專利名稱：預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜疾病預(yù)防與控制技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因工程技術(shù)的應(yīng)用，涉及制備產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌K88ac菌毛抗原和特異菌毛抗原卵黃抗體，它們的制備方法以及卵黃抗體用于預(yù)防仔豬腹瀉，與仔豬的營養(yǎng)免疫有關(guān)。
背景技術(shù)：
大腸桿菌既是人和動(dòng)物腸道中的正常寄居菌，又能夠引起疾病。在規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)中，由大腸桿菌所引起的以仔豬腹瀉為主要癥狀的胃腸疾病所造成的經(jīng)濟(jì)損失不容忽視。據(jù)報(bào)道，大腸桿菌引起的仔豬腹瀉的發(fā)病率和死亡率分別占我國整個(gè)仔豬瀉痢發(fā)病率和死亡率的56.2％和24.7％，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失(施啟順，豬腸毒性大腸桿菌(ETEC)病抗病育種研究.國外畜牧科技，1999，26(4)51～54)。而腸道產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起幼畜腹瀉為主要癥狀的胃腸疾病主要病原菌(Hampson.D.L.，Escherichia coil in domestic animals and humans.CAB.InternationalWallingford UK，pp629～647，1994)。我國豬、牛、羊等幼畜ETEC性腹瀉發(fā)生的比例分別為35％、26％和17％，死亡率為10％～30％(楊正時(shí).，動(dòng)物病原性大腸桿菌與大腸桿菌病。中國獸醫(yī)科技，1987(6)25～29)。豬源ETEC定居因子(colonization factor)或粘附素(adhesion)主要包括K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)和F41，其中K88是主要致病因子。K88具有三種變異體K88ab、K88ac、K88ad。從武漢及其周邊地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)采集的腹瀉仔豬糞樣，通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，大腸桿菌K88占總數(shù)的9.3％，且均為K88ac變異體。
Yokoyama等首次進(jìn)行用卵黃抗體控制仔豬大腸桿菌病，他們將提純的ETEC宿主特異性菌K88、K99和987P制成纖毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫產(chǎn)蛋母雞，抗體水平達(dá)到高效價(jià)后，收集雞蛋，分離和噴霧干燥卵黃抗體，對(duì)感染不同ETEC菌株的未吃乳初生仔豬進(jìn)行卵黃抗體治療，結(jié)果顯示所有仔豬接受不同菌株感染后12小時(shí)內(nèi)均發(fā)生腹瀉；用效價(jià)為625和2500的抗體治療仔豬全部存活，而對(duì)照組仔豬死亡率超過80％(Passive protective effect of chicken egg-yolk immunoglobulins against experimentalenterotoxigenic Escherichia coil infection in neonatal pigs.Infect Immun，1992，60998～1007)。Erhard等(Prophylactic effect of specific egg yolk antibodies in diarrhea of weaned piglets caused by Escherichia coil K88.J Vet Med A，1996，43217～223)、Imberechts等(chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae ofEscherichia coil inhibit shedding of F18 positive E.coli by experimentally infected pigs.Vet.Microbiol.1997，54329-341)和Zuniga等(Reduced intestinal colonization with F18-positive Escherichia coil in weaned pigsfed chicken egg antibody against the fimbriae.FEMS.Immunology and Medical Microbiology，1997，18153-161)都進(jìn)行了相關(guān)的研究均得到了類似的結(jié)論。胡子信等(雞抗豬大腸桿菌卵黃抗體的研制，中國畜禽傳染病，1994，226-27)用K88、K99、987P三價(jià)滅活苗試制了四批雞抗豬ETEC卵黃抗體，在北京近郊五個(gè)縣9個(gè)豬場(chǎng)近900頭仔豬中進(jìn)行防治試驗(yàn)。對(duì)于確診為大腸桿菌引起的仔豬黃痢，白痢的治療和預(yù)防有效率為100％(雞抗豬大腸桿菌卵黃抗體的研制，中國畜禽傳染病，1994，226-27)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制一種特異性卵黃抗體，它能預(yù)防由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac引起的仔豬腹瀉。該抗體的制備具有產(chǎn)量高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)，是一種綠色的抗生素替代品。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體，是將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC)K88ac菌毛黏附素蛋白與弗氏佐劑混合制成特異免疫源，用該免疫源免疫健康開產(chǎn)母雞，并收集被免疫的雞所產(chǎn)的雞蛋，所述雞蛋蛋黃中含有預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
制備預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體的方法，其中制備特異免疫源的方法采用TSB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac菌株，18小時(shí)后，用60℃加熱-冰浴勻漿法及等電點(diǎn)連續(xù)沉淀法提取和純化菌毛黏附素蛋白，然后與弗氏佐劑混合而成。
所述的從特異免疫源免疫的健康產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)之雞蛋中，分離蛋黃，噴霧干燥制成卵黃粉，該雞蛋蛋黃中含有所述的能夠預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
所述的免疫產(chǎn)蛋母雞的免疫步驟是在健康開產(chǎn)蛋雞胸肌兩側(cè)分別注射500μl濃度為400μg/ml的特異免疫原，2周后胸肌兩側(cè)再分別注射500μl濃度為600μg/ml的特異免疫原。
一種預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體，它被作為抗生素的替代品應(yīng)用于飼料，預(yù)防由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac引起的仔豬腹瀉。
本發(fā)明的細(xì)節(jié)由下列步驟所示一、K88ac菌毛抗原的制備1.培養(yǎng)K88ac菌株、測(cè)定菌毛表達(dá)量產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac菌株(C83715(O8K88ac)購自中國獸藥監(jiān)察所。菌株復(fù)活后，以1％的接種量分別接種于裝有300ml TSB培養(yǎng)基(即胰酶消化大豆肉湯培養(yǎng)基，參見房海主編，《大腸埃希氏菌》，河北科學(xué)技術(shù)出版社，1997，)培養(yǎng)基成分如下胰酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀3.27g、葡萄糖2.5g，pH7.4，雙蒸餾水定溶至1000ml的三角瓶中，于37℃震蕩培養(yǎng)。每隔2小時(shí)取出3ml樣品于5倍稀釋后，在420nm處比色，記錄吸光值。培養(yǎng)18小時(shí)后，離心收取菌液，血球計(jì)數(shù)板顯微計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為50億菌/毫升。采用甘露糖抵抗血凝反應(yīng)(Mannose-resistant hemagglutination，MRHA)檢查黏附素表達(dá)情況。MRHA方法按房海主編，《大腸埃希氏菌》，河北科學(xué)技術(shù)出版社，1997，409～429報(bào)道的方法測(cè)定菌毛表達(dá)量，要求每1L菌液提取純黏附素蛋白1.0mg以上。
2.產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac菌毛抗原的提取和純化選擇復(fù)活的甘露糖抵抗血凝反應(yīng)陽性K88ac菌株按0.5％的接種量接種于裝有500ml TSB(胰酶消化大豆肉湯)培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)后，再按1％的接種量接種于裝有2500mlTSB培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)。收集菌液，4℃離心(6,000×g)15分鐘，棄去上清，用適量PBS(磷酸緩沖液)懸浮菌苔。將細(xì)菌懸液置60℃水浴鍋內(nèi)孵化30分鐘，間斷搖晃懸液；然后將菌液置于冰浴中低速勻漿5分鐘；在4℃下以14000×g離心15分鐘除去菌體，收集無菌體的上清液。
上清液經(jīng)0.4um的濾膜過濾，在濾液中加入2.5％的檸檬酸調(diào)整pH值至4.0，在4℃下放置2小時(shí)或過夜，然后在4℃下以14000×g離心15分鐘取沉淀，重新懸浮于PBS1(磷酸緩沖液1)緩沖液中；上述步驟重復(fù)2-3次，最后將沉淀物溶解于1ml 0.1M PBS2(磷酸緩沖液2)中，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)方法鑒定蛋白質(zhì)純度。用總蛋白測(cè)定試劑盒(購自上海科欣生物技術(shù)研究所)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。純化后-20℃保存。
二、卵黃抗體的制備1.K88ac菌毛抗原的提取用接種環(huán)挑取K88ac MRHA陽性菌落接種于裝有10mlTSB培養(yǎng)基的50ml三角瓶，37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)；分別取1ml培養(yǎng)液接種于6個(gè)裝有2500mlTSB培養(yǎng)基的5000ml三角瓶37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)；重復(fù)批次培養(yǎng)，收集菌液，按Jin等(In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88to pigletintestinal mucus by egg-yolk antibodies.FEMS Immunology and Medical Microbiology，1998 21(4)313-321)報(bào)道改進(jìn)的方法提取和純化K88黏附素。用總蛋白測(cè)定試劑盒(購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
2.無菌檢驗(yàn)取上述提取菌毛液0.5ml接種于營養(yǎng)肉湯中37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。無細(xì)菌生長(zhǎng)的K88ac菌毛懸液用于以下油乳疫苗的制備。
3.油乳疫苗的制備K88ac菌毛懸液與等體積的弗氏佐劑(弗氏完全佐劑購自Sigma公司，弗氏不完全佐劑購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)充分混合乳化成蛋白質(zhì)濃度為400μg/ml和600μg/ml的油包水型油乳疫苗。
4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和免疫在20周齡開產(chǎn)蛋雞胸肌兩側(cè)分別注射500μl濃度為400μg/ml的免疫原，22周齡胸肌兩側(cè)再分別注射500μl濃度為600μg/ml的免疫原。二免后一周開始收集雞蛋。
5.卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定采用間接ELISA方法100μl K88ac黏附素(用包被液稀釋成15μg/ml)包被96孔聚乙烯板，4℃過夜(18h-24h)，棄去，用洗滌液沖洗3次，然后用150μl的稀釋液37℃包被1h，棄去，如前洗滌3次，每孔加入100μl卵黃液(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160……用PBSII稀釋)37℃包被1h，棄去，如前洗滌5次，每孔加入100μl鼠抗雞IgG辣根過氧化物酶(1∶15,000，洗滌液稀釋)25℃包被30min，棄去，如前洗滌5次，最后每孔加入100μl底物液，顯色后用50μl終止液終止反應(yīng)。以顏色反應(yīng)深于對(duì)照組判為陽性，并以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度為抗體效價(jià)。
三、卵黃抗體應(yīng)用效果的評(píng)價(jià)1.卵黃抗體體外抑制ETEC(產(chǎn)腸毒素大腸桿菌)K88ac黏附試驗(yàn)□空腸上皮細(xì)胞的準(zhǔn)備屠宰后30分鐘內(nèi)取約50cm空腸，用37℃生理鹽水沖洗數(shù)次去除腸腔內(nèi)容物，再用含1Mm二硫蘇糖醇的生理鹽水沖洗2次，然后灌入pH7.4的檸檬酸鈉緩沖液(Nacl96mM，Kcl 1.5mM，KH2PO48mM，Na2HPO45.6mM，檸檬酸鈉27mM)，在38℃下溫育10分鐘，再用pH7.4的EDTA溶液(1.5mM EDTA+PBS液)在38℃下溫育15分鐘，將收集的細(xì)胞離心5分鐘(900g)使細(xì)胞沉淀。再用pH7.4的PBS緩沖液(Nacl 130mM，Kcl 8.1mM，KH2PO41.5mM，Na2HPO48.1mM)沖洗兩次，最后將收集的細(xì)胞懸浮在PBS液(含0.2％葡萄糖，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素)中。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml。
□細(xì)菌培養(yǎng)物的制備細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)離心沉淀，用PBS洗滌兩次，沉淀物懸浮于PBS中，調(diào)節(jié)菌體濃度約為109個(gè)/ml。
□黏附試驗(yàn)1ml上皮細(xì)胞懸液+1ml菌體細(xì)胞懸液，37℃作用30分鐘，取一小滴制成壓滴標(biāo)本片，于顯微鏡下觀察。記錄20個(gè)上皮細(xì)胞上吸附的總菌數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)，上述試驗(yàn)重復(fù)三次。
□卵黃抗體體外抑制黏附試驗(yàn)將1ml菌液與1ml卵黃抗體混合(效價(jià)11280)，37℃作用30分鐘，再加入1ml上皮細(xì)胞懸液，37℃作用30分鐘，如前觀察，記錄結(jié)果，上述試驗(yàn)重復(fù)三次。
2.預(yù)防斷奶仔豬腹瀉試驗(yàn)選擇30±2日齡斷奶仔豬120頭，按血緣、體重、胎次、日齡等相對(duì)一致的原則隨機(jī)分成4組，每組30頭。日糧中分別給予0％、0.5％、1％、2％的噴霧干燥卵黃粉。試驗(yàn)結(jié)束后添加1％的卵黃抗體粉雖然對(duì)仔豬的生長(zhǎng)性能有較顯著影響(p＝0.059)，但顯著降低了料肉比和腹瀉率(p＜0.05)，同時(shí)對(duì)仔豬的后期生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。


圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制備產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac菌毛抗原一、材料與方法1.1.菌株K88ac菌株購自中國農(nóng)科院獸藥監(jiān)察所1.2.培養(yǎng)基和試劑TSB培養(yǎng)基(pH7.4)胰酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀3.27g、葡萄糖2.5g。雙蒸餾水定溶至1000ml；緩沖液PBS1(pH 7.2)NaCL 10g、KH2PO40.25g、Na2HPO412H2O 3.58g、KCL 0.25g，雙蒸餾水定溶至1000ml；0.1M緩沖液PBS2(pH7.2)NaH2PO42H2O 4.37g、Na2HPO412H2O 25.81g，雙蒸餾水定溶至1000ml；1.3產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac菌株菌毛黏附素表達(dá)效果的測(cè)定菌株復(fù)活后，以1％的接種量分別接種于裝有300ml TSB培養(yǎng)基的1000ml三角瓶，于37℃震蕩培養(yǎng)。每隔2小時(shí)取出3ml樣品于5倍稀釋后，在420nm處比色，記錄吸光值。培養(yǎng)18小時(shí)后，離心收取菌液，血球計(jì)數(shù)板顯微計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為50億菌/毫升。采用甘露糖抵抗血凝反應(yīng)(Mannose-resistanthemagglutination，MRHA)檢查黏附素表達(dá)情況。MRHA方法按房海(大腸埃希氏菌。河北科學(xué)技術(shù)出版社，1997，409～429)報(bào)道方法測(cè)定菌毛表達(dá)量，要求每1L菌液提取純黏附素蛋白1.0mg以上。
2.產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac菌毛抗原的提取和純化選擇復(fù)活的甘露糖抵抗血凝反應(yīng)陽性K88ac菌株按0.5％的接種量接種于裝有500mlTSB培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)后，再按1％的接種量接種于裝有2500mlTSB培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)。收集菌液，4℃離心(6,000×g)15分鐘，棄去上清，用適量PBS懸浮菌苔。將細(xì)菌懸液置60℃水浴鍋內(nèi)孵化30分鐘，間斷搖晃懸液；然后將菌液置于冰浴中低速勻漿5分鐘；在4℃下以14000×g離心15分鐘除去菌體，收集無菌體的上清液。
上清液經(jīng)0.4um的濾膜過濾，在濾液中加入2.5％的檸檬酸調(diào)整pH值至4.0，在4℃下放置2小時(shí)或過夜，然后在4℃下以14000×g離心15分鐘取沉淀，重新懸浮于PBS1緩沖液中；上述步驟重復(fù)2-3次，最后沉淀物溶解于1ml 0.1M PBS2中，用SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)純度。雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，-20℃保存。
二、實(shí)施效果在振蕩培養(yǎng)條件下，K88ac在接種后4-6小時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16-20小時(shí)結(jié)束；培養(yǎng)18小時(shí)后收集的菌體其菌毛血凝效價(jià)為26。
采用TSB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，用60℃加熱與冰浴勻漿法及等電點(diǎn)連續(xù)沉淀法提取、純化菌毛蛋白，從2.5毫升的菌液中提取純化的菌毛蛋白3.75毫克，平均一毫升菌液收獲純菌毛蛋白1.5毫克。
實(shí)施例2制備抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac特異菌毛抗原卵黃抗體1.1試劑弗氏完全佐劑購自Sigma公司弗氏不完全佐劑購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心0.02 MPBS(pH7.4)Nacl8g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、Kcl 0.2g，雙蒸水定溶至500ml；
0.01 MPBS(pH7.4)Nacl8g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O2.9g、Kcl0.2g，雙蒸水定溶至1000ml；包被液0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6，NaHCO32.93g、Na2CO31.95g，雙蒸水定溶至1000ml)；洗滌液(PBS-T)含0.05％吐溫-20的0.01MPBS；稀釋液(PBS-BSA含3％牛血清白蛋白的0.01 MPBS；底物液鄰苯二胺40mg，溶于pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(0.2MNa2HPO4(28.4g/l)51.4ml，0.1M檸檬酸(19.2g/l)48.6ml，加雙蒸餾水100ml混勻)100ml，在加入30％H2O20.15ml即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。
終止液2M H2SO4溶液(濃硫酸22.2ml，蒸餾水177.8ml，混勻即可)1.2K88ac菌毛抗原的提取用接種環(huán)挑取K88acMRHA陽性菌落接種于裝有10mlTSB培養(yǎng)基的50ml三角瓶，37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)；分別取1ml培養(yǎng)液接種于6個(gè)裝有2500mlTSB培養(yǎng)基的5000ml三角瓶37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)；重復(fù)批次培養(yǎng)，收集菌液，按Jin等(In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88to pigletintestinal mucus by egg-yolk antibodies.FEMS Immunology and Medical Microbiology，1998 21(4)313-321)報(bào)道改進(jìn)的方法提取和純化K88黏附素。用總蛋白測(cè)定試劑盒(購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
1.3無菌檢驗(yàn)取上述提取菌毛液0.5ml接種于營養(yǎng)肉湯中37℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。無細(xì)菌生長(zhǎng)的K88ac菌毛懸液進(jìn)行油乳疫苗的制備1.4油乳疫苗的制備K88ac菌毛懸液與等體積的弗氏佐劑(弗氏完全佐劑購自Sigma公司，弗氏不完全佐劑購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)充分混合乳化成蛋白質(zhì)濃度為400μg/ml和600μg/ml的油包水型油乳疫苗。
1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和免疫20周齡開產(chǎn)蛋雞胸肌兩側(cè)分別注射500μl濃度為400μg/ml的免疫原，22周齡胸肌兩側(cè)再分別注射500μl濃度為600μg/ml的免疫原。二免后一周開始收集雞蛋。
1.6卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定采用間接ELISA方法100ulK88ac黏附素(用包被液稀釋成15μg/ml)包被96孔聚乙烯板，4℃過夜(18h-24h)，棄去，用洗滌液沖洗3次，然后用150μl的稀釋液37℃包被1h，棄去，如前洗滌3次，每孔加入100μl卵黃液，用PBSII稀釋(稀釋倍數(shù)1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160……)，37℃包被1h，棄去，如前洗滌5次，每孔加入100μl鼠抗雞IgG辣根過氧化物酶(1∶15,000，洗滌液稀釋)25℃包被30min，棄去，如前洗滌5次，最后每孔加入100μl底物液，顯色后用50μl終止液終止反應(yīng)。以顏色反應(yīng)深于對(duì)照組判為陽性，并以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度為抗體效價(jià)。
實(shí)施例3卵黃抗體應(yīng)用效果的評(píng)價(jià)一、材料與方法1.卵黃抗體體外抑制ETEC K88ac黏附試驗(yàn)
1.1空腸上皮細(xì)胞的準(zhǔn)備屠宰后30分鐘內(nèi)取約50cm空腸，用37℃生理鹽水沖洗數(shù)次去除腸腔內(nèi)容物，再用含1Mm二硫蘇糖醇(DTT)的生理鹽水沖洗2次，然后灌入pH7.4的檸檬酸鈉緩沖液(Nacl 96mM，Kcl1.5mM，KH2PO48mM，Na2HPO45.6mM，檸檬酸鈉27mM)，在38℃下溫育10分鐘，再用pH7.4的EDTA溶液(1.5mM EDTA+PBS液)在38℃下溫育15分鐘，將收集的細(xì)胞離心5分鐘(900g)使細(xì)胞沉淀。再用pH7.4的PBS緩沖液(Nacl 130mM，Kcl 8.1mM，KH2PO41.5mM，Na2HPO48.1mM)沖洗兩次，最后將收集的細(xì)胞懸浮在PBS液(含0.2％葡萄糖，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素)中。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml1.2細(xì)菌培養(yǎng)物的制備細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)離心沉淀，用PBS洗滌兩次，沉淀物懸浮于PBS中，調(diào)節(jié)菌體濃度約為109個(gè)/ml1.3黏附試驗(yàn)1ml上皮細(xì)胞懸液+1ml菌體細(xì)胞懸液，37℃作用30分鐘，取一小滴制成壓滴標(biāo)本片，于顯微鏡下觀察。記錄20個(gè)上皮細(xì)胞上吸附的總菌數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)，上述試驗(yàn)重復(fù)三次。
1.4卵黃抗體體外抑制黏附試驗(yàn)將1ml菌液與1ml卵黃抗體混合(效價(jià)11280)，37℃作用30分鐘，再加入1ml上皮細(xì)胞懸液，37℃作用30分鐘，如前觀察，記錄結(jié)果，上述試驗(yàn)重復(fù)三次。
3.預(yù)防斷奶仔豬腹瀉試驗(yàn)4.2.1試豬的選擇和分組選擇30±2日齡斷奶仔豬120頭，按血緣、體重、胎次、日齡等相對(duì)一致的原則隨機(jī)分成4組，每組30頭，每組分三欄飼養(yǎng)。
2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)日糧組成試驗(yàn)采用單因子設(shè)計(jì)。對(duì)照組用商品日糧，在基礎(chǔ)配方中分別添加0.5％、1％、2％的噴霧干燥卵黃粉形成試驗(yàn)一組、試驗(yàn)二組和三組的試驗(yàn)日糧。
2.3飼養(yǎng)管理飲水器自由飲水，干粉料自由采食，日喂4次，次日晨稱剩余料，按欄統(tǒng)計(jì)料量。閹割、防疫注射等其他管理照常規(guī)進(jìn)行。病程超過3天，程度嚴(yán)重不能繼續(xù)參加試驗(yàn)的豬及時(shí)退出試驗(yàn)，并扣除其耗料量。
2.4稱重仔豬斷奶重作為入試重，斷奶后14天和21天，逐頭空腹稱重1次，共稱重3次。
2.5腹瀉情況每日晨記錄仔豬糞便狀況，按干、軟、稀、水樣分成0、1、2、3四級(jí)記錄。統(tǒng)計(jì)時(shí)干便及軟便為正常，稀便和水樣便記為腹瀉。
2.6.數(shù)據(jù)處理和分析對(duì)平均日增重、采食量和料肉比進(jìn)行方差分析，腹瀉率用卡方檢驗(yàn)二、結(jié)果與分析1卵黃抗體對(duì)細(xì)菌體外細(xì)胞黏附的抑制作用從表1可以看出在K88ac體外細(xì)胞黏附試驗(yàn)中，平均每個(gè)上皮細(xì)胞黏附16.4個(gè)K88ac；在卵黃抗體抑制黏附試驗(yàn)中，抗體效價(jià)分別為640和1280的卵黃抗體較對(duì)照組均極顯著抑制了K88ac對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附作用，平均每個(gè)上皮細(xì)胞僅黏附8.5和2.4個(gè)細(xì)菌(p＜0.01)，二者之間也存在極顯著差異(p＜0.01)?？贵w效價(jià)為320的抗體組相對(duì)對(duì)照組有一定抑制細(xì)菌粘附作用，但差異不顯著(p＝0.15)。
表1卵黃抗體對(duì)細(xì)菌體外細(xì)胞黏附的抑制作用抗K88ac抗體滴度 黏附細(xì)菌數(shù)0 16.4±9.6aA32013.7±7.4aAB6408.5±5.7bB1280 2.4±1.1C2卵黃抗體對(duì)斷奶仔豬腹瀉情況的影響從表2可以看出，試驗(yàn)二組和試驗(yàn)三組腹瀉頭數(shù)和頭次數(shù)均低于對(duì)照組和試驗(yàn)一組；相對(duì)對(duì)照組和試驗(yàn)一組，試驗(yàn)二組和試驗(yàn)三組的腹瀉率極顯著降低(p＜0.01)，對(duì)照組和試驗(yàn)一組，試驗(yàn)二組和試驗(yàn)三組之間腹瀉率差異不顯著(p＞0.05)。
表2試驗(yàn)期各組腹瀉情況組別豬頭數(shù)腹瀉頭次腹瀉率對(duì)照組28 54(22*)13.8％A1 28 48(21) 12.2％A2 28 20(14) 5.1％B3 28 26(14) 6.7％B*括號(hào)內(nèi)數(shù)字為發(fā)生過腹瀉的仔豬數(shù)3卵黃抗體對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響3.1.卵黃抗體對(duì)斷奶仔豬平均日增重的影響從表3中可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期中，各組平均日增重均沒有顯著差異；但試驗(yàn)后期試驗(yàn)二組相對(duì)對(duì)照組、試驗(yàn)一組和試驗(yàn)三組平均日增重均有一定的改善作用(p＝0.078，p＝0.059，p＝0.132)。
表3試驗(yàn)期各組平均日增重(g/d)斷奶后階段組別豬頭數(shù)前期后期全期對(duì)照 28306.2±62.4 469.2±108.4385.4±56.51 28290.8±50.6 466.4±92.2 378.6±49.12 28295.1±73.9 522.1±80.4 409.5±61.23 28291.6±51.4 476.9±105.6384.3±67.33.2卵黃抗體對(duì)斷奶仔豬平均采食量的影響從表4中可以看出，無論是試驗(yàn)前期、后期或全期，各組平均采食量均無顯著差異，但隨著卵黃抗體添加量的增加，平均采食量有遞減趨勢(shì)。在試驗(yàn)后期，試驗(yàn)三組相對(duì)對(duì)照組和試驗(yàn)一組有明顯減少(p＝0.071，p＝0.195)。
表4試驗(yàn)期各組平均采食量(g/d)斷奶后階段組別豬頭數(shù)前期 后期 全期對(duì)照28 35.5±45.8 873.1±78.3646.9±53.61 28 433.0±50.3845.5±44.9639.3±47.62 28 429.1±38.8797.3±18.8618.7±22.33 28 411.0±11.7787.1±41.4597.5±22.42.3.卵黃抗體對(duì)斷奶仔豬料肉比的影響從表5中可以看出，試驗(yàn)各組試驗(yàn)前期(斷奶后兩周)料肉比無顯著差異；但從試驗(yàn)后期和試驗(yàn)全期來看，試驗(yàn)二組和試驗(yàn)三組相對(duì)其他兩組料肉比均均顯著降低(其中試驗(yàn)二組達(dá)到極顯著水平(p＜0.01)。
表5試驗(yàn)期各組料肉比斷奶后階段組別豬頭數(shù)前期 后期全期對(duì)照28 1.40±0.071.82±0.04aA1.70±0.02A1 28 1.48±0.061.80±0.05aAC 1.71±0.05A2 28 1.40±0.151.54±0.05bB1.51±0.03aB3 28 1.47±0.171.68±0.06bC1.60±0.05bB
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體，其特征是將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC)K88ac菌毛黏附素蛋白與弗氏佐劑混合制成特異免疫源，用該免疫源免疫健康開產(chǎn)母雞，并收集被免疫的雞所產(chǎn)的雞蛋，所述雞蛋蛋黃中含有預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
2.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1產(chǎn)品的方法，其特征在于制備特異免疫源的方法采用TSB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac菌株，18小時(shí)后，用60℃加熱-冰浴勻漿法及等電點(diǎn)連續(xù)沉淀法提取和純化菌毛黏附素蛋白，然后與弗氏佐劑混合而成。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的從特異免疫源免疫的健康產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)之雞蛋中，分離蛋黃，噴霧干燥制成卵黃粉，該雞蛋蛋黃中含有所述的能夠預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的免疫產(chǎn)蛋母雞的免疫步驟是在健康開產(chǎn)蛋雞胸肌兩側(cè)分別注射500μl濃度為400μg/ml的特異免疫原，2周后胸肌兩側(cè)再分別注射500μl濃度為600μg/ml的特異免疫原。
5.一種預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體其特征在于，作為抗生素的替代品應(yīng)用于飼料，預(yù)防由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac引起的仔豬腹瀉。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體及其制備方法與應(yīng)用。采用TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株和純化獲得特異菌毛黏附素蛋白，與弗氏佐劑混合制成免疫源，將該免疫原免疫產(chǎn)蛋雞，獲得了預(yù)防仔豬腹瀉的K88ac特異性卵黃抗體。使用本發(fā)明的卵黃抗體能極顯著地抑制了產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附作用(p＜0.01)；添加1％的卵黃抗體粉能顯著地降低了仔豬的料肉比和腹瀉率(p＜0.05)，同時(shí)對(duì)仔豬的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1569895SQ03128310
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者彭健, 程學(xué)慧, 蔣思文, 詹志春 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)