專利名稱：一種從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌是人類口腔微生物中的主要致病菌，還是引起化膿感染的重要病原菌，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，使得金黃色葡萄球菌越來越具有耐藥性。本發(fā)明的原材料粉風(fēng)座殼孢菌(Aschersonia aleyrodis)隸屬于子囊菌門、糞菌綱、肉座菌目、麥角菌科、座殼孢菌屬，是一種蟲生真菌，從其天然產(chǎn)物中提取的物質(zhì)具有無毒副作用、不易導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生抗耐藥性的特點(diǎn)，對開發(fā)生物抑菌劑具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法，得到的抑菌劑來源于天然產(chǎn)物，無毒副作用，不易導(dǎo)致人類和工業(yè)病原微生物產(chǎn)生抗耐藥性，且制備簡單，成本較低。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法，包括以下步驟
1)將粉虱座殼孢菌活化后，取菌塊接種PDB培養(yǎng)基中，在120-160r/min、20-28°c條件下連續(xù)培養(yǎng)5-10天即初級培養(yǎng)，按8% -10%接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在120-160r/min、20-28°C條件下連續(xù)培養(yǎng)25-30天即次級培養(yǎng)；
2)培養(yǎng)后將菌液、菌絲體過濾分離，用乙酸乙酯對菌液進(jìn)行液液萃取，萃取液旋蒸濃縮得菌液粗提物，將乙酸乙酯回收；
3)菌絲體在28-35°C條件下干燥、粉碎，再用乙酸乙酯超聲萃取，萃取液旋蒸濃縮得菌絲體粗提物，回收乙酸乙酯；
4)將菌絲體粗提物和菌液粗提物合并加乙醇溶出過濾，制得抑菌劑。步驟2)所述液液萃取的條件為乙酸乙酯與菌液按體積比2:1 1:1，在220C _28°C下?lián)u瓶萃取20-40min、再靜止20_40min，如此反復(fù)萃取3-5次。步驟3)所述超聲萃取的條件為乙酸乙酯與菌絲體按體積比2:1 1:1，在220C _28°C下超聲萃取20-40min，靜止20_40min，如此反復(fù)萃取3-5次。步驟3)所述超聲萃取的功率300 500W，頻率30 40KHz。步驟3)所述粉碎的顆粒直徑為10 30目。PDB培養(yǎng)基的制備如下200g馬鈴薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，經(jīng)4層紗布過濾后加單蒸水定容至1L。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
I)本發(fā)明的抑制劑原材料具有生長周期短、繁殖快的特點(diǎn)。2)本發(fā)明的抑菌劑可以有效地抑制金黃色葡萄球菌，其MIC為O. 052mg/ml,對枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等也有一定的抑菌效果。3)本發(fā)明的抑菌劑來源于天然產(chǎn)物，具有無毒副作用，不易導(dǎo)致人類和工業(yè)病原微生物產(chǎn)生抗耐藥性，且制備簡單，成本較低，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
1)取粉虱座殼孢菌(邱君志等，昆蟲病原真菌粉虱座殼孢對煙粉虱侵染行為的初步研究.菌物學(xué)報，2004，23 (I) :115 121)為材料，無菌條件下挑取長寬約為Icm的菌塊到PDB培養(yǎng)基(200g馬鈴薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，經(jīng)4層紗布過濾后加單蒸水定容至1L，分裝到250ml三角瓶中，每瓶裝100ml，在121°C高壓下滅菌25min)中，在160r/min、25°C條件下連續(xù)培養(yǎng)8天即初級培養(yǎng)，按9%接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在160r/min、 25 °C條件下連續(xù)培養(yǎng)28天即次級培養(yǎng)；
2)培養(yǎng)后將菌液、菌絲體過濾分離，用乙酸乙酯對菌液進(jìn)行液液萃取，加液量按體積比2:1，在25 °C下?lián)u瓶萃取30min、再靜止30min，如此將菌液萃取4次，旋蒸濃縮得菌液菌粗提物，將乙酸乙酯回收；
3)菌絲體在30°C條件下干燥，將其粉碎過20目篩，用乙酸乙酯進(jìn)行超聲萃取，加液量按體積比2:1，在25 °C下超聲萃取30min，靜止30min，如此反復(fù)萃取4次，旋蒸濃縮得菌絲體粗提物，回收乙酸乙酯；
4)將菌絲體粗提物和菌液粗提物合并，即得抑菌物質(zhì)A。實(shí)施例2
1)取粉虱座殼孢菌(邱君志等，昆蟲病原真菌粉虱座殼孢對煙粉虱侵染行為的初步研究.菌物學(xué)報，2004，23 (I) :115 121)為材料，無菌條件下挑取長寬約為Icm的菌塊到PDB培養(yǎng)基(200g馬鈴薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，經(jīng)4層紗布過濾后加單蒸水定容至1L，分裝到250ml三角瓶中，每瓶裝100ml，在121°C高壓下滅菌25min)中，在120r/min、20°C條件下連續(xù)培養(yǎng)5天即初級培養(yǎng)，按8% %接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在120r/min、20°C條件下連續(xù)培養(yǎng)25天即次級培養(yǎng)；
2)培養(yǎng)后將菌液、菌絲體過濾分離，用乙酸乙酯對菌液進(jìn)行液液萃取，加液量按體積比1:1，在22°C°C下?lián)u瓶萃取20min、再靜止20min，如此將菌液萃取3次，旋蒸濃縮得菌液菌粗提物，將乙酸乙酯回收；
3)菌絲體在28°C條件下干燥，將其粉碎過10目篩，用乙酸乙酯進(jìn)行超聲萃取，加液量按體積比1:1，在22°C°C下超聲萃取20min，靜止20min，如此反復(fù)萃取3次，旋蒸濃縮得菌絲體粗提物，回收乙酸乙酯；
4)將菌絲體粗提物和菌液粗提物合并加乙醇溶出過濾，制得抑菌劑。實(shí)施例3
I)取粉虱座殼孢菌(邱君志等，昆蟲病原真菌粉虱座殼孢對煙粉虱侵染行為的初步研究.菌物學(xué)報，2004，23 (I) :115 121)為材料，無菌條件下挑取長寬約為Icm的菌塊到PDB培養(yǎng)基(200g馬鈴薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，經(jīng)4層紗布過濾后加單蒸水定容至1L，分裝到250ml三角瓶中，每瓶裝100ml，在121°C高壓下滅菌25min)中，在160r/min、28°C條件下連續(xù)培養(yǎng)10天即初級培養(yǎng)，按10%接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在160r/min、28°C條件下連續(xù)培養(yǎng)30天即次級培養(yǎng)；
2)培養(yǎng)后將菌液、菌絲體過濾分離，用乙酸乙酯對菌液進(jìn)行液液萃取，加液量按體積比2:1，在28°C下?lián)u瓶萃取40min、再靜止40min，如此將菌液萃取5次，旋蒸濃縮得菌液菌粗提物，將乙酸乙酯回收；
3)菌絲體在35°C條件下干燥，將其粉碎過30目篩，用乙酸乙酯進(jìn)行超聲萃取，加液量按體積比2:1，在28°C下超聲萃取40min，靜止40min，如此反復(fù)萃取5次，旋蒸濃縮得菌絲體粗提物，回收乙酸乙酯；
4)將菌絲體粗提物和菌液粗提物合并加乙醇溶出過濾，制得抑菌劑。對比實(shí)施例II)同實(shí)施例I的步驟I)。將實(shí)施例I的步驟2)中乙酸乙酯替換為二氯甲烷，方法同實(shí)施例I。將實(shí)施例I的步驟3)中乙酸乙酯替換為二氯甲烷，方法同實(shí)施例I。2)將菌絲體粗提物和菌液粗提物合并，即得抑菌物質(zhì)B。對比實(shí)施例2
I)同實(shí)施例I的步驟I)。2)將實(shí)施例I的步驟2)中乙酸乙酯替換為甲醇，方法同實(shí)施例I。3)將實(shí)施例I的步驟3)中乙酸乙酯替換為甲醇，方法同實(shí)施例I。4)將菌絲體粗提物和菌液粗提物合并，即得抑菌物質(zhì)C。抑菌實(shí)驗(yàn)用乙醇將抑菌物配制成濃度為10 mg/ml的母液并進(jìn)行二倍梯度稀釋，配制各梯度濃度的抑菌劑，用無菌水分別將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌配成濃度均為108cfu/ml的菌液,在無菌條件下,分別將直徑6 mm的無菌濾紙片放入個各濃度的抑菌劑中浸泡30 min,以浸泡在乙醇中的濾紙片為對照，取出，揮干溶劑，覆蓋在以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為指示菌的培養(yǎng)基表面，在35°C培養(yǎng)24小時，每種抑菌劑做三個重復(fù)，抑菌圈直徑越大抑菌效果越好。表I在35°C、菌液濃度108cfu/ml、抑菌劑濃度為10mg/ml下觀察對抑菌圈大小
I-1-!
試驗(yàn)病原菌抑菌劑濃度為I Omg ml時抑菌圈大小mm 1
ABC
金黃色葡萄球菌 2571S.515.5,
枯草芽孢桿菌14—010.39—2
蘇云金芽孢桿菌 13—S3119
巨大芽孢桿菌13—S10—59—S
由表I可見，抑菌物質(zhì)A的效果最明顯，用實(shí)施例I可以高效地提取抑菌物質(zhì)，此表還顯示抑菌物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌均有抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著，抑菌圈平均直徑為25. 7 _。表2在35°C、菌液濃度108cfu/ml下測定對各病原菌MIC值
權(quán)利要求
1.一種從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 1)將粉虱座殼孢菌活化后，取菌塊接種PDB培養(yǎng)基中，在120-160r/min、20-28°C條件下連續(xù)培養(yǎng)5-10天即初級培養(yǎng)，按8% -10%接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在120-160r/min、20-28°C條件下連續(xù)培養(yǎng)25-30天即次級培養(yǎng)； 2)培養(yǎng)后將菌液、菌絲體過濾分離，用こ酸こ酯對菌液進(jìn)行液液萃取，萃取液旋蒸濃縮得菌液粗提物，將こ酸こ酯回收； 3)菌絲體在28-35°C條件下干燥、粉碎，再用こ酸こ 酯超聲萃取，萃取液旋蒸濃縮得菌絲體粗提物，回收こ酸こ酯； 4)將菌絲體粗提物和菌液粗提物合并加こ醇溶出過濾，制得抑菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法，其特征在于步驟2)所述液液萃取的條件為こ酸こ酯與菌液按體積比2:1 1:1，在22°C -28°C下?lián)u瓶萃取20-40min、再浄止20-40min,如此反復(fù)萃取3-5次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法，其特征在于步驟3)所述超聲萃取的條件為こ酸こ酯與菌絲體按體積比2:1 1:1，在22°C -28°C下超聲萃取20-40min,浄止20-40min,如此反復(fù)萃取3-5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法，其特征在于步驟3)所述超聲萃取的功率300 500W，頻率30 40KHz。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從粉虱座殼孢菌代謝物中提取抑菌劑的方法，其特征在于步驟3)所述粉碎的顆粒直徑為10 30目。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從粉虱座殼孢菌(Aschersoniaaleyrodis)代謝物中提取抑菌劑的方法，所述的微生物抑菌劑為粉虱座殼孢菌代謝物乙酸乙酯提取物。主要包括以下步驟液體培養(yǎng)、分離、加有機(jī)溶劑萃取、濃縮制得抑菌物、回收有機(jī)溶劑。本發(fā)明的抑菌劑原材料具有生長周期短、繁殖快的特點(diǎn)，抑菌劑來源于天然產(chǎn)物，具有無毒副作用，不易導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生抗耐藥性，且制備簡單，成本較低。
文檔編號A61K36/066GK102772447SQ201210288828
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者關(guān)雄, 宋飛飛, 李小霞, 毛麗慧, 涂潔, 邱云鋒, 邱君志, 郭慶豐 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)