專利名稱：一種超聲提取銀線草總黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物有效成分的提取方法，尤其涉及的是一種超聲提取銀線草總黃酮 的方法。
背景技術(shù)：
響應(yīng)曲面法(response surface methodology, RSM)是一種數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法 相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，它通過近似構(gòu)造一個(gè)具有明確表達(dá)形式的多項(xiàng)式來表達(dá)隱式功能 函數(shù)，對受多個(gè)自變量影響的響應(yīng)進(jìn)行建模和分析，最終目的是優(yōu)化響應(yīng)值。由于采用了更 為合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以最經(jīng)濟(jì)方式，有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件。簡單而言， 響應(yīng)曲面法就是將所有試驗(yàn)點(diǎn)均安排到球形的表面上的試驗(yàn)方法，在有限的實(shí)驗(yàn)次數(shù)下通 過建立連續(xù)變量曲面模型，并對影響結(jié)果的各因素及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價(jià)的多元優(yōu) 化方法。目前，響應(yīng)曲面法廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物成分提取等方面，對天然產(chǎn)物成分的開發(fā)利 用具有重要作用，已成為降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量的有力手段。黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、降低脂質(zhì)過氧 化反應(yīng)、預(yù)防心血管疾病、抗衰老、抗腫瘤及清除自由基等作用，近年來，它的研究、開發(fā)和 利用已在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注。銀線草主要含有倍半萜、黃酮類、香豆素類等類型化合物。 目前關(guān)于銀線草有效成分提取方面的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。參考文獻(xiàn)1、Jia Ζ. , Tang Μ. , Wu J. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals[J]. Food Chem,1999, 64 :555-559.2、Amini Μ. , Younesi H. Application of response surface methodology for optimization of lead biosorption in an aqueous solution by Aspergillusniger[J]. Journal of Hazardous Materials,2008，154(1/3) :694_702.3、Wu Τ. , Annie B. S. W. ,Gu L. , et al. Simultaneous determination of six isoflavonoids in commercial Radix Astragali by HPLC-UV[J]. Fitoterapia, 2005, 76(2) : 157-165.4>ffania A. ,Kaur D. ,Ahmed I.,et al. Extraction optimization of watermelon seed protein using response surface methodology[J]. LffT Food Science and Technology,2008,41(8) : 1514-1520.

發(fā)明內(nèi)容
為了充分利用資源以及減少能源、溶劑等生產(chǎn)成本的消耗，本發(fā)明利用響應(yīng)曲面 法優(yōu)化超聲提取銀線草總黃酮的工藝條件，借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 7. 1.3，采用 中心組合設(shè)計(jì)(central composite design, CCD)對各主要影響因子如甲醇濃度、料液比、 提取時(shí)間、提取溫度之間的單一和交互作用等進(jìn)行了較深入的研究，得出最佳的超聲提取工藝參數(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種超聲提取銀線草總黃酮的方法，將所述銀線草粉碎后過40目篩，加入石油 醚混合均勻，充分脫色后經(jīng)兩層濾紙抽濾，取濾渣揮干備用；準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的材料，按 料液比(g/mL)l 15-20分別加入濃度為50% -60%的甲醇溶液，充分搖勻后浸泡lh，在 55-650C >40KHz 下超聲提取 5-lOmin。所述的方法，其中，甲醇濃度57%，料液比1 17，提取時(shí)間6min，提取溫度60°C。所述的方法，將所述銀線草粉碎后過40目篩，按料液比(g/mL)l 10加入石油醚 混合均勻。


圖IA-D為不同影響因子對銀線草黃酮得率的影響(1-A.甲醇濃度對銀線草黃酮 得率的影響；1-B.料液比對銀線草黃酮得率的影響；1-C.提取時(shí)間對銀線草黃酮得率的影 響；1-D.提取溫度對銀線草黃酮得率的影響)；圖2A-F為不同因素的交互作用對銀線草總黃酮得率的影響；其中2-A.料液比與 甲醇濃度的交互作用對銀線草總黃酮得率的響應(yīng)面和等高線圖；2-B.提取時(shí)間與甲醇濃 度的交互作用對銀線草總黃酮得率的響應(yīng)面和等高線；2-C.提取溫度與甲醇濃度的交互 作用對銀線草總黃酮得率的響應(yīng)面和等高線；2-D.提取時(shí)間與料液比的交互作用對銀線 草總黃酮得率的響應(yīng)面和等高線；2-E.提取溫度與料液比的交互作用對銀線草總黃酮得 率的響應(yīng)面和等高線；2-F.提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對銀線草總黃酮得率的響應(yīng) 面和等高線。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。1材料與儀器(1)實(shí)驗(yàn)材料銀線草于2007年7月采自陜西太白山，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院田先華教授 鑒定為金粟蘭屬銀線草Chloranthus japonicus Sieb. 0樣品標(biāo)本保存于陜西師范大學(xué)生 命科學(xué)學(xué)院。(2)儀器與試劑KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗儀(600w，40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)，電子天 平，UV-2450型紫外分光光度計(jì)(日本島津)，F(xiàn)Z102微型植物粉碎機(jī)(黃驊市中興有限責(zé) 任公司)；蘆丁購自購自中國藥品生物制品檢定所，甲醇、石油醚、硝酸鈉等所用試劑均為 分析純。2 方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照鋁鹽顯色法(參考文獻(xiàn)1)。精確量取ImL不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 (0.01-0. 10mg/mL)置于IOmL容量瓶中，加入60%甲醇lmL，5 %亞硝酸鈉溶液300 μ L，混 勻，放置5min后，加10%硝酸鋁溶液300 μ L，搖勻放置6min。加lmol/L的氫氧化鈉溶液4mL，用60%甲醇定容至10mL，搖勻，放置15min，靜置。在510nm波長測定各濃度下的吸光 度值，以60%甲醇溶液作參比。標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)得y = 12. 045x+0. 0612 (r2 = 0. 9902)(2)供試品溶液的制備將干燥至恒重的銀線草粉碎后過40目篩，稱取50. OOg于IL三角瓶中，加入500mL 石油醚混合均勻，充分脫色后經(jīng)兩層濾紙抽濾，取濾渣揮干備用。(3)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)①甲醇濃度對提取工藝的影響準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的材料1. OOg置于50mL三角瓶中，按料液比(g/mL) 1 25分 別加入濃度為50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %的甲醇溶液各25mL，充分搖勻后浸泡Ih， 在60°C、40KHz下超聲處理30min，抽濾提取液，將濾液轉(zhuǎn)至25mL容量瓶，用60%甲醇定容。 混勻后取出ImL置于IOmL容量瓶中，以下按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液OD51tl的步驟測定各條件 下的溶液吸光值。銀線草提取液OD51tl值與甲醇濃度的關(guān)系見圖1-A。②料液比對提取工藝的影響按料液比(g/mL)l 10、1 15、1 20、1 25、1 30、1 35 稱取材料于 50mL 容量瓶中，用25mL60%甲醇浸泡lh，在60°C、40KHz下超聲處理30min，抽濾提取液，將濾液 轉(zhuǎn)至25mL容量瓶，用60%甲醇定容?；靹蚝笕〕鯥mL于IOmL容量瓶中，以下按照測定蘆丁 標(biāo)準(zhǔn)溶液OD51tl的步驟測定各條件下的溶液吸光值。銀線草提取液OD51tl值與料液比的關(guān)系 見圖1-B。③提取時(shí)間對提取工藝的影響準(zhǔn)確稱取材料1. OOg于50mL三角瓶中，按料液比(g/mL) 1 25加入60%甲醇 25mL,充分搖勻后浸泡 Ih,在 60°C、40KHz 下超聲處理 0min、20min、40min、60min、80min、 lOOmin，抽濾提取液，將濾液轉(zhuǎn)至25mL容量瓶，用60%甲醇定容?；靹蚝笕〕鯥mL于IOmL 容量瓶中，以下按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液OD51tl的步驟測定各條件下的溶液吸光值。銀線草提 取液OD51tl值與提取時(shí)間的關(guān)系見圖1-C。④提取溫度對提取工藝的影響準(zhǔn)確稱取材料l.OOg于50mL三角瓶中，按料液比(g/mL) 1 25加入60%甲醇 25mL,充分搖勻后浸泡lh，分別在20 °C >30 °C >40 °C >50 °C >60 °C >70 °C水溫，40KHz下超聲 30min,抽濾提取液，將濾液轉(zhuǎn)至25mL容量瓶，用60%甲醇定容?；靹蚝笕〕鯥mL于IOmL 容量瓶中，以下按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液OD51tl的步驟測定各條件下的溶液吸光值。銀線草提 取液OD51tl值與提取溫度的關(guān)系見圖I-D。(4)響應(yīng)面分析試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法(參考文獻(xiàn)2、3、4)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素對 銀線草總黃酮得率的影響，確定4個(gè)主要因素，采用中心組合設(shè)計(jì)法(CCD)，設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面 試驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以總黃酮得率為響應(yīng)值，以甲醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提 取溫度為自變量，實(shí)施4因素3水平的響應(yīng)面分析。甲醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度 分別以X1、X2、X3、X4代表，按方程Xi = (Xi-X0) / Δ X對自變量進(jìn)行編碼，其中，Xi為自變量的 編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，Xtl為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，X為自變量的變化步長。 因子編碼及各自變量水平見表1。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果見表2和表3。不同因素的交互作用對銀線草總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。表1銀線草總黃酮提取物響應(yīng)面分析因素及水平 注表中各自變量編碼值與真實(shí)值之間的關(guān)系分別為Xl = (X1-BO)/10, X2 = (X2-IO)/5，X3 = (X3-20)/10, X4 = (X4-60)/10。3結(jié)果與分析(1)單因素試驗(yàn)結(jié)果①甲醇濃度對提取工藝的影響由圖I-A可知，銀線草總黃酮提取物吸光度值在甲醇濃度為60%達(dá)到最高，這是 由于黃酮是一大類極性范圍很廣的物質(zhì)，當(dāng)甲醇濃度為60%時(shí)，銀線草的醇溶性和水溶性 黃酮類物質(zhì)都能最大程度的溶出。因此銀線草做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)選取50%、60%、70%三個(gè)水 平的甲醇濃度。②料液比對提取工藝的影響由圖I-B可知，銀線草總黃酮提取物的吸光值隨著液料比的增加而減少，即所用 材料比值越大，提取出的黃酮類物質(zhì)越多。在料液比為1 10時(shí)OD值最大，因此在做響應(yīng) 面實(shí)驗(yàn)分析時(shí)，均選取料液比水平為1 5、1 IOU 15。③提取時(shí)間對提取工藝的影響由圖I-C可知，銀線草總黃酮提取物的吸光值先隨提取時(shí)間的延長而增加，之后 變化平緩。提取時(shí)間為20min時(shí)，銀線草總黃酮提取物的吸光度值最大。因此銀線草做響 應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)選取10min、20min、30min三個(gè)水平的提取時(shí)間。④提取溫度對提取工藝的影響由圖I-D可知，當(dāng)溫度為60°C時(shí)，銀線草提取物吸光度值最大，因此在進(jìn)行響應(yīng)面 實(shí)驗(yàn)分析時(shí)選取50°C、60°C、70°C三個(gè)水平。(2)基于響應(yīng)面法的提取工藝參數(shù)優(yōu)化根據(jù)甲醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)單因素試驗(yàn)所確定的水平范圍， 應(yīng)用Design-Expert Software 7. 1. 3軟件，選用中心復(fù)合模型(CCD)，做4因素、3水平共 31個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(6個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)(表2和表3)。這31個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類 其一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有25個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為 區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。由表3可知，提取溫度的二次項(xiàng)D2 < 0. 0001，表示提取溫度對銀線草總黃酮得率 的影響極顯著，料液比的二次項(xiàng)B2為0. 0066 (< 0. 05)，說明料液比對銀線草總黃酮得率的 影響顯著，提取時(shí)間和甲醇濃度對總黃酮得率的影響相對較弱。以銀線草總黃酮的提取率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響用如下多元二次回歸方程表示R = 4. 5-0. 069A+0. 72B+0. 043C+0. 14D+0. 075AB+0. 027AC-0. 38AD-0. 30BC-0. 18B D+0. 062CD-9. 962E-004A2-0. 42B2_0. 13C2_1. 02D2根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖2，該方程的二次項(xiàng)系數(shù)均 為負(fù)數(shù)，方程所代表的拋物線的開口向下，有極大值點(diǎn)。從回歸分析結(jié)果和圖2可以看出， 所建立的模型的P < 0.0001，為極顯著，而Lack of fit (失擬項(xiàng))檢驗(yàn)P值為0. 239，影響 不顯著，說明該回歸方程對試驗(yàn)數(shù)據(jù)充分?jǐn)M合，是銀線草總黃酮提取率與提取工藝參數(shù)的 合適數(shù)學(xué)模型，能較好地起到預(yù)測作用。表2銀線草總黃酮響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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表3銀線草總黃酮響應(yīng)面ANOVA分析結(jié)果 (3)最佳工藝條件的預(yù)測對擬合回歸方程求偏導(dǎo)，并令其等于零，可以得到模型的極值點(diǎn)，即4個(gè)主要因 素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到銀線草總黃酮提取的最佳條件，即甲醇濃度57%，料液比 1 17，提取時(shí)間6min,提取溫度60°C，預(yù)測總黃酮得率5. 005mg/g。(4)驗(yàn)證性試驗(yàn)①將銀線草粉碎后過40目篩，按料液比(g/mL)l 10加入石油醚混合均勻，充 分脫色后經(jīng)兩層濾紙抽濾，取濾渣揮干備用；準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的濾渣，按料液比(g/mL) 1 17加入濃度為57%的甲醇溶液，充分搖勻后浸泡lh，在60°C、40KHz下超聲提取6min。 銀線草總黃酮得率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為4. 761 士0. 083(mg/g)，與預(yù)測值的誤差為4. 9%。 結(jié)果表明，誤差值均在20%允許范圍內(nèi)，說明回歸方程能較真實(shí)地反映各篩選因素對銀線 草總黃酮提取率的影響，同時(shí)也證明銀線草總黃酮提取的響應(yīng)面模型的可靠性。②將銀線草粉碎后過40目篩，按料液比(g/mL) 1 10加入石油醚混合均勻， 充分脫色后經(jīng)兩層濾紙抽濾，取濾渣揮干備用；準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的濾渣，按料液比(g/ mL)l 15加入濃度為50%的甲醇溶液，充分搖勻后浸泡lh，在55°C、40KHz下超聲提取 6min。銀線草總黃酮得率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為4. 359 士 0. 083 (mg/g)。③將銀線草粉碎后過40目篩，按料液比(g/mL) 1 10加入石油醚混合均勻， 充分脫色后經(jīng)兩層濾紙抽濾，取濾渣揮干備用；準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的濾渣，按料液比(g/ mL)l 20加入濃度為60%的甲醇溶液，充分搖勻后浸泡lh，在65°C、40KHz下超聲提取 IOmin0銀線草總黃酮得率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為4. 563士0. 083 (mg/g)。4 討論提取工藝條件直接關(guān)系到提取物中有效成分的含量和組成，是天然產(chǎn)物分離的首
要環(huán)節(jié)，對于下游工藝和最終產(chǎn)品的質(zhì)量具有決定性意義。因此，對天然產(chǎn)物的提取工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)研究十分必要，優(yōu)化其合理的工藝條件，可以改善提取物質(zhì)量，節(jié)約原料資源， 提高提取分離工藝水平。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和線形回歸分析是傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，在科學(xué)研究和實(shí)踐生產(chǎn)中 有著廣泛的應(yīng)用。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)注重如何科學(xué)合理的安排實(shí)驗(yàn)，可同時(shí)考慮幾種因素，尋找 最佳因素水平組合；但不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù) 表達(dá)式即回歸方程，從而無法找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。線形回 歸分析雖然可以利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出因素與指標(biāo)(即響應(yīng)值)之間的回歸方程，但要求數(shù)據(jù) 量較大，耗時(shí)耗資，且只是討論一種因素的影響，無法考慮幾種因素的綜合作用。響應(yīng)面分 析法克服了傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法的缺陷，采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，將因子實(shí) 驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合，依此對函數(shù)的響應(yīng)面和等值線進(jìn)行分析， 研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，具有實(shí)驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精 度高，能同時(shí)研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的黃酮提取方法時(shí)間長，成本高，效率 低。超聲輔助提取具有方便、快速、簡單、安全等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用超聲技術(shù)提取銀線草中的總黃酮，同時(shí)應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其提取 工藝參數(shù)，得到銀線草總黃酮提取的最佳工藝條件甲醇濃度57%，料液比1 17，提取時(shí) 間6min，提取溫度60°C。預(yù)測結(jié)果和實(shí)驗(yàn)基本吻合，為銀線草有效成分的提取和開發(fā)利用 提供了相應(yīng)的參考數(shù)據(jù)。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
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權(quán)利要求
一種超聲提取銀線草總黃酮的方法，其特征在于，將所述銀線草粉碎后過40目篩，加入石油醚混合均勻，充分脫色后經(jīng)兩層濾紙抽濾，取濾渣揮干備用；準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的材料，按料液比(g/mL)1∶15 20分別加入濃度為50％ 60％的甲醇溶液，充分搖勻后浸泡1h，在55 65℃、40KHz下超聲提取5 10min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，甲醇濃度57%，料液比1 17，提取時(shí)間 6min，提取溫度60°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述銀線草粉碎后過40目篩，按料液比 (g/mL) 1 10加入石油醚混合均勻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超聲提取銀線草總黃酮的方法，其特征在于，將所述銀線草粉碎后過40目篩，加入石油醚混合均勻，充分脫色后經(jīng)兩層濾紙抽濾，取濾渣揮干備用；準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的材料，按料液比(g/mL)1∶15-20分別加入濃度為50％-60％的甲醇溶液，充分搖勻后浸泡1h，在55-65℃、40KHz下超聲提取5-10min。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101912530SQ20101024982
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者康杰芳, 李娜, 王喆之, 王慧 申請人:陜西師范大學(xué)