專利名稱：重組雞馬立克氏病病毒sc9-1株和sc9-2株的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組雞馬立克氏病病毒SC9-1株和SC9-2株的構(gòu)建和應(yīng)用，屬于獸用生物制品分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1968年首次分離馬立克氏病病毒(Marek，s disease virus,縮寫為MDV)以來，養(yǎng)雞業(yè)采用疫苗免疫來預(yù)防MD已有40多年的歷史了，隨著MDV的致病性在不斷演化，MDV的毒力和致病性逐漸增強，因而所用的疫苗從III型HVT單價疫苗發(fā)展到II型SB-I加HVT雙價疫苗，最后不得不用致弱的但仍有一定致腫瘤性的I型CVI988/Rispens疫苗株。
從雞群中MDV的流行來看，已從以弱病毒株(mMDV)為主，到以強病毒株(vMDV)為主，以至近20年來超強病毒(vvMDV)株越來越普遍，10年前還出現(xiàn)了特超強病毒株(vv+MDV)(Witter RL. Increased virulence of Marek ' s disease virus fieldisolates. Avian Diseases, 1997,41 (I) :149-163. ) 科學(xué)家利用各種方法構(gòu)建了各種MDV候選毒株試圖改進疫苗的效果,但都不成功。例如，Witter和Kreager等比較了10株新的疫苗候選株的保護性免疫效果，但結(jié)果都不比CVI988/Ri spens株好(WitterRL and Kreager KS. Serotype I viruses modified by backpassage or insertionalmutagenesis Approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek’s disease.Avian Dis. 2004,48 :768-782.)?？磥?，面對MDV野毒株致病性增強的趨勢，用常規(guī)方法改進疫苗似乎已走到了盡頭。但是，根據(jù)過去40多年中MDV演變規(guī)律，其毒力很有可能會在今后幾年變得更強。近年來，在我國，即使在一些已用CV1988/Rispens免疫的雞群，仍有腫瘤發(fā)生率上升的趨勢，雖然國內(nèi)還沒有相關(guān)分離到特超強毒株的報道，但MDV的變異卻一直在進行著。例如，本發(fā)明人分離的野毒株GX0101，其毒力雖比Md5(超強毒)小，但其橫向傳播能力卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Md5 (許曉云，孫愛軍，崔言順，等.帶有REV-LTR片段的馬立克氏病病毒重組野毒株與超強毒株致病性和橫向傳播性比較.微生物學(xué)報(Acta MicrobiologicaSinica) ,2009,49 (4) :0540-0543, Cui et al.，2009)。顯然，有必要在能突破 CVI988/Rispens株的保護性免疫的新的致病性更強的MDV野毒株出現(xiàn)并開始流行以前，應(yīng)盡快地用新的方法研制更有效的疫苗。本發(fā)明人已將GX0101的全基因組克隆進BAC載體，構(gòu)建了其感染性克隆GX0101-BAC,將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可以拯救出重組病毒MDV的bac_GX0101 (孫愛軍，2009，Chinese Science Bulletin. 54 :2641-2647)。按如下方法敲除 MDV 的 bac-GX0101 中的2個meq基因以質(zhì)粒pKD13為模板,用PCR擴增FRT-卡那霉素抗性基因(kanamycinresistance gene, kan1)。為了通過同源重組將Icanlr基因取代bac-GX0101中的meq基因，在擴增FRT-karf基因所用的上下游引物的5'端分別含有與meq基因的前后50bp序列同源的同源臂。引物序列如下Ameq-F 5/ -AGAAACATGGGGCATAGACGATGTGCTGCTGAGAGTCACAATGCGGATCAcgtgtaggctggagctgcttc-3'；Ameq-R 5/ -CTTGCAGGTGTATACCAGGGAGAAGGCGGGCACGGTACAGGTGTAAAGAGcattccggggatccgtcgac-3' (meq基因的前后50bp同源序列用大寫字母表示,來自FRT-Iianlr的序列以小寫字母表示)。FRT-卡那霉素抗性基因的擴增體系如下10XBuffer 2. 5 μ L，模板pKD13 (約lOOng/μ L) I μ L, Mg2+(15mmol/L)2y L，dNTP (2. 5mmol/L)2y L,上下游引物(25pmol/y L)各 I μ L, Taqenzyme (5U/ μ L) O. I μ L,用雙蒸水補至 25 μ L。PCR 擴增程序為95°C IOmin,按950C lmin, 55°C lmin，72°C lmin，30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物用凝膠電泳進
行鑒定。在karf 兩端含有 flp 識別位點(flp recognition target, FRT), flp 重組酶能夠識別卡那霉素抗性基因兩側(cè)34bp的FRT位點，可特異性切除2個FRT位點內(nèi)側(cè)的序列。PCR產(chǎn)物用Dpn I酶進行消化Ih以去除PCR產(chǎn)物中殘留的的環(huán)狀模板質(zhì)粒，消化后的PCR產(chǎn)物利用電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化進已含有GXO101-BAC的大腸桿菌EL250中(孫愛軍，2009，ChineseScience Bulletin. 54 :2641-2647)，電轉(zhuǎn)條件為 1800V, 1 00 Ω，25 μ F。轉(zhuǎn)化后立即用 Iml LB重懸細(xì)菌，32°C培養(yǎng)2h后取100 μ L菌液涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中。16h后挑取單菌落利用 PCR 鑒定 kanr 是否取代了 meq 基因(Schumacher, D. , B. K. Tischer, ff. Fuchs, andN. Osterrieder. 2000. Reconstitution of Marek' s disease virus serotype I (MDV-I)from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of aglycoprotein B-negative MDV-I mutant. J. Virol. 74 :11088-11098)。經(jīng)鑒定，利用卡那霉素抗性基因取代一個meq基因后,挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中于32°C過夜培養(yǎng)搖振培養(yǎng)，待其OD值達到0. 5時，加10%的阿拉伯糖誘導(dǎo)lh，使宿主菌內(nèi)的質(zhì)粒flp重組酶激活和表達，從而去除卡那霉素抗性基因。所得到的菌可在只含有30 μ g/mL氯霉素LB瓊脂平板上生成，但不能在同時含有30 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上生長。敲除一個meq基因驗證成功后，再利用同樣的方法利用karf取代另外一個meq基因，將獲得的缺失2個meq基因的MDV GX0101的感染性克隆質(zhì)粒命名為GX0101 Λ meq-BAC，由其質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒為GX0101 Λ meq。但由于在敲除第二個Meq基因的過程中又加入了一個Karf基因，按照現(xiàn)行的基因工程產(chǎn)物生物安全法，不得將帶有Karf基因的活病毒用作疫苗。為了取得可用作疫苗的毒株，還必須敲除Karf基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用對flp重組酶表達的不完全誘導(dǎo)產(chǎn)生的對帶有3個FRT位點的部分消化作用來敲除GX0101的BAC克隆質(zhì)粒中用于取代第2個meq基因的karf基因；并通過對大量菌落在含有和不含有卡那霉素的2塊LB平板上的對比培養(yǎng)，篩選出可用于拯救出用作疫苗的不帶有meq基因和karf基因的BAC克??；以此從原始的致病性MDV野毒株GX0101獲取了不帶有卡那霉素抗性基因的可以用作疫苗的meq基因缺失病毒SC9-1株，以及又進一步敲除了含有抗氯霉素基因(CM+)的BAC載體的大部分骨架序列的SC9-2株。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明所涉及的基因組構(gòu)建物是利用flp-kan+重組方法敲除了 2個meq基因且不含卡那霉素抗性基因，第一個卡那霉素抗性基因是用常規(guī)的flp酶法去除，第二個卡那霉素抗性基因則是用不完全flp酶消化加卡那霉素抗性負(fù)篩選法去除的。由此得到能用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生MDVSC9-1病毒的重組BAC質(zhì)粒pSC9-BAC(見圖I)然后再進一步去除最初構(gòu)建BAC克隆過程中插入的BAC載體的相關(guān)基因(如氯霉素抗性基因、mini-F因子等)，由此得到能用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生MDV SC9-2 (圖3)病毒的重組BAC質(zhì)粒pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 (見圖 2)本發(fā)明還涉及重組的雞馬立克氏病病毒MDV SC9-1株/或MDV SC9-2株在制備用于預(yù)防超強毒或新出現(xiàn)的特超強毒MDV誘發(fā)的雞馬立克氏病的雞馬立克氏病疫苗中的用途。本發(fā)明同時還涉及一種預(yù)防雞馬立克氏病的方法，其中向雞給予預(yù)防有效劑量的雞馬立克氏病疫苗，所述的疫苗包含重組雞馬立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株/或MDVSC9-2 株。
具體實施例方式利用對flp重組酶表達的不完全誘導(dǎo)產(chǎn)生的對帶有3個FRT位點的部分消化作用來敲除GX0101的BAC克隆質(zhì)粒中用于取代第2個meq基因的karf基因，并通過對大量菌落在含有和不含有卡那霉素的2塊LB平板上的對比培養(yǎng)，篩選出可用于拯救出用作疫苗的不帶有meq基因和kar/基因的BAC克隆。在前期已發(fā)表的研究中(李延鵬馬立克氏病病毒meq基因缺失株生物學(xué)特性及其免疫效果研究，博士學(xué)位論文，2010，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.AndYanpeng Li，Aijun Sun，Shuai Su，Peng Zhao, Zhizhong Cui，Hongfei Zhu，Deletion ofthe Meq gene significantly decreases immunosuppression in chickens caused bypathogenic Marek' s disease virus. Virology Journal2011，8 :2)，已從 GXOlOl 的 BAC克隆質(zhì)粒構(gòu)建了敲除了 2個meq基因的重組BAC克隆質(zhì)粒pGXOlOl Λ meq-BAC。具體過程是利用卡那霉素抗性基因取代一個meq基因后，挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中搖振培養(yǎng)，待其OD值達到0. 5時，加10%的阿拉伯糖誘導(dǎo)lh，使宿主菌內(nèi)的質(zhì)粒flp重組酶，從而去除卡那霉素抗性基因。誘導(dǎo)后將菌分別涂布于含有30 μ g/mL氯霉素或50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上32°C過夜培養(yǎng)，如果只在含有30 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上生長但在含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上不生長，表明誘導(dǎo)后的重組菌仍具備氯霉素抗性而不再具備卡那霉素抗性(KarO，即可確定該重組菌為目的菌。但該重組質(zhì)粒中在被去掉的第一個Meq基因所在的位置仍保留一個flp重組酶識別的位點(flprecognition target, FRT)。敲除一個Meq基因并經(jīng)驗證后，再利用同樣的方法利用kar/取代另外一個meq基因，將獲得的缺失了 2個Meq基因的MDV GX0101的感染性克隆質(zhì)粒命名為pGXOlOl Ameq-BAC0該克隆又插入了一個karf基因。鑒于在敲除前一個karf基因是留下了一個FRT位點，在質(zhì)粒pGXOlOlAmeq-BAC上已存在3個FRT位點(如圖I)。如果按同樣的方法用誘導(dǎo)flp重組酶來敲除第2個karf基因，就會同時敲除MDV的一部分基因組，因而不再能拯救到新的感染性克隆病毒。另一方面，我們已發(fā)表的GXOlOl AMeq病毒，雖然沒有致病性并具備很好的保護性免疫力，但它在細(xì)胞上的復(fù)制能力較差，這一特性也不適合用作商品化疫苗。為此，本發(fā)明人在構(gòu)建敲除Meq基因的GX0101的感染性克隆過程中，對與pGXOlOl Ameq-BAC同批獲得的12個質(zhì)?？寺【溥M行了比較篩選。將這些單獨菌落分別重新編號為PSCAMeq-BACl至pSCAMeq-BAC12。分別將不同菌落的菌體大量培養(yǎng)后制備質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)染CEF。在細(xì)胞出現(xiàn)MDV特有的蝕斑后，分別將所得到的感染性克隆病毒命名為SCl Δ Meq至SC12 Δ Meq0分別比較這些病毒在CEF上的復(fù)制水平，從中選擇到感染性克隆質(zhì)粒pSC Δ Meq-BAC9在CEF上形成的病毒蝕斑最快最多。該感染性克隆質(zhì)粒pSC Δ Meq_BAC9用于進一步敲除其中的Karf基因。為此，我們設(shè)計了 “對flp重組酶和FRT部分誘導(dǎo)消化結(jié)合多重篩選”的新方法，即在細(xì)菌培養(yǎng)時降低對flp重組酶的誘導(dǎo)條件和時間，使一部分pGXO 101 Ameq-BAC質(zhì)粒DNA分子上3個FRT位點中只有2個位點被flp重組酶作用，從而使部分分子只有kar/基因二側(cè)的FRT被flp重組酶識別和作用，因此這一部分分子上只有karf基因被flp重組酶消化剪輯掉，而與另一個FRT位點相關(guān)的MDV基因組均全部保留。
已分別將每一菌落經(jīng)過多次比較篩選，最后按如下條件取得成功感染性克隆質(zhì)粒pSC Δ Meq-BAC9轉(zhuǎn)化的E250株大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中搖振培養(yǎng)，待其OD值達到O. 5時，加5% (完全誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)濃度為10% )的阿拉伯糖誘導(dǎo)40min(完全誘導(dǎo)的時間為60min)，使宿主菌內(nèi)的質(zhì)粒flp重組酶只被部分激活，從而使部分MDV基因組克隆質(zhì)粒分子只去除了卡那霉素抗性基因但不影響MDV基因組部分。誘導(dǎo)后將菌涂布于含有30 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上，32°C過夜培養(yǎng)。將所有具備氯霉素抗性的菌落再分別接種二類LB瓊脂平板一類只含30 μ g/mL氯霉素(A)，另
一類同時含有30 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL卡那霉素(B), 二類平板上接種的菌落分別--對號。選擇在A板上生長而在B板上不生長的菌落即已不具備抗卡那霉素活性的菌落，再分別接種于含有30μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上，在，32°C過夜培養(yǎng)。取每一個菌落的部分菌體分別提取基因組DNA，分別用karf基因和MDVpp38基因特異性引物(PP38-F :5’ -AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG-3’，序列 3 和 pp38_R :5 ’ -ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA-3 ’，序列 4)做 PCR，選擇在 PCR 中 kan"基因陰性但 MDVpp38基因陽性的菌落再接種于含有30μ g/mL氯霉素的LB肉湯，選擇相應(yīng)數(shù)個菌落用plasmidMaxi kit (購自QIAGEN公司)大量提取質(zhì)粒DNA，成功用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生SC9-1株MDV的質(zhì)粒定名為PSC9-BAC (見圖I)。然后分別用以上各個質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞單層，從其中選出MDV特有的細(xì)胞蝕斑，由此拯救到了敲除了 Karf抗性基因的重組病毒，命名為 MDV SC9 ΔMeq Δ Kanr,簡稱 MDV SC9-1。該馬立克氏病病毒(Marek，s disease virus)株已于2010年12月03日保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4399?？紤]到有些國家對基因重組產(chǎn)物的生物安全的不同標(biāo)準(zhǔn)要求，在構(gòu)建SC9-1的同時又構(gòu)建了進一步敲除了抗氯霉素基因的SC9-2株MDV。先按已發(fā)表的方法(Zhao et al.，Self-excision of the BAC sequences from the recombinant Marek’ s disease virusgenome increases replication and pathogenicity, Virology Journal, 2008, 5 :19),構(gòu)建一個在Kan+和SV-cre組合基因二側(cè)帶有分別來自BAC載體質(zhì)粒的mini_F片段和GXO101株MDV基因組的US2-US3連接區(qū)序列的中間重組質(zhì)粒pPartial-F-Kan-Cre-US2-US3。將該質(zhì)粒與pSC9-BAC質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)化E250大腸桿菌，在含有卡那霉素和氯霉素的培養(yǎng)板篩選對卡那霉素有抗性的菌落，菌落質(zhì)粒定名為pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2.用該菌落制備大劑量質(zhì)粒DNA，然后再用該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞單層培養(yǎng)。每3_5天將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化懸浮后再傳代，并觀察MDV產(chǎn)生的病毒蝕斑。由于在SV-cre中的ere基因在SV40啟動子是真核細(xì)胞啟動子，它在CEF細(xì)胞中可自動激活ere基因的表達。被轉(zhuǎn)染的CEF細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒基因組上ere基因表達的酶可將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生的及隨后傳代過程中繼續(xù)被感染的細(xì)胞中MDV病毒基因組上的2個IoxP位點消化，從而自動將病毒基因組上2個IoxP位點間的所有序列剪切掉，所產(chǎn)生的病毒即SC9-2。其基因組相關(guān)片段的結(jié)構(gòu)如附圖
中的C.由此得到的SC9-2已敲除了含抗氯霉素基因(Cif)的BAC載體骨架的大部分DNA序列。為了提到SC9-2在感染細(xì)胞內(nèi)的MDV病毒群體中的比例，將pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了病毒蝕斑的CEF單層培養(yǎng)連續(xù)傳代。在連傳8代后，經(jīng)PCR檢測，絕大多數(shù)病毒蝕斑是有SC9-2所形成的，即以敲除了 BAC載體及CM+基因序列，但仍有少數(shù)病毒仍帶有BAC載體及CM+基因序列。通過有限稀釋法稀釋病毒感染細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。挑選只有I個病毒蝕斑的孔中的病毒感染細(xì)胞進一步傳代，由此得到純化的完全是敲除了 BAC載體及CM+基因序列的SC9-2株病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，該馬立克氏病病毒(Marek’ s disease virus)株已于2011年11月24日保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCCNo. 5502。。
二、將野毒株敲除腫瘤Meq基因的馬立克氏病疫苗病毒SC9-1株和SC9-2的鑒別特性該病毒基因組上帶有三個位于特定位點的特定序列可作為本病毒的鑒別性標(biāo)志(I)在原有的二個Meq基因位點，在敲除Meq基因后，各留下一個約36bp左右的FRT序列；(2)在病毒基因組的US/TRS片段連接點的上游約370bp處插入了一段約539bp的REV-LTR 片段。(3)MDV SC9-1 和 MDV SC9-2 的區(qū)別是MDV SC9-1 帶有 CM"基因和 mini-F 質(zhì)粒，但MDV SC9-2不含有CMlr基因和mini-F質(zhì)粒。三、MDV SC9-1株和MDV SC9-2株病毒對雞的致病性和保護性免疫作用在已發(fā)表的研究中，已證明了 GXOlOl Ameq對雞完全沒有致病性且可誘發(fā)100%的保護性免疫(蘇帥，李延鵬，孫愛軍，崔治中.敲除meq的馬立克氏病毒強毒株對超強毒的免疫保護作用，微生物學(xué)報，2010，50 =380-386.)，只是由于GX0101 Δ meq帶有Kanlr基因，因而不能用作為疫苗病毒。為此，本發(fā)明采用了完全敲除Karf基因的新的疫苗毒株MDVSC9-1株和它的衍生病毒MDV SC9-2，按已報道的方法(蘇帥，李延鵬，孫愛軍，崔治中.敲除meq的馬立克氏病毒強毒株對超強毒的免疫保護作用，微生物學(xué)報，2010，50 =380-386)在SPF雞用同樣方法同樣條件的人工感染試驗，具體方法如下將I日齡SPF雞240只，隨機分為8組，每組30只，分別飼養(yǎng)于8個帶有正，壓過濾空氣的SPF動物飼養(yǎng)隔離器內(nèi)，I日齡時，第I組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種GX0101 Λ meq，第2組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種SC9-1、第3組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種MDV SC9-2、第4組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種CVI988/Rispen，第5組雞為攻毒對照，第6組雞為空白對照，第7組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種SC9-1，第8組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種MDV SC9-2。免疫接種5天后，第1、2、3、4和5組雞分別以IOOOpfu/只的攻擊劑量MDV超強毒株w rMd5。攻毒后每周觀察及的生長態(tài)勢。實驗期間，對各組死亡雞只剖檢，并取疑似馬立克氏病特有病變臟器做石蠟切片，HE染色后進行病理組織學(xué)觀察。在攻毒后90天，所有的存活雞均被處死并剖檢，觀察雞的病變，同時，每組隨機選取5只，分別取心臟、脾、肝臟于10%中性福爾馬林固定，4°C保存。石蠟切片，HE染色進行病理組織學(xué)觀察。
試驗結(jié)果證明，該MDV SC9-1和MDV SC9-2 二株病毒對SPF雞沒有致病性，并對超強毒vvMDV病毒株Md5表現(xiàn)出同樣的保護性免疫(表I)。從表可看出，在將Kanlr基因敲除后，SC9-1株病毒對SPF雞的致病性和保護性免疫效力與其親本病毒GX0101 Ameq完全相同。在敲除了 Karf基因后，將符合生物安全法的要求可用作疫苗。MDV SC9-2株在進一步敲除CMlr基因后也完全相同。表IMDV SC9-1和MDV SC9-2與其他MDV毒株對SPF雞的致病性和保護性免疫效
力的比較
權(quán)利要求
1.一種重組雞馬立克氏病病毒的基因組構(gòu)建物，其特征在于所述基因組構(gòu)建物上帶有三個位于特定位點的特定序列，此特定序列還可作為本病毒的鑒別性標(biāo)志 (I)在原有的_■個Meq基因位點,在敲除Meq基因后,各留下一個34bp的序列5 FRT 5' -GAAGTTCCTA TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTC-3';敲除ニ個Meq基因后，MDVSC9-1 株和MDV SC9-2株完全沒有致病性；(2)在病毒基因組的US/TRS片段連接點的上游約370bp處插入了一段約539bp的REV-LTR片段序列6 5' -CATTGTGGGAGGGAGCTCCGGGGGAATGTGGGAGGGAGCTCCGGGGGGAATAGCGCTGGCTCGCTAACTGCCATATTAGCTTCTGTAGTCATGCTTGCTTGCCTTAGCCGCCATTGTACTTGATATATTTCGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAAGAGCAGGCTCATAAACCCATAAAAGGAAATGTTTGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCACCATCCAATCACGAACAAACACGAGATCGAACCATCATACTGAGCCAATGGTTGTAAAGGGCAGATGCTATCCTCCAATGAGGGAAAATGTCATGCAACATCCTGTAAGCGGCTATATAAGCCAGGTGCATCTCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACACATTGTTGTGACGTGCGGCCCAGATTCGAATCTGTAATAAAAGCTTTTTCTTCTATATCCTCAGATTGGCAGTGAGAGGAGATTTTGTTCGTGGTGTTGGCTGGCCTACTGGGTGGGGTAGGGATCCGGACTGAATACCGTAGTATTTCGGTACAACAA-3'。
2.ー種含有權(quán)利要求I所述基因組構(gòu)建物的重組的雞馬立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株/或MDV SC9-2株，其特征在于其基因組利用flp-kan+重組方法敲除了 2個meq基因且不含卡那霉素抗性基因，第一個卡那霉素抗性基因是用常規(guī)的flp酶法去除，第二個卡那霉素抗性基因則是用不完全flp酶消化加卡那霉素抗性負(fù)篩選法去除的，由此得到能用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生SC9-1病毒的重組BAC質(zhì)粒pSC9-BAC ;然后再進ー步去除最初構(gòu)建BAC克隆過程中插入的BAC載體的相關(guān)基因，如氯霉素抗性基因、mini-F因子由此得到能用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生SC9-2病毒的重組BAC質(zhì)粒pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 ； MDV SC9-1株已于2010年8月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4399 ； MDV SC9-2株已于2011年11月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏號為CGMCC No. 5502。
3.ー種包含如權(quán)利要求2所述的重組雞馬立克氏病病毒MDV SC9-1株或SC9-2株感染的雞胚成纖維細(xì)胞。
4.一種雞馬立克氏病病毒疫苗,其特征在于包含權(quán)利要求I所述的重組雞馬立克氏病病毒的基因組構(gòu)建物。
5.—種雞馬立克氏病病毒疫苗,其特征在于包含權(quán)利要求2所述的重組的雞馬立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株或MDV SC9-2株。
6.—種雞馬立克氏病病毒疫苗,其特征在于包含權(quán)利要求3所述的雞胚成纖維細(xì)胞。
7.ー種根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組雞馬立克氏病病毒的基因組構(gòu)建物、權(quán)利要求2所述的重組的雞馬立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株或MDV SC9-2株和權(quán)利要求3所述的雞胚成纖維細(xì)胞在制備雞馬立克氏病病毒疫苗中的用途。
8.預(yù)防雞馬立克氏病的方法，其中向雞給予預(yù)防有效劑量的雞馬立克氏病病毒疫苗，所述的疫苗包含選自權(quán)利要求I所述的重組雞馬立克氏病病毒的基因組構(gòu)建物，包含權(quán)利要求2所述的重組的雞馬立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株或SC9-2株，或者包含權(quán)利要求3所述的雞胚成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組雞馬立克氏病病毒SC9-1株和SC9-2株的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明的重組病毒構(gòu)建方法解決了連續(xù)二次采用兩端含有flp識別位點kanr基因敲除同一病毒基因組上二個特定功能基因后無法用現(xiàn)行方法再敲除kanr基因的技術(shù)難點；所獲得的重組病毒MDV SC9-1株和MDV SC9-2用作馬立克氏病活疫苗的生產(chǎn)毒株所制備的疫苗，預(yù)防超強毒或新出現(xiàn)的特超強毒MDV誘發(fā)的雞馬立克氏病，其保護性免疫效果優(yōu)越于目前國內(nèi)外市場上應(yīng)用最廣泛的CVI988/Rispens株疫苗；該重組病毒的抗原性應(yīng)比美國已發(fā)表的同類病毒rMd5Δmeq更類同于中國的流行株，不僅不會誘發(fā)腫瘤，也沒有免疫抑制作用，因而更實用于中國。
文檔編號A61K39/245GK102628053SQ20111039365
公開日2012年8月8日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者崔治中, 蘇帥, 趙鵬 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)