專利名稱：一種淺色高分子量靈芝多糖及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用真菌提取領(lǐng)域，具體地說涉及一種淺色高分子量靈芝多糖及其制備方法。
背景技術(shù)：
靈芝在我國是一種沿用已久的傳統(tǒng)藥用真菌，其包括赤芝(Ganoderma lucidum) 和紫芝，作為藥用，赤芝更常用。大量的研究表明靈芝多糖是其主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖和保肝等藥理作用。目前市場(chǎng)上靈芝多糖類的保健產(chǎn)品越來越多，但由于靈芝中含有的多糖成分復(fù)雜，加上提取方式粗糙、精深加工成本高等原因，使得目前以靈芝為原料的保健產(chǎn)品都不是用純化后的靈芝活性成分制成，這導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量難以控制和產(chǎn)品效果不穩(wěn)定。常規(guī)水提法獲得的靈芝粗產(chǎn)品中含有色素、蛋白及小分子雜質(zhì)，使得多糖產(chǎn)品顏色較深且多糖含量不高，現(xiàn)有的脫色、脫蛋白技術(shù)較為復(fù)雜，需要活性炭、過氧化氫甚至氯仿、正丁醇等有機(jī)溶劑的處理，會(huì)造成多糖的損失，甚至造成有害有機(jī)溶劑的殘留，不利于規(guī)?；a(chǎn)和提高產(chǎn)品的品質(zhì)，所得產(chǎn)品的多糖含量也僅達(dá)到50%左右，純度不高。靈芝大分子多糖成分的免疫調(diào)節(jié)作用已有大量的研究報(bào)道，并可通過提高機(jī)體的免疫功能而達(dá)到抗癌作用，是靈芝抗癌作用的主要有效成分之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種淺色高分子量靈芝多糖及其制備方法。本發(fā)明首先提供了一種淺色高分子量靈芝多糖，其是由如下方法制備得到的①靈芝粗多糖的提取以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入10-15倍重量的水中，常溫浸泡30-60分鐘，加熱至沸騰，保持60-120分鐘，過濾；濾渣可再重復(fù)上述步驟，提取1-2次，并合并濾液；②靈芝粗提液的濃縮濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾，濾液減壓濃縮至料液比(質(zhì)量/體積，單位千克/升)為1 :1-1:2;③乙醇沉淀及洗滌向上述濾液中加入無水乙醇，至乙醇含量達(dá)到20% -30%，室溫靜置4-6小時(shí)，離心去除醇沉上清，收集沉淀，用20% -30%的乙醇洗滌沉淀2-3次；④干燥沉淀加水溶解，揮干乙醇后冷凍干燥即獲得所需的淺色高分子量靈芝多糖。本發(fā)明還提供了制備上述淺色高分子量靈芝多糖的方法，具體包含如下步驟①靈芝粗多糖的提取以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入10-15倍重量的水中，常溫浸泡30-60分鐘，加熱至沸騰，保持60-120分鐘，過濾；濾渣可再重復(fù)上述步驟，提取1-2次，并合并濾液；②靈芝粗提液的濃縮濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾，濾液減壓濃縮至料液比(質(zhì)量/體積，單位千克/升)為1 :1-1:2;
③乙醇沉淀及洗滌向上述濾液中加入無水乙醇，至乙醇含量達(dá)到20% -30%，室溫靜置4-6小時(shí)，離心去除醇沉上清，收集沉淀，用20% -30%的乙醇洗滌沉淀2-3次；④干燥沉淀加水溶解，揮干乙醇后冷凍干燥即獲得所需的淺色高分子量靈芝多糖。本發(fā)明所制備的靈芝多糖質(zhì)量穩(wěn)定、有效成份含量高、分子量較大且色素少，高效液相色譜分析顯示多糖分子量大且分布均一，多糖含量大大提高，超過70 %。其制備方法是一種簡(jiǎn)便、快速、高效、成本低、無污染、多糖純度高的適合規(guī)?；a(chǎn)的方法。并且本發(fā)明所制備的靈芝多糖對(duì)RAW^H. 7巨噬細(xì)胞株釋放NO有明顯的促進(jìn)作用，可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬殺傷能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。靈芝中含有多種多糖成分，分子量的大小也各不相同，其活性也各不相同，本發(fā)明有效地富集了高活性的大分子量靈芝多糖，且所得多糖產(chǎn)品色淺，糖含量高，省去后續(xù)處理工藝，易于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。


圖1 靈芝多糖體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性測(cè)定結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1、靈芝粗多糖的提取以赤芝子實(shí)體(上海市農(nóng)科院食用菌研究所菌種保藏中心保藏的菌種編號(hào)為M42的靈芝菌種，經(jīng)人工栽培獲得)為原料，粉碎成粗粒，稱取^g，加入 20L水，室溫浸泡30min，加熱至沸騰，保持微沸90min，過濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取2 次，合并濾液。2、靈芝粗提液的濃縮濾液用120目的濾網(wǎng)(購自上海新華絲網(wǎng)商店)粗濾，再用 100微米的膜(購自上海弗立特公司)過濾，過濾液減壓濃縮至3L。3、乙醇沉淀及洗滌向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達(dá)到 20%,室溫靜置6h，離心去除醇沉上清，收集沉淀，用30%的乙醇洗滌沉淀2次。4、冷凍干燥沉淀加水溶解，揮干乙醇后置于-20°C冰箱中凍存池，然后再放到_80°C冰箱中冷凍3h，最后放入冷凍干燥機(jī)中凍干，即獲得所需的高分子量靈芝多糖。多糖含量的檢測(cè)用苯酚-硫酸法測(cè)定，精密稱取本品IOmg置IOOml容量瓶中，加水約80ml，加熱助溶后冷卻至室溫，在IOOml容量瓶中定容。精密吸取樣品1. 0ml，置15ml試管中，分別加入苯酚、硫酸試劑，充分反應(yīng)后在490nm處測(cè)定吸光度值，以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣品的糖含量。制備所得靈芝多糖的多糖含量為74. 21%。實(shí)施例2 1、靈芝粗多糖的提取以赤芝子實(shí)體(上海市農(nóng)科院食用菌研究所菌種保藏中心保藏的菌種編號(hào)為靈芝M42的菌種，經(jīng)人工栽培獲得)為原料，粉碎成粗粒，稱取1. 5kg,加入20L水，室溫浸泡30min，加熱至沸騰，保持微沸60min，過濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取 1次，合并濾液。2、靈芝粗提液的濃縮濾液用120目的濾網(wǎng)(購自上海新華絲網(wǎng)商店)粗濾，再用100微米的膜(購自上海弗立特公司)過濾，過濾液減壓濃縮至2L。3、乙醇沉淀及洗滌向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達(dá)到 25%,室溫靜置4h，離心去除醇沉上清，收集沉淀，用30%的乙醇洗滌沉淀3次。4、冷凍干燥沉淀加水溶解，揮干乙醇后置于-20°C冰箱中凍存池，然后再放到_80°C冰箱中冷凍3h，最后放入冷凍干燥機(jī)中凍干，即獲得所需的高分子量靈芝多糖。多糖含量的檢測(cè)用苯酚-硫酸法測(cè)定，精密稱取本品IOmg置IOOml容量瓶中，加水約80ml，加熱助溶后冷卻至室溫，在IOOml容量瓶中定容。精密吸取樣品1. 0ml，置15ml試管中，分別加入苯酚、硫酸試劑，充分反應(yīng)后在490nm處測(cè)定吸光度值，以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣品的糖含量。制備所得靈芝多糖的多糖含量為73. 47%。實(shí)施例3 靈芝多糖體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性測(cè)定1、樣品準(zhǔn)備精確稱取實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備得到的靈芝多糖樣品于滅過菌的印pendorf管中，用無菌的PBS配制成濃度5mg/mL的樣品液。充分溶解后以15000r/ min離心30min，無菌條件下將上清轉(zhuǎn)移至新的無菌印pendorf管中，將樣品稀釋成2mg/ml、 0. 5mg/ml 待用。2、細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的7巨噬細(xì)胞株(購自中科院細(xì)胞所)，用 DMEM完全培養(yǎng)基(購自Gibco公司)在37°C、含5% CO2條件下傳代培養(yǎng)，用0. 05%胰酶或5% EDTA溶液消化，混懸液lOOOrpm/min離心^iin后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)備用。3、試劑配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Griess試劑的配制在燒杯中加入6. 25ml H3PO3,加入蒸餾水250ml，分別加入 2. 5g 的 sulfanilamide (4-氨基苯磺酰胺，Sigma 公司)和 0. 25g 的 naphthyl ethylenediamine dihydrochloride (鹽酸萘乙二胺，Sigma公司)用磁力攪拌器至全部溶解，棕色試劑瓶4°C冰箱保存。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、 30、35、40 μ M共九個(gè)；取100 μ L于96孔板孔，加入50 μ L Griess試劑，測(cè)定543nm吸光值， 標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、樣品刺激巨噬細(xì)胞釋放NO量的測(cè)定收集7細(xì)胞，用無色RPMI1640培養(yǎng)基(購自Gibco公司)(10%胎牛血清+1%抗生素液體)將細(xì)胞稀釋至5X105/mL，加入 96孔板，每孔加入180 μ L，然后再加入20 μ L待測(cè)樣品，使得樣品終濃度依次為500 μ g/ml， 200 μ g/ml和50 μ g/ml,陽性對(duì)照為L(zhǎng)PS (終濃度為1 μ g/mL)，陰性對(duì)照為PBS, 37°C培養(yǎng)48 小時(shí)。取100 μ L上清于96孔板孔，加入50 μ 1 Griess試劑，室溫孵浴10分鐘，測(cè)定543nm 吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞NO的釋放量。結(jié)果見附圖1，由此結(jié)果可以看出，實(shí)施例1和實(shí)施例2所得的靈芝多糖對(duì) RAW264. 7巨噬細(xì)胞株釋放NO有明顯的促進(jìn)作用，可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬殺傷能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。
權(quán)利要求
1.一種淺色高分子量靈芝多糖，其特征在于由如下方法制備得到①靈芝粗多糖的提取以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入10-15倍重量的水中， 常溫浸泡30-60分鐘，加熱至沸騰，保持60-120分鐘，過濾；濾渣可再重復(fù)上述步驟，提取 1-2次，并合并濾液；②靈芝粗提液的濃縮濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾，濾液減壓濃縮至料液比為1:1-1:2;③乙醇沉淀及洗滌向上述濾液中加入無水乙醇，至乙醇含量達(dá)到20%-30%，室溫靜置4-6小時(shí)，離心去除醇沉上清，收集沉淀，用20% -30%的乙醇洗滌沉淀2-3次；④干燥沉淀加水溶解，揮干乙醇后冷凍干燥即獲得所需的淺色高分子量靈芝多糖。
2.一種制備權(quán)利要求1所述淺色高分子量靈芝多糖的方法，其特征在于該方法包括如下步驟①靈芝粗多糖的提取以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入10-15倍重量的水中， 常溫浸泡30-60分鐘，加熱至沸騰，保持60-120分鐘，過濾；濾渣可再重復(fù)上述步驟，提取 1-2次，并合并濾液；②靈芝粗提液的濃縮濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾，濾液減壓濃縮至料液比為1:1-1:2;③乙醇沉淀及洗滌向上述濾液中加入無水乙醇，至乙醇含量達(dá)到20%-30%，室溫靜置4-6小時(shí)，離心去除醇沉上清，收集沉淀，用20% -30%的乙醇洗滌沉淀2-3次；④干燥沉淀加水溶解，揮干乙醇后冷凍干燥即獲得所需的淺色高分子量靈芝多糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種淺色高分子量靈芝多糖及其制備方法。該淺色高分子量靈芝多糖是通過靈芝粗多糖的提取、靈芝粗提液的濃縮、乙醇沉淀及洗滌、干燥的方法制備得到。本發(fā)明所制備的靈芝多糖質(zhì)量穩(wěn)定、有效成份含量高、可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬殺傷能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102295709SQ20111018469
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月2日
發(fā)明者馮娜, 劉艷芳, 吳迪, 周帥, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 楊焱, 汪雯翰, 賈薇 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院