專利名稱：利用胸腺素α－1治療膠質(zhì)母細胞瘤的制作方法
相關(guān)申請資料本申請要求2001年12月10日遞交的臨時申請60/337,149的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明背景膠質(zhì)母細胞瘤是成人中最常見的原發(fā)性CNS惡性腫瘤，占原發(fā)性CNS惡性腫瘤的近75％。盡管由于神經(jīng)顯像術(shù)、顯微外科手術(shù)以及放射療法等的進步使得膠質(zhì)母細胞瘤的治療方法已經(jīng)有了穩(wěn)固的進步，但是該疾病仍然是不可治愈的(McDonald，2001；Burton，2000；Prados，2000)。診斷后的平均預(yù)期壽命少于1年，采用包括對可視腫瘤進行切除等急切治療后的五年生存率少于10％(Burton，2000；Nieder，2000；Napolitano，1999；Dazzi，2000)。膠質(zhì)母細胞瘤通過在腦中的快速、侵略性和浸潤性的生長而引起死亡。浸潤性生長的特性是這類腫瘤不能被切除的原因。
膠質(zhì)母細胞瘤還對放射療法以及化學(xué)治療具有相應(yīng)的抗性，因此治療后的復(fù)發(fā)率很高。此外，切除和放射治療后通過對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)并不能完全清除殘余的腫瘤細胞(Roth，1999；Dix，1999；Sablotzki，2000)。
惡性膠質(zhì)瘤細胞通過產(chǎn)生能夠損害T-細胞增殖和IL-2生成的免疫抑制肽來逃避宿主免疫系統(tǒng)的探測(Dix，1999)。甚至CNS也給予惡性膠質(zhì)瘤細胞某些特權(quán)使之能夠悄然生長。迄今仍在繼續(xù)尋找對患者進行膠質(zhì)母細胞瘤的有效治療手段。已經(jīng)利用許多模型來研究通過免疫治療、或者通過恢復(fù)免疫系統(tǒng)進行治療來對抗這些腫瘤細胞。在所研究的具有對抗惡性腫瘤能力的免疫相關(guān)因子中，胸腺素組分5(TF5)、胸腺素α-1(胸腺法新)、IFN-α、以及IL-2是其中的幾個。
卡莫司汀(雙氯乙基亞硝脲，BCNU或BiCNU)是氯乙基亞硝脲家族的化學(xué)治療劑，該家族還包括其它的化學(xué)治療劑，如氯脲菌素(DCNU)(Anderson，1975)、環(huán)己亞硝脲(CCNU)(Carter，1968)、尼莫司汀(Sai jo，1980)以及雷莫司汀(Sekido，1979)。多年以來氯乙基亞硝脲類僅被用原發(fā)性腦瘤的單一化學(xué)療法的治療劑；但是，歷史數(shù)據(jù)表明，采用這些化合物作為單一藥劑來治療腦部腫瘤并非特別有效(e.g.，Aquafedda，et al.)。與僅采用放射療法相比，采用卡莫司汀與放射療法聯(lián)合進行治療能夠適度增加惡性膠質(zhì)母細胞瘤病人的長期存活時間(18個月)，盡管生存曲線之間并未具有0.05水平的顯著性差異(Walker，1980)。
胸腺素α-1(胸腺法新)是一種28個氨基酸的肽，其為循環(huán)中天然存在的化合物的合成形式(Bodey，2000；Bodey，2001)。胸腺法新刺激胸腺細胞生長和分化，生成IL-2、T細胞IL-2受體、IFN-γ以及IFN-α(Andreone，2001；Sztein，1989；Knutsen，1999；Spangelo，2000；Tijerina，1997；Garbin，1997；Attia，1993；Cordero，1992；Baxevamis，1994 & 1990；Beuth，2000)。胸腺法新在臨床試驗中被用于治療乙型肝炎病毒感染(Chan，L-Y，2001)、丙型肝炎感染(Chan，H.L.，2001；Sherman，1998；Schinazi)、肺或頭和頸部癌癥、黑色素瘤(Bodey，2000& 2001；Garaci，2000)、以及AIDS(Billich，2002)。這些研究所得到的有希望的結(jié)果及T細胞對膠質(zhì)母細胞瘤的反應(yīng)性降低的證據(jù)引導(dǎo)了本發(fā)明對采用胸腺素免疫療法來治療惡性膠質(zhì)瘤的潛在治療益處進行研究，并確定了胸腺法新抗腫瘤作用的機理。
發(fā)明概述膠質(zhì)母細胞瘤是高級、惡性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，通常在診斷后12個月內(nèi)致命。近來的研究表明采用諸如IL-2或IL-12等炎癥前細胞因子能夠延長膠質(zhì)母細胞瘤病人的存活時間。胸腺素α-1(胸腺法新)是一種能作為免疫調(diào)節(jié)劑的胸腺肽，其能增加IL-2的生成以及T-細胞的增殖。本發(fā)明的工作證實，與其它組相比，在以胸腺法新+BCNU進行治療的患者中，顯著降低了腫瘤負荷并增加了淋巴-單核炎癥細胞的反應(yīng)。體外試驗證實，胸腺法新對培養(yǎng)的9L細胞的生存能力或者線粒體的功能都沒有直接的影響。但是，胸腺法新能顯著增加促細胞凋亡基因的表達，包括FasL，F(xiàn)asR以及TNFa-IR(分別為65.89％，44.08％和22.18％)。此外，胸腺法新還增加了9L細胞對氧化應(yīng)激的敏感性，例如用常規(guī)非致死劑量的H2O2就能殺死30~50％的胸腺法新處理后的9L細胞。進一步的研究表明胸腺法新增強了9L細胞對端粒酶B-(T細胞)或BCNU介導(dǎo)的殺傷的敏感性。這些結(jié)果表明胸腺法新在體內(nèi)增強了氯乙基亞硝脲對膠質(zhì)母細胞瘤的清除作用，胸腺法新的上述作用是通過活化促細胞凋亡機制，使腫瘤細胞對氧化應(yīng)激的敏感性增加，以及通過端粒酶B(T細胞)的殺傷作用或者化學(xué)治療等來實現(xiàn)的。


圖1顯示胸腺法新對9L細胞的存活性以及線粒體功能的最小作用。
圖2顯示了胸腺法新作用72小時后9L細胞中促細胞凋亡基因表達的增加。
圖3顯示了胸腺法新使9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞對氧化應(yīng)激或者BCNU化學(xué)治療的殺傷作用更加敏感。
圖4顯示了胸腺法新使9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞對端粒酶B-介導(dǎo)的殺傷作用更加敏感；圖4A顯示將細胞與藥物溶劑或胸腺法新(24小時-急性，72小時-慢性)相接觸，然后再用藥物溶劑處理1小時后的效果；圖4B顯示將細胞與藥物溶劑或胸腺法新(24小時-急性，72小時-慢性)相接觸，然后再用藥物溶劑處理3小時后的效果。
圖5顯示向成年Long Evans大鼠的右額葉植入10,000的9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞后臨床神經(jīng)病理異常發(fā)展的時間曲線。
圖6顯示了BCNU和BCNU+胸腺法新(THY)在體內(nèi)對膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)展的作用。
圖7顯示了用BCNU+胸腺法新(THY)處理大鼠降低了膠質(zhì)母細胞瘤的負荷并且治愈了25％。
發(fā)明詳述現(xiàn)今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胸腺法新能夠增強對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的免疫介導(dǎo)殺傷作用，這使得它能作為佐劑與氯乙基亞硝脲類化學(xué)治療化合物聯(lián)合使用從而有效治療膠質(zhì)母細胞瘤。
本發(fā)明可應(yīng)用的胸腺法新(TA1)肽類包括天然存在的TA1、具有天然TA1的氨基酸序列的合成TA1和重組TA1、與其基本類似的氨基酸序列或其簡短序列形式(abbreviated sequence form)、以及與TA1具有基本相似生物活性的取代、缺失、延長、替換、或者修飾的序列的生物活性類似物，例如，與TA1具有足夠同源性的TA1衍生肽，其與TA1幾乎通過同樣的方式產(chǎn)生幾乎同樣的活性。
利用膠質(zhì)母細胞瘤實驗?zāi)Ｐ偷捏w內(nèi)研究表明，盡管BCNU確實能夠明顯降低腫瘤負荷，但反應(yīng)各不同，有許多實驗?zāi)Ｐ投紮z測不到有反應(yīng)產(chǎn)生。但是，采用胸腺法新+BCNU進行治療卻具有同時能夠降低平均腫瘤負荷并治愈約25％的腫瘤的治療益處。胸腺法新+BCNU所介導(dǎo)的對腫瘤負荷的降低作用與其增加腦中腫瘤細胞內(nèi)以及腫瘤細胞周圍的淋巴-單核細胞的浸潤相關(guān)。對于找不到殘存腫瘤的試驗?zāi)Ｐ?，僅能檢測到與原發(fā)性腫瘤細胞浸潤相關(guān)聯(lián)的膠質(zhì)增殖組織以及不足的炎癥。在低劑量和高劑量的胸腺法新+BCNU處理組觀察到約25％的膠質(zhì)母細胞瘤被治愈。
一個未曾預(yù)料的發(fā)現(xiàn)就是僅用胸腺法新治療的組與對照組相同或者更差。由于炎癥以及與腫瘤生長相關(guān)的浮腫，使得胸腺法新處理大鼠的腦經(jīng)常具有更加嚴重的腫脹及疝出。在這里需要注意的是，以低濃度胸腺法新±BCNU處理的大鼠比用高濃度的胸腺法新±BCNU處理的大鼠具有更好的結(jié)果，這是由于在兩種處理方式中腫瘤細胞的殺傷是類似的，但是接受高濃度胸腺法新組具有更普遍性的浮腫及疝出。
因此，僅采用胸腺法新進行治療并不能消除膠質(zhì)母細胞瘤，而且由于不能殺滅腫瘤細胞而導(dǎo)致過度的腫脹還可能產(chǎn)生有害的作用。這些結(jié)果進一步表明胸腺法新幾乎沒有或者沒有直接的殺傷腫瘤細胞的作用，而這種作用卻在胸腺法新+BCNU的治療中得到了，且其中的作用是通過胸腺法新的間接作用介導(dǎo)的。在胸腺法新處理大鼠的腦中，發(fā)現(xiàn)主要為T細胞和巨噬細胞的淋巴-單核炎癥細胞的密度增加，這說明胸腺法新在增加針對惡性細胞的效應(yīng)免疫細胞中發(fā)揮重要的作用。
進行了一系列的體外實驗來確定胸腺法新介導(dǎo)的抗膠質(zhì)母細胞瘤作用的機理。最初的研究表明胸腺法新對膠質(zhì)母細胞瘤細胞并沒有顯著的直接的細胞毒作用。其對包括神經(jīng)母細胞瘤細胞以及有絲分裂后皮質(zhì)神經(jīng)原等其它的細胞種類的作用相同。為擴充這一研究，我們對胸腺法新是否反過來影響細胞功能以及是否使細胞更容易凋亡進行了研究。因此，我們檢測了促凋亡和促存活基因以及生長和看家基因的表達水平。這些研究揭示，胸腺法新處理24或72小時顯著增加9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞中促細胞凋亡基因的水平。在Sy5y神經(jīng)母細胞瘤細胞中也得到類似的結(jié)果。同樣記錄了在293細胞中的現(xiàn)象，但在該細胞中，促存活機制被抑制，促凋亡基因并未受影響。這些發(fā)現(xiàn)暗示，盡管胸腺法新沒有直接的細胞毒作用，但是其可以通過增加促細胞凋亡基因的基礎(chǔ)表達或者降低存活基因的基礎(chǔ)表達使細胞對細胞毒試劑的敏感性增加。為了驗證這一假說，我們檢測胸腺法新處理的細胞是否對氧化應(yīng)激或者氯乙基亞硝脲類介導(dǎo)的細胞殺傷作用更加敏感。該研究表明，胸腺法新處理24或72小時以后，亞致死濃度的H2O2或者BCNU分別殺死了25％或40％的9L細胞。因此，胸腺法新的至少一部分作用是通過其對腫瘤細胞的作用而介導(dǎo)的，而不完全是源于免疫調(diào)節(jié)以及T細胞和巨噬細胞數(shù)的增加。
已經(jīng)確定了胸腺法新及相關(guān)分子的免疫調(diào)節(jié)特性。其主要作用是增加致炎細胞因子的生成以及淋巴細胞的增殖?；罨腡淋巴細胞通過FasL-FasR的相互反應(yīng)以及通過活化穿孔素-端粒酶系統(tǒng)來殺傷靶細胞。在胸腺法新處理的9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞中發(fā)現(xiàn)FasL/FasR的表達增加，這說明活化的T細胞能夠通過FasL/FasR的相互作用來有效殺傷這些靶細胞。但是，利用通過SLO(透化劑)以及重組端粒酶B而非活化的T細胞構(gòu)建的新的體外檢測方法，我們證實，胸腺法新處理的9L膠質(zhì)母細胞瘤能夠被所接觸的SLO和端粒酶B快速殺死。這些發(fā)現(xiàn)證實，胸腺法新通過下述途徑有效促進免疫介導(dǎo)殺傷膠質(zhì)母細胞瘤細胞的作用1)增加促細胞凋亡基因表達的基礎(chǔ)水平，從而使細胞對氧化應(yīng)激和細胞毒/化學(xué)治療制劑更加敏感；2)增加FasR的水平，使之能夠與活化了的T細胞上的FasL相反應(yīng)，從而增加凋亡；以及3)增加活化T細胞和巨噬細胞并增加穿孔素-端粒酶介導(dǎo)的對腫瘤靶細胞的殺傷作用。此外，這些結(jié)果還明顯表明，對膠質(zhì)母細胞瘤采用胸腺法新和氯乙基亞硝脲聯(lián)合應(yīng)用進行治療是有效的，但是胸腺法新并不能作為單獨應(yīng)用的制劑。這一結(jié)果為單獨應(yīng)用胸腺法新是有害的提供了實質(zhì)的證據(jù)，其中胸腺法新的有害作用是由于腫脹和炎癥，而只有極小的根除腫瘤細胞的作用。因此，在治療膠質(zhì)母細胞瘤中，胸腺法新最適宜的用途是做為提高宿主免疫反應(yīng)的佐劑并根除逃過了傳統(tǒng)的化學(xué)治療的殘余腫瘤細胞。
總的說來，本文的工作證實了胸腺法新具有抗膠質(zhì)母細胞瘤的作用，該作用是通過以下幾個途徑介導(dǎo)的1)調(diào)節(jié)促凋亡/存活基因，從而增加腫瘤細胞對氧化應(yīng)激或者細胞毒/化學(xué)治療制劑的敏感性；2)促進FasR-FasL介導(dǎo)的免疫細胞殺傷級聯(lián)反應(yīng)；以及3)增加靶細胞對穿孔素-端粒酶介導(dǎo)的免疫細胞殺傷作用的敏感性。但是，胸腺法新抗膠質(zhì)母細胞瘤的治療作用依賴于共同給予氯乙基亞硝脲，這強調(diào)了胸腺法新最適于作為輔佐免疫調(diào)節(jié)劑而非純粹的抗腫瘤劑。類似地，當(dāng)與其它化療化合物聯(lián)合應(yīng)用時，胸腺法新具有類似的協(xié)助降低腫瘤負荷的積極作用，可觀察到比傳統(tǒng)的化學(xué)治療更顯著的好轉(zhuǎn)速度。
本發(fā)明可使用天然的(即，天然存在的)胸腺法新，也可以使用含有天然胸腺法新的氨基酸序列的合成胸腺法新和重組胸腺法新、與其基本類似的氨基酸序列或其簡短序列形式、以及與胸腺法新具有基本相似生物活性的具有取代、缺失、延長、替換、或者修飾序列的生物活性類似物，其與胸腺法新幾乎通過同樣的方式產(chǎn)生幾乎同樣的活性。
在諸如美國專利No.4,079,127、No.4,353,821、No.4,148,788、以及No.4,116,951中描述了胸腺法新的分離、特征以及應(yīng)用。能夠通過常規(guī)的劑量滴定實驗來確定能夠產(chǎn)生BCNU化學(xué)治療所需的增強效果的胸腺法新的劑量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予高至16mg/kg體重/天的胸腺法新時，其對人體仍是安全的。胸腺法新的優(yōu)選劑量在0.001mg/kg體重/天至10mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，最優(yōu)選的劑量為約0.02mg/kg體重/天。
氯乙基亞硝脲的給藥劑量為約90-250mg/m2，可通過注射、口服、通過可生物降解的薄片、或本領(lǐng)域已知的其它任意方便的方式進行給藥。其可通過單劑量進行給予，或者分成連續(xù)兩天每天注射75至100mg/m2的劑量。應(yīng)根據(jù)前一劑量病人的血液學(xué)反應(yīng)來對最初劑量進行調(diào)整。應(yīng)每周監(jiān)測血球計數(shù)，并且由于血液毒性的延遲性和蓄積性，不應(yīng)在6周之前給予重復(fù)的療程。優(yōu)選的氯乙基亞硝脲應(yīng)能夠每六周通過靜脈內(nèi)注射150-200mg/m2的劑量。BCNU還可通過直接向腫瘤床植入可生物降解的薄片(例如Gliadel，Guilford Pharmaceuticals)來進行給藥。如果是通過可生物降解的薄片給藥的，則共同給予的胸腺法新能夠方便地直接在薄片上與BCNU進行聯(lián)合。
實施例1用胸腺素α1處理9L和293腫瘤細胞系腫瘤細胞系用添加了5％ FCS、2mM L-谷氨酰胺、以及100μM非必需氨基酸(Gibco-BRL，Grand Island，NY)的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)對大鼠9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞以及293人腎細胞進行培養(yǎng)。所有細胞系置于含有5％ CO2的37℃的濕潤大氣環(huán)境下。所有細胞系購自美國典型培養(yǎng)物中心且證實不含有病原體。
胸腺素a1處理對胸腺法新急性處理，將細胞種于96孔培養(yǎng)板中，細胞密度為20,000細胞/孔，用10-5M的胸腺法新處理24小時。用胸腺法新慢性處理的細胞接種于培養(yǎng)瓶中，在進行處理的期間內(nèi)(3天)每24小時用10-5M的胸腺法新(加入至新鮮培養(yǎng)基中)進行處理。此外，為了確定9L細胞對胸腺法新的劑量反應(yīng)曲線，將細胞用系列稀釋劑量的胸腺法新進行處理，其中胸腺法新的濃度在50uM至0.022uM的范圍內(nèi)。
用H2O2刺激細胞的氧化應(yīng)激。將采用胸腺法新或者藥物溶劑處理24小時的細胞用濃度為9μM至1.8mM的H2O2進行處理，然后利用所述的CV和MTT檢測來評價存活率和線粒體功能。在采用系列稀釋劑量的胸腺法新處理細胞的實驗中，采用固定的1.8mM的H2O2來處理細胞。為了確定處理9L細胞的準確H2O2濃度，制作了H2O2曲線。
為確定胸腺法新處理和/或H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對細胞線粒體功能的影響，對9L和293細胞進行了MTT實驗。處理后，向每個含有100μl培養(yǎng)基的孔中加入10μl的MTT溶液。將加入了MTT染料的培養(yǎng)板在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15分鐘~1小時，該時間取決于細胞種類。然后移去培養(yǎng)基，每孔加入200μl的酸性異丙醇。將培養(yǎng)板在室溫下震搖至細胞裂解，然后在Packard SpectraCountTM儀器上讀540nm的值。
還利用結(jié)晶紫(CV)來對96孔培養(yǎng)板上的細胞進行染色。棄去培養(yǎng)基后，每孔中加入20μl的結(jié)晶紫，在室溫下震搖10分鐘。然后將培養(yǎng)板用溫水洗滌幾次并干燥。向每孔中加入100-200μl(依賴于細胞密度)的PBS w/1％ SDS。將培養(yǎng)板置于震蕩器上于室溫下孵育直至細胞充分裂解。在540nm下讀數(shù)，以檢測所測試的不同組之間細胞存活率的差別。
對9L和293細胞進行了微量滴定免疫細胞化學(xué)ELISA(MICE)檢測(dela Monte，1999)。將細胞接種于96孔板，用10-5M的胸腺法新處理24小時，在用MICE檢測分析前組織固定過夜。將固定的細胞用溶于Tris-緩沖鹽水(50mM Tris，pH7.5，0.9％ NaCl；TBS)中的0.05％的皂甙進行滲透，以Superblock-TBS(Pierce，Rockford，IL)進行封閉，然后與增殖細胞核抗原(PCNA)、bcl-2、p21/Wwaf-1、p53、FasL、FasR、TNF-R1、或者GAPDH的一抗在4℃過夜孵育，其中所有抗體都以含有0.05％ Tween-20和0.5％牛血清白蛋白的TBS(TBST-BSA)稀釋為0.5-lμg/ml的濃度。利用偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的二抗(Pierce，Rockford，IL)以及TMB可溶性底物(Pierce，Rockford，IL)來檢測免疫反應(yīng)性。通過加入1M H2SO4來停止反應(yīng)，利用Spectracount microplate reader(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)測量450nm的吸光度。接下來，通過考馬斯亮藍染料對附著的細胞進行染色并測定洗脫染料的吸光度(de la Monte，1999)，以此來測定細胞密度。在同一培養(yǎng)孔中計算TMB和考馬斯亮藍吸光度的比值并以此作為MICE指數(shù)。利用16個重復(fù)培養(yǎng)孔所得結(jié)果的Mean±S.D.值進行組間統(tǒng)計比較。
采用不同濃度的胸腺法新處理24小時的9L細胞的實驗表明，線粒體功能顯著降低，如MTT檢測所示(圖1)。之所以檢測線粒體功能是由于細胞死亡可通過線粒體功能障礙來介導(dǎo)而非通過凋亡或者壞死來介導(dǎo)。該研究顯示，在藥物溶劑處理的對照組以及胸腺法新處理的培養(yǎng)物中具有類似水平的存活率以及MTT活性(圖1)，顯示胸腺法新對9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞并沒有直接的細胞毒作用，這與體內(nèi)實驗是一致的。在對包括293腎細胞以及SH-Sy5y神經(jīng)元細胞的其它細胞系也得到了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
由于胸腺法新并沒有直接的細胞毒作用，因此探索了胸腺法新抑制膠質(zhì)母細胞瘤的其它可能機制。在這一方面，利用看家基因的表達作為對照，檢測了促進凋亡或細胞存活的基因產(chǎn)物的表達。在96孔板上進行微量滴定免疫細胞化學(xué)ELISA(MICE)檢測(de la Monte，1999)以得到多個重復(fù)培養(yǎng)物的數(shù)據(jù)。胸腺法新處理24小時后，于藥物溶劑對照相比，下述物質(zhì)的表達水平顯著增加(P＜0.01；圖2)FasR(44.08％)、FasL(65.89％)、以及TNF-R1(22.18％)。但是，胸腺法新處理并未顯著影響bcl-2和GAPDH的表達水平。還利用293細胞進行了研究，結(jié)果顯示bcl-2顯著降低(36.67％；P＜0.01)，但是FasR，F(xiàn)asL，或TNF-R1的表達水平?jīng)]有顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，MICE檢測的結(jié)果表明，胸腺法新對這兩種細胞系通過不同的途徑來增加細胞通過凋亡途徑死亡的敏感性。
利用H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激實驗來檢測胸腺法新增加9L和293細胞對凋亡敏感性的能力。如MTT檢測結(jié)果所示，與僅用H2O2處理24小時的9L細胞相比較，以胸腺法新處理24小時并隨后用H2O2處理24小時的9L細胞的確表現(xiàn)出存活率顯著降低(圖3)。與僅用270μM H2O2處理的9L細胞相比，以胸腺法新和270μM H2O2處理的9L細胞通過MTT測定的線粒體功能下降了26.6％(圖3)。在以293細胞作為把細胞也得到了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例2端粒酶誘導(dǎo)的凋亡研究上述的MICE檢測研究證實，胸腺法新在9L膠質(zhì)母細胞瘤中誘導(dǎo)了TNF-R1、FasL和FasR的表達。為了確定以胸腺法新處理(或未處理)的9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞對細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)誘導(dǎo)的凋亡的敏感性的差別，進行下述實驗檢測將9L細胞用胸腺法新急性處理24小時以及慢性處理72小時，然后收集細胞，重新接種于96孔黑培養(yǎng)板中(7.5×105細胞/75μl/孔)，然后與20,000單位/ml的鏈球菌溶血素O(SLO)加上100ng重組端粒酶B(反應(yīng)體積為100μl)在37℃相接觸1或3小時。以SLO代替穿孔素穿透細胞，利用重組端粒酶B使檢測標準化。對照研究包括無SLO、無端粒酶B、或者二者皆無的平行反應(yīng)。利用ATPlite對細胞密度為每培養(yǎng)孔103至106的細胞進行檢測(Packard Instrument Company，Meriden，CT)以測量存活細胞的密度，該檢測具有與相對光單位有關(guān)的寬線性動力學(xué)范圍。
在體內(nèi)，惡性腫瘤細胞被細胞毒T細胞和巨噬細胞所殺傷，所述的細胞毒T細胞和巨噬細胞可通過諸如IL-2以及IL-12等致炎細胞因子而得到補充。細胞毒T細胞通過釋放穿孔素和端粒酶B進行殺傷，其中穿孔素能夠在靶細胞膜產(chǎn)生孔洞，端粒酶B能夠破壞酶，從而引起靶細胞的死亡。為了研究胸腺法新增強T細胞介導(dǎo)的9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞的殺傷作用機理，使用了一種體外檢測，在該檢測中，胸腺法新或者對照處理的9L細胞在鏈球菌溶血素0(穿透劑)存在或不存在的條件下與端粒酶B一同孵育1或3小時。利用ATP發(fā)光實驗來檢測生存能力，在組內(nèi)進行比較以確定與SLO+端粒酶B處理相關(guān)聯(lián)的相對殺傷。該項研究證實，與僅由SLO、端粒酶B或者藥物溶劑對照進行處理的胸腺法新處理物相比較，胸腺法新處理的培養(yǎng)物采用SLO+端粒酶B進行處理后細胞存活力顯著降低(p＜0.001；圖4A和4B)。此外，端粒酶B介導(dǎo)的殺傷作用隨著時間的延長而增強，這可由與SLO+端粒酶B孵育3小時后比孵育1小時后具有更多的細胞損失而得到證實(圖4A和4B)。但是，當(dāng)采用SLO、端粒酶B、藥物溶劑、或者SLO+端粒酶B處理時，藥物溶劑對照的培養(yǎng)物表現(xiàn)出類似的生存力。在這些研究中，與在檢測前以胸腺法新處理72小時(慢性)相比，急性(24小時)胸腺法新處理具有更高程度的端粒酶B+SLO介導(dǎo)的細胞殺傷作用(圖4)。
實施例3胸腺法新對原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的細胞存活力的作用研究了原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物以確定不會對非腫瘤腦細胞產(chǎn)生毒性的胸腺法新的劑量。由于前述研究已經(jīng)表明隨著細胞密度從每孔1×104至5×105進行變化，CV和MTT吸光度亦隨之呈線性增加(de la Monte，2001 & 2000)，因此利用結(jié)晶紫(CV)和MTT實驗來測定細胞存活力以及線粒體功能。
用系列稀釋的胸腺法新(終濃度在3.3×10-5M to 1×10-9M范圍內(nèi)變化)處理96孔培養(yǎng)板中的原代神經(jīng)元皮質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)在所用的實驗劑量下，細胞存活力并未降低。通過MTT檢測可以發(fā)現(xiàn)，所用的最高濃度的胸腺法新(3.3×10-7M)確實使存活力降低了30％。但是，該劑量要高于所用的實驗以及臨床劑量。
實施例4對大鼠膠質(zhì)母細胞瘤采用胸腺法新體內(nèi)輔佐治療大鼠9L膠質(zhì)母細胞瘤細胞源自美國典型培養(yǎng)物中心(Washington，D.C.)并證實不含有病原體。將細胞置于添加了5％胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中。未向培養(yǎng)基中加入抗體。在注射前，將細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，用0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA使細胞從培養(yǎng)表面脫離，游離為單細胞懸液。用無血清的DMEM洗滌游離的細胞3次，最后將其懸浮于無血清的DMEM中，細胞密度為5×106活細胞/ml。利用臺盼藍排除以及血細胞計數(shù)器來確定活細胞密度。
設(shè)計實驗以確定與給予雙氯乙基亞硝脲(BCNU)相比，單獨給予胸腺法新或者與BCNU聯(lián)合給予是否能顯著降低膠質(zhì)母細胞瘤負荷。利用成年(250-300克)Long Evans大鼠創(chuàng)建膠質(zhì)母細胞瘤的體內(nèi)模型。將大鼠通過單次腹腔注射溶于50％乙醇的100mg/kg氯胺酮和100mg/kg賽拉嗪進行麻醉。麻醉后，剔光頭部，用聚乙烯吡咯碘酮預(yù)處理(prep)，然后將大鼠置于立體定位架上。在額葉沿正中線切開，用3mm鉆錐鉆孔，利用與Hamilton注射器相連的26號針頭直接向腦中注射2μl的9L膠質(zhì)瘤細胞懸液(總共10,000細胞)，注射深度為3.5mm。移走針頭后，用無菌生理鹽水洗滌傷口，將動物移下定位架，用可吸收縫合線縫合皮膚。將大鼠放回籠中，觀察任何惡化的信號，包括體重降低、食水?dāng)z取減少、輕微偏癱、癲癇、或者不活動等。如果觀察到任何程度的患病，則用120mg/kg的戊巴比妥鈉對動物實施安樂死。每天觀察動物，每周稱取動物的體重。一般經(jīng)驗是，如注射10,000個9L細胞，則在26天內(nèi)100％的動物會被殺死。
讓腫瘤生長5天，然后進行抗腫瘤治療。將大鼠分成6組藥物溶劑對照組；低劑量(45μg/kg)胸腺法新組；高劑量(200μg/kg)胸腺法新組；低劑量胸腺法新+BCNU組；高劑量胸腺法新+BCNU組；以及僅給予BCNU(9.4mg/kg)組。在腦內(nèi)腫瘤接種后第6天通過單劑量腹腔注射(I.P.)給予BCNU。用胸腺法新處理的大鼠，從腫瘤接種后第6天開始連續(xù)3天單劑量腹腔注射胸腺法新。在腫瘤接種后第20天處理動物。通過腹腔注射120mg/kg的戊巴比妥鈉殺死動物。取腦，切片，用Histochoice(Amresco Co.，Solon，Ohio)浸潤固定，然后石蠟包埋。利用全組織塊和以蘇木精-伊紅染色的組織切片對腫瘤負荷進行評測。還采用免疫組織化學(xué)染色研究對組織切片的免疫細胞浸潤進行了研究。
膠質(zhì)母細胞瘤模型用10,000個9L大鼠膠質(zhì)母細胞瘤細胞對成年Long Evans大鼠進行腦內(nèi)接種，該細胞可再生地產(chǎn)生腫瘤，并逐漸增大，在21天內(nèi)導(dǎo)致死亡。腫瘤生長的時間依賴性過程以及相關(guān)的臨床癥狀具有下述特性1)在第7天時腫瘤直徑為4-5mm，身體活動增加；2)在第14天時腫瘤直徑為7-8mm，經(jīng)常觀察到與體內(nèi)腫瘤有關(guān)的出血，具有高反應(yīng)性；以及3)在第21天時腫瘤塊為10-12mm，形成小腦疝，動物嗜睡(圖5)。用蘇木精-伊紅對組織切片染色的結(jié)果證實了含有浸潤性惡性腫瘤細胞的大腫瘤塊的存在。利用全腦對冠狀切片的組織病理學(xué)研究證實，9L細胞接種5天內(nèi)，腫瘤細胞形成小腫瘤塊，該小腫瘤塊位于表層皮質(zhì)層，覆蓋軟腦膜。在14天內(nèi)，腫瘤塊延伸至包括基底核和側(cè)腦室壁的深層結(jié)構(gòu)中，具有中度水腫，但無疝出(移至正中線結(jié)構(gòu))。至第21天，腫瘤塊幾乎占據(jù)了全部的右額葉，并對另一側(cè)面的腦半球具有不同程度的延伸(圖3)。擴張的腫瘤塊造成標志性的腦浮腫、出血、以及疝出。
利用半定量的組織學(xué)分級量表來評估腫瘤負荷從而進行組間比較0-治愈，沒有殘余腫瘤；1-被限制在表層皮質(zhì)層的顯微可見的腫瘤(＜1mm)；2-腫瘤塊占據(jù)了少于25％的腦半球橫切面(1-2mm)；3-腫瘤塊占據(jù)了多至50％的腦半球橫切面(2-3mm)，并延伸至深層結(jié)構(gòu)；4-占據(jù)了50-90％腦半球橫切面的大腫瘤負荷，并有疝出。分別由兩個不知道如何對組別進行處理的人對切片進行編號并同時分級。為了保證分級的一致性，將所有樣品打亂根據(jù)編號重新觀察。
胸腺法新和BCNU對膠質(zhì)母細胞瘤生長的作用(圖6)由于在最初的研究中并未觀察到自發(fā)的腫瘤排斥，因此在9L膠質(zhì)母細胞瘤植入20天后終止所有的實驗。以藥物溶劑處理的大鼠與未處理的動物表現(xiàn)出同樣的時間依賴性腫瘤生長以及臨床征狀。與藥物溶劑對照組相比，以BCNU治療的大鼠表現(xiàn)出腫瘤塊的明顯減小。但是，反應(yīng)性卻并不同一，幾乎一半的組沒有明顯的治療反應(yīng)。在其余的動物中，腫瘤負荷降低至50％。僅用胸腺法新治療的大鼠具有與對照組類似的腫瘤生長以及臨床惡化。而且，與包括對照組的其它組相比，胸腺法新治療的大鼠具有嚴重的腦內(nèi)腫脹以及高程度的疝出(腦組織通過鉆孔突出)。相反，胸腺法新+BCNU組具有最低的腫瘤負荷，其腫瘤具有肉眼可見的縮小。采用標準化的分級方案來評估腫瘤負荷，我們證實與藥物溶劑或者胸腺法新(低劑量或高劑量)治療組相比，僅用BCNU進行治療顯著降低了腫瘤負荷(P＜0.001)，以低劑量(45μg/kg)或者高劑量(200μg/kg)胸腺法新+BCNU進行治療的大鼠具有最小的平均腫瘤負荷(圖6)。進一步的研究證實了胸腺法新+BCNU治療組降低了腫瘤負荷并具有25％的治愈率，因此增加了臨床和病理改善(P＜0.001；圖7)。
組織病理學(xué)也證實了與腫瘤灶相接部位以及腫瘤灶內(nèi)存在淋巴-單核炎癥細胞。在藥物溶劑或者BCNU處理的大鼠腦內(nèi)，浸潤并不完全，主要分布在血管周間隙。在胸腺法新或胸腺法新+BCNU進行治療的大鼠中，炎癥細胞的浸潤很顯著并與腫瘤塊以及毗鄰的腦實質(zhì)相連，且覆蓋了軟腦膜。免疫組化染色研究證明這些細胞為T淋巴細胞和巨噬細胞。以高劑量胸腺法新或高劑量胸腺法新+BCNU治療的大鼠比僅以低劑量胸腺法新處理的大鼠具有更嚴重的腦腫脹。組織病理學(xué)以及免疫組織化學(xué)染色研究證實了高劑量胸腺法新處理組中，更嚴重的浮腫以及炎癥反應(yīng)與腫瘤塊相關(guān)聯(lián)。
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權(quán)利要求
1.一種治療膠質(zhì)母細胞瘤的方法，其包括聯(lián)合給予氯乙基亞硝脲以及胸腺素-αl(TAl)肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述氯乙基亞硝脲為BCNU。
3.權(quán)利要求2的方法，其中BCNU以150-200mg/m2的劑量給藥。
4.權(quán)利要求1的方法，其中(TAl)肽為胸腺素-αl，其以0.001mg/kg體重/天至10mg/kg體重/天的劑量給藥。
5.權(quán)利要求4的方法，其中胸腺素-αl以0.02mg/kg體重/天的劑量給藥。
全文摘要
利用胸腺素α－1作為佐劑與卡莫司汀(BCNU)聯(lián)合用于對惡性膠質(zhì)母細胞瘤進行有效治療。
文檔編號A61K45/06GK1615147SQ02827081
公開日2005年5月11日 申請日期2002年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月10日
發(fā)明者杰克·R·萬茲, 蘇珊·德拉·蒙特 申請人:羅得島醫(yī)院