專利名稱：豬旋毛蟲病疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制劑-疫苗的制備方法，涉及寄生蟲病的疫苗制備，即對豬有免疫預防作用的旋毛蟲病疫苗的制備方法。
旋毛蟲病是人畜共患危害嚴重的寄生蟲病，侵襲100多種動物，發(fā)病廣泛，我國多地區(qū)發(fā)生本病。人常因食用旋毛蟲病豬肉、犬肉等而發(fā)病，西藏六十年代人旋毛蟲病有死亡率6.8%的報導。它還給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，國家已把此病列入必須控制消滅的疾病之一。由于藥物治療不能解決重復感染的問題，為徹底控制消滅本病，只有通過研制疫苗的方法，使豬、犬獲得被動免疫，從而逐漸消滅病原，則人旋毛蟲病可望滅跡。
國外對豬旋毛蟲病疫苗的研究，主要是應用成蟲抗原或新生幼蟲抗原。WangC.H.etalParasiteImmunol9465，1987;MartiH.P.etal;Vet.Parasitol20237，1986;均采用高速離心法制出三日齡旋毛蟲成蟲粗抗原與弗氏完全佐劑乳化后免疫小鼠，可誘導89%的減蟲率。成蟲抗原據(jù)報導對雌蟲生殖能力的抑制不理想;新生幼蟲抗原免疫原性較成蟲為優(yōu)，但在收集上比較困難。成蟲在體外培養(yǎng)中的活力及繁殖率均不甚強，因此利用體外培養(yǎng)獲取新生幼蟲的方法亦未見成功的報導。
為了增強動物對旋毛蟲病的免疫機能，本發(fā)明研制了成蟲和幼蟲的混合抗原疫苗，以誘導動物產(chǎn)生抗成蟲和抗幼蟲的抗體成分，并結(jié)合體外培養(yǎng)觀察成蟲，在雌蟲產(chǎn)幼蟲之際集取成蟲和極少量剛產(chǎn)出的新生幼蟲，解決了收集大量新生幼蟲的困難。經(jīng)動物試驗，成蟲和肌幼蟲減蟲率可達90%左右，雌蟲生殖能力下降90%左右。
本發(fā)明方案為以1000～1200條旋毛蟲接種于300克左右的健康大白鼠，接種后第七天撲殺取蟲，將蟲反復洗滌后放入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)液組成為1640培養(yǎng)液中加入ATP、腸粘膜組織浸出液，多種氨基酸以及經(jīng)過處理的豬血清。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24小時，觀察雌蟲子官中孕育了大量幼蟲，在即將產(chǎn)蟲之際，即收集培養(yǎng)液中全部蟲體(正在產(chǎn)蟲的雌蟲，剛產(chǎn)出的少許新生幼蟲和雄蟲)。多次洗滌后計數(shù)蟲體壓積，按1∶100(V/V)比例加入PH7.2PBS液，置-30℃保存。將收集的蟲體反復凍融十次后，再用超聲波粉碎裂解蟲體三次，置4℃過夜，以10000rpm低溫離心30分鐘，上清液即為可溶性抗原。按1∶4.5(V/V)的比例將可溶性抗原用PH7.2PBS稀釋，充分振蕩混合后，每100ml抗原稀釋液加入甲醛0.2ml，充分混合，加入吐溫-802ml充分混合，然后按100∶1(V/V)的比例加入硫柳汞溶液，充分混合，制成抗原稀釋液備用。膠體磨經(jīng)消毒預處理后，將白油-司潘佐劑一份傾入膠體磨濾斗內(nèi)，低速研磨數(shù)分鐘后，緩慢滴加抗原稀釋液一份，滴加完畢后高速膠磨數(shù)分鐘使其充分乳化，制成油包水苗;再將油包水苗置膠體磨中低速研磨數(shù)分鐘，緩緩加入含有2%吐溫-80的PBS，高速膠磨數(shù)分鐘，即制成水包油旋毛蟲苗，4℃冰箱保存。
由于本發(fā)明利用旋毛蟲雌蟲子宮內(nèi)孕育大量成熟幼蟲即將產(chǎn)蟲之際，集取成蟲和新生幼蟲制苗，使蟲苗能誘導產(chǎn)生抗成蟲抗體也能誘導產(chǎn)生抗幼蟲抗體，集蟲方法簡單，收效快，節(jié)約時間。所制備的蟲苗經(jīng)動物免疫試驗，成蟲和肌幼蟲減蟲率可達90%左右，雌蟲的生殖能力下降90%左右，在旋毛蟲疫區(qū)使用該蟲苗定期接種動物，大大降低了動物對旋毛蟲病的感染率。
實施例1、撲殺繼代保存云南、河南旋毛蟲的大白鼠，取腸、腰、咬、腿和肋間肌各一克，鏡檢含蟲數(shù)，以1000～1200條接種于體重300克左右的健康大白鼠。接種后第七天，撲殺接種鼠，取其小腸，縱向剖開，橫切成2-3em腸段，置于特制的裝有150目尼龍網(wǎng)篩的不銹鋼過濾裝置的上方，放在盛有37℃溫生理鹽水連有收集玻管的玻璃濾斗內(nèi)，進入37℃恒溫箱中過濾收集成蟲4小時。
2、收集玻管底部的成蟲，反復以溫生理鹽水洗滌，將潔凈不含雜質(zhì)的成蟲放入1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含有經(jīng)過處理的豬血清，ATP、腸粘膜組織浸出液、多種氨基酸。培養(yǎng)皿置CO2培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24小時，鏡檢培養(yǎng)液中的雌蟲子宮內(nèi)孕育大量的幼蟲，且已產(chǎn)出第一條新生幼蟲，立即以吸管收集培養(yǎng)液中全部蟲體(雌蟲、雄蟲、少許新生幼蟲)，經(jīng)多次用溫生理鹽水洗滌，離心后傾去上清液，計數(shù)蟲體壓積為0.1ml，加入10mlPH7.2的PBS液，-30℃低溫保存。經(jīng)多次集蟲獲得100ml蟲體PBS液。
3、將保存于-30℃的蟲體PBS液反復凍融10次，再用超聲波粉碎裂解蟲體三次，置4℃冰箱過夜，然后以10000rpm低溫離心30分鐘。收集上清液，測定其蛋白含量及抗原效價后低溫保存?zhèn)溆谩?br> 4、取出低溫保存的抗原100ml，按每1ml抗原加入4.5mlPBS的比例(V/V)，加入PH7.2PBS液，充分振蕩混合;將稀釋為550ml的抗原中加入1.1ml甲醛，充分振蕩混合;再加入吐溫-8011ml，充分振蕩，最后加入1%硫柳汞5.62ml，充分振蕩混合，制成經(jīng)防腐處理的抗原稀釋液。
5、依次用70%灑精，5%福爾馬林，無菌三蒸水消毒處理膠體磨。白油-司潘佐劑與上述經(jīng)防腐處理的抗原稀釋液按1∶1(V/V)的比例用膠體磨膠磨，制成油包水蟲苗;再將制得的油包水蟲苗與含2%吐溫-80的PH7.2PBS液膠磨，制得水包油蟲苗，用疫苗瓶分裝后置4℃保存。即完成豬旋毛蟲病疫苗的制備。
權(quán)利要求
1.豬旋毛蟲病疫苗的制備方法，其特征在于用旋毛蟲接種大白鼠，七日后撲殺取成蟲，將成蟲在體外培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，觀察雌蟲即將產(chǎn)出幼蟲之際，集蟲，制作成蟲幼蟲混合抗原疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬旋毛蟲疫苗的制備方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)液的組成為1640培養(yǎng)液中加入ATP、多種氨基酸、腸粘膜組織浸出液和經(jīng)過處理的豬血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬旋毛蟲疫苗的制備方法，其特征在于所述撲殺取成蟲的方法中采用了150目尼龍網(wǎng)篩和不銹鋼過濾裝置，在37℃條件下恒溫收集成蟲。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬旋毛蟲疫苗的制備方法，其特征在于所述成蟲幼蟲混合抗原疫苗的制備過程中采用了10次凍融和三次超聲波裂解的方法。
全文摘要
豬旋毛蟲病疫苗的制備方法，在旋毛蟲成蟲子宮內(nèi)孕育大量成熟幼蟲的時期收集蟲體，制備成蟲、幼蟲混合性抗原。成蟲體外培養(yǎng)系用1640培養(yǎng)液中加入ATP、多種氨基酸、經(jīng)過處理的豬血清。該疫苗誘導動物產(chǎn)生抗旋毛蟲成蟲抗體和幼蟲抗體，經(jīng)動物試驗表明，疫區(qū)的免疫豬減蟲率可達90％左右。
文檔編號A61K39/002GK1081621SQ9210578
公開日1994年2月9日 申請日期1992年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月25日
發(fā)明者郭振剛, 何秀珠, 楊中梁 申請人:杭州商學院, 大理市康復醫(yī)院