收。用26-規(guī)格導(dǎo)管將10μg下ITC標(biāo)記的反義寡核苷酸通過(guò)輸尿管灌輸?shù)雷竽I中。在反義處理6h后收集腎，檢測(cè)細(xì)胞吸收。當(dāng)反義寡核苷酸與tat肽和脂質(zhì)體復(fù)合時(shí)，在管狀上皮細(xì)胞中觀察到強(qiáng)熒光信號(hào)(圖4A)。但是，當(dāng)單獨(dú)使用反義寡核苷酸而不使用載體脂質(zhì)體時(shí)，組織中未檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖4B)。作假處理的對(duì)照腎顯示沒(méi)有熒光信號(hào)。
實(shí)施例9.4-TGF-β1 RiAS使組織損傷明顯緩解在觀察到TGF-β1 mRNA在體外遭有效清除和FITC標(biāo)記的反義寡核苷酸在體內(nèi)被有效吸收后，在動(dòng)物模型中測(cè)試了TGF-β1 RiAS預(yù)防腎損傷的效果。單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)迅速產(chǎn)生腎損傷，UUO腎是建立的適于臨床的動(dòng)物模型系統(tǒng)。
表2.
用TGF-β1 mRNA處理后，患UUO的左腎的重量比率的變化(腎重/體重)
將6只SD大鼠的左側(cè)近端輸尿管結(jié)扎，接著通過(guò)該近端輸尿管灌輸TGF-β1RiAS，在第5天，收采集左腎和右腎。將它們稱重并檢查形態(tài)。腎重表達(dá)為腎重/體重的百分比，一般對(duì)照為0.47％±0.03，UUO腎為0.99％±0.1.在UUO步驟后腎重有顯著增加。當(dāng)用TGF-β1 RiAS通過(guò)輸尿管注射處理UUO腎時(shí)，腎重/體重明顯地降到0.68％±0.09(P＜0.005)，但僅用PBS處理則為0.95％±0.08，用顛倒RiAS處理為1.07％±0.12。將6只大鼠的結(jié)果取平均值±SD。在TGF-β1 RiAS+UUO組對(duì)僅UUO、PBS+UUO和SC RiAS+UUO組中，#P＜0.005(表2)。在各組間，對(duì)照腎沒(méi)有顯示有意義的差別。用TGF-β1 RiAS處理的腎比僅用UUO或UUO加其它對(duì)照處理的腎顯現(xiàn)出小得多的腫脹(圖5)。而且，RiAS處理大鼠的UUO腎的縱切面顯現(xiàn)出腎結(jié)構(gòu)的總體保存，但對(duì)照組的UUO腎顯示在腎的髓和乳頭(medullar andpapillary)部分中，腎實(shí)質(zhì)的失。
實(shí)施例9.5-通過(guò)免疫組織化學(xué)和組織學(xué)分析顯示對(duì)腎微結(jié)構(gòu)的保存我們檢測(cè)了序列特異性反義活性和腎微觀結(jié)構(gòu)的改變，且觀察到TGF-β1 RiAS明顯改善對(duì)腎的總體損傷。從用TGF-β1 RiAS、SC RiAS處理的各組和假處理的對(duì)照組中各取兩只有代表性大鼠，從中采集腎。進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析來(lái)檢測(cè)TGF-β1 RiAS處理是否能使UUO腎中的TGF-β1表達(dá)降低(圖6A-6E)。TGF-β1的免疫組織化學(xué)分析顯示在受阻腎中有陽(yáng)性棕色染色，這表明在病變組織中TGF-β1的表達(dá)提高。在用PBS和SC RiAS處理的UUO腎中同樣檢測(cè)到TGF-β1蛋白的陽(yáng)性染色。相反，發(fā)現(xiàn)在用TGF-β1 RiAS處理后UUO腎中TGF-β1減少很多。
UUO腎的明顯物理特征是小管萎縮和擴(kuò)張，被認(rèn)為是受到TGF-β1表達(dá)的介導(dǎo)。用光學(xué)顯微鏡觀察UUO腎的PAS染色的腎切片，發(fā)現(xiàn)皮層和髓的間隙區(qū)以快速和進(jìn)行性方式增加。隨后大量的腎小管擅長(zhǎng)，在一些小管中上皮細(xì)胞變平(圖7A-7E)。用PBS、SC RiAS或假處理的對(duì)照處理UUO對(duì)照腎的切片表現(xiàn)出大量的小管萎縮和擴(kuò)張，用TGF-β1 RiAS處理的組表現(xiàn)出萎縮和擴(kuò)張顯著減少。期望的那樣，假處理鼠的對(duì)照腎的切片表現(xiàn)正常。
實(shí)施例9.6-用原位TUNEL測(cè)試檢測(cè)凋亡細(xì)胞死亡的減少因?yàn)閁UO腎表現(xiàn)出球萎縮和腎小管擴(kuò)張，所以我們檢測(cè)腎小管細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。當(dāng)用TGF-β1 RiAS處理UUO腎時(shí)，發(fā)現(xiàn)與其它對(duì)照處理相比，腎小管細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞要少得多(圖8A-8E)。然而，正常腎顯示凋亡陽(yáng)性細(xì)胞為3±3.3個(gè)細(xì)胞/顯微視野，假處理的腎顯示凋亡280.9±24.6個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞(400×)。用TGF-β1RiAS處理使小管凋亡減少到21.3±12.1個(gè)細(xì)胞/顯微視野(P＜0.001)。相反，用SCRiAS處理的UUO組小管凋亡升高到236.8±29.6個(gè)細(xì)胞，用PBS處理則升高到260.4±41.3個(gè)細(xì)胞。
在本申請(qǐng)中所有的參考文獻(xiàn)全文納入作為參考。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解或能夠明白，僅僅采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法就有許多等同于本文特別描述的發(fā)明的具體實(shí)施方案。這些等同包含在權(quán)利要求所覆蓋的范圍之內(nèi)。
序列表<110>維爾精股份有限公司(WELGENE，INC.)<120>TGF-β特異性共價(jià)閉合反義分子<130>57354-10CN<150>PCT/IB02/05685<151>2002-12-30<150>KR 10-2001-0086765<151>2001-12-28<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>58<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctg 58<210>2<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>顛倒序列<400>2gatccgctgt cgtgctggtc ttgagttaat tcgttgttgt tgtctgagtt ggtatgcg 58<210>3<211>116<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>對(duì)TGF-β1特異的帶型反義分子<400>3gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctgga 60tccaggactg tgtgtgatgt ctttggtttt gtcatagatt gcgttgttgc ggcctg 116<210>4<211>13<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln1 5 10
權(quán)利要求
1.一種純的共價(jià)閉合反義分子，其特異性地抑制TGF-β的表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的共價(jià)閉合反義分子，其特征是，該分子至少有兩個(gè)由莖結(jié)構(gòu)分開(kāi)的環(huán)，其中至少一個(gè)環(huán)含有抑制TGF-β表達(dá)的靶反義序列。
3.如權(quán)利要求2所述的共價(jià)閉合反義分子，其特征在于，所述的TGF-β是TGF-β1。
4.如權(quán)利要求3所述的共價(jià)閉合反義分子，其特征在于，其含有與SEQ ID NO1大體相似的序列。
5.一種制備如權(quán)利要求2所述的化合物的方法，該方法包括將至少兩個(gè)線性反義分子與莖環(huán)結(jié)構(gòu)相連，該莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有彼此互補(bǔ)而形成共價(jià)閉合反義分子的5’或3’末端。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的線性反義分子可以特異于相同的靶核酸或不同的核酸。
7.一種抑制TGF-β表達(dá)的方法，該方法包括將含有TGF-β表達(dá)細(xì)胞的樣品與如權(quán)利要求1所述的共價(jià)閉合反義分子接觸。
8.一種治療由TGF-β表達(dá)引起的疾病的方法，該方法包括將如權(quán)利要求1所述的共價(jià)閉合反義分子施用給需要的患者。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的疾病是纖維化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纖維化是在腎中。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纖維化是小管間質(zhì)性纖維化。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纖維化是在肝中。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纖維化是在肺中。
14.一種治療單側(cè)輸尿管阻塞的方法，該方法包括用將如權(quán)利要求1所述的共價(jià)閉合反義分子的組合物施用給需要的患者。
15.一種預(yù)防在損傷位點(diǎn)積累細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的方法，該方法包括將如權(quán)利要求1所述的共價(jià)閉合反義分子施用給需要的患者。
16.一種含有共價(jià)閉合反義分子、tat或tat樣肽和載體組分的組合物。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述的載體是脂質(zhì)體。
18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述的共價(jià)閉合反義分子靶向TGF-β。
19.一種傳遞共價(jià)閉合反義分子到細(xì)胞的方法，該方法包括用共價(jià)閉合反義分子、tat或tat樣肽和載體組分與細(xì)胞接觸。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，在接觸細(xì)胞之前將所述的tat或tat樣肽和載體組分混合。
全文摘要
本申請(qǐng)描述了特異性地抑制TGF－β表達(dá)的純的共價(jià)閉合反義分子。本申請(qǐng)還描述了含有共價(jià)閉合反義分子(相對(duì)于任何序列)和tat或tat樣肽的組合物，用于反義分子的傳遞。
文檔編號(hào)A61P13/00GK1622994SQ02828394
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者樸鐘九, 文翊宰, 崔英國(guó), 樸官奎 申請(qǐng)人:維爾精股份有限公司