專利名稱：2’，4’－二羥基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查爾酮用于制備抗癌藥物的新用途的制作方法
專利說明2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮 用于制備抗癌藥物的新用途 本發(fā)明涉及一種2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮(2’，4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’，5’-dimethylchalcone)用于制備抗癌藥物的新用途。癌癥是當(dāng)前對人類健康和生活質(zhì)素危害最大的疾病之一?？拱┧幬锏拈_發(fā)一直是科學(xué)家們研究的熱點課題。由于癌癥發(fā)生機制的復(fù)雜性和特殊性，尋找高選擇性、高效及低毒副作用抗癌藥物努力，并未取得理想的結(jié)果。
血管內(nèi)皮生長因子受體在腫瘤血管生成、腫瘤生長中起重要的作用。針對血管生成抗腫瘤，不同于常規(guī)化療，血管生成抑制劑主要是針對腫瘤賴以生存的血管，而非直接針對腫瘤細胞，因此抗腫瘤的選擇性高、療效好、毒性低。特異性血管生成抑制劑不應(yīng)該有引起骨髓抑制，胃腸道反應(yīng)以及脫發(fā)等副作用，這并不是說該類藥物沒有副作用，但根據(jù)其作用特點，應(yīng)該選擇性高，毒副作用小?？偟膩碚f，血管生成抑制劑下調(diào)新生血管，是通過抑制細胞增殖和遷移，而不是通過細胞毒作用。目前，有許多抗血管生成抑制劑處于治療腫瘤的研究之中，針對血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶的小分子藥物如SU6668已完成臨床前研究，準(zhǔn)備進行臨床試驗，但國際上至今還沒有一個正式被批準(zhǔn)的針對血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶的抗腫瘤藥物。近年來，針對抗血管生成治療腫瘤研究已成為一大研究熱點，給腫瘤治療帶來新的希望。本發(fā)明以血管內(nèi)皮細胞生長因子受體為靶點，篩選了一系列化合物，發(fā)現(xiàn)新鮮水翁花蕾中分離得到的2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮(2’，4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’，5’-dimethylchalcone，簡稱為查爾酮衍生物ZW-ON-III)在1-10μg/mL濃度下對血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶有強力抑制作用；隨后研究證明了2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮對血管內(nèi)皮細胞生長有顯著抑制作用，同時對其它幾種人癌細胞株體外生長有一定的抑制作用，對人癌細胞裸鼠移植瘤生長有強烈的抑制作用。
本發(fā)明提供一種使用如下所示的查爾酮衍生物ZW-ON-III結(jié)構(gòu)式或與它的藥學(xué)組合物制劑用于治療腫瘤的藥物。
2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮為來自植物的天然化合物或來自化學(xué)合成的人工產(chǎn)物。
2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮是純化合物(單體)或含有2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮的混合物，包括含這種查爾酮衍生物的植物提取物、分部提取物、分離部位以及化學(xué)合成中間體。
本發(fā)明通過體外抑制試驗表明，查爾酮衍生物ZW-ON-III抑制血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶。
本發(fā)明通過人癌細胞株體外試驗表明，查爾酮衍生物ZW-ON-III對血管內(nèi)皮細胞生長有很強的抑制作用，同時對肝癌、鼻咽癌細胞株均有一定的生長抑制作用。
本發(fā)明通過人癌細胞裸鼠移植瘤模型體內(nèi)試驗，證明了查爾酮衍生物ZW-ON-III具有優(yōu)良的抗瘤活性。
本發(fā)明通過動物藥效實驗，確定查爾酮衍生物ZW-ON-III或其藥學(xué)組合的使用劑量范圍是1-100mg/kg/day。
本發(fā)明通過動物毒理實驗，確定查兒酮衍生物在有效治療劑量范圍內(nèi)毒副作用小，可以長期服用的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，上述所示化合物和其藥學(xué)組合可以制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑、乳劑的形式使用；其給藥途徑可為經(jīng)口服、靜脈、肌肉、皮膚給藥。以下通過下述實施例對本發(fā)明做進一步說明。一查兒酮衍生物ZW-ON-III的提取、分離及純化新鮮水翁(Cleistocalyx operculatus)花蕾5公斤，用95％乙醇冷浸一次，乙醇提取液減壓濃縮至無乙醇為止，加水，水溶液先用乙醚萃取5次，再用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓濃縮得棕色粉末(13克)，將該棕色粉末上硅膠柱，用氯仿-甲醇(95.5∶0.5)洗脫，得到I的粗晶，經(jīng)用苯重結(jié)晶得本發(fā)明的查爾酮衍生物(0.7克)。二查兒酮衍生物ZW-ON-III的鑒定查兒酮衍生物ZW-ON-III橙黃色簇狀結(jié)晶，mp124-126C(苯)；UV(MeOH)λmax(nm)339(logε4.32)，306(logε4.25，sh)，UV(NaOMe)λmax(nm)280(logε4.16)；IR(CCl4)υmax(cm-1)3550(OH)，1620，1540，1500(Ar)，1640(C＝O)，1170；1H NMR(90 MHz，CDCl3)δ2.11，2.12(各3H，s，Ar-CH3)，3.62(3H，s，OCH3)，5.46(1H，s，7’-OH)，12.27(1H，s，5’-OH)，7.20-7.90(5H，m，Ar-H)，7.86，7.96(各1H，d，J＝16.0 Hz，H-a和H-b)；EIMSm/z(％)298(M+，76)，297(M+-H，56)，221(100)，195(37)，194(62)，193(22)，166(19)，165(24)，131(17).三ZW-ON-III對血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用方法取對數(shù)生長期的ECV304細胞，用培養(yǎng)液配成5×105/ml，再將其加入12孔板中，每孔加入1ml。第2天，將培養(yǎng)液吸出，并加入無血清培養(yǎng)液，再加入受試不同濃度ZW-ON-III處理30分鐘，在收集細胞前5分鐘加入20ng/ml的VEGF刺激，分別應(yīng)用抗VEGFR的抗體和抗磷酸酪氨酸抗體Western blot檢測VEGFR受體的蛋白及其磷酸化水平。結(jié)果ZW-ON-III在VEGF刺激下對ECV304細胞中KDR磷酸化有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)濃度效應(yīng)關(guān)系，而KDR受體蛋白表達水平不受其影響。ZW-ON-III(ug/ml 00 1.25 2.5 5.0 10.0 20.0 40.0VEGF(ng/ml) -+ +++++ + 四ZW-ON-III對血管內(nèi)皮細胞ECV304、肝癌細胞Bel7402、肺癌細胞GLC82等體外生長的抑制作用方法取對數(shù)生長的血管內(nèi)皮細胞ECV304、肝癌細胞Bel7402、肺癌細胞GLC-82加入96孔板中，每孔100μl含有2000-4000個細胞。再加入藥物，每組設(shè)3個平行孔，置37℃培養(yǎng)72小時，實驗終止前4h加入10μL 5mg/mL MTT液，再培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液加入0.2mL DMSO，待結(jié)晶溶解后在酶聯(lián)檢測儀上檢測570nm波長的每孔的OD值。按下列公式求出生長抑制率，再按BLISS法計算機程序求出半數(shù)抑制率〔IC50值〕。 結(jié)果見表1。表1ZW-ON-III對人血管內(nèi)皮細胞ECV304、肝癌細胞Bel7402、肺癌GLC-82的體外生長抑制作用
五ZW-ON-III對人癌細胞株裸鼠移植瘤的抗瘤作用方法分別收集人肝癌細胞株Bel7402和肺腺癌GLC-82，制成1×107/mL細胞懸液。取0.2mL接種于裸小鼠腋窩皮下。待腫瘤長至約10mm3大小時，隨機分成5組，每8只，每組分別腹腔注射給藥如下①溶劑對照組(DMSO)；②CTX15mg·(kg·d)-1組或DDP1.5mg·(kg·d)-1組；③ZW-ON-III5mg·(kg·d)-1組；④ZW-ON-III10mg·(kg·d)-1組；⑤ZW-ON-III20mg·(kg·d)-1組，每周用藥6次，連用4周。每5天量度瘤體積及稱體重，停藥次日量瘤體積、稱體重、處死裸鼠，剝瘤塊稱瘤重，按下列公式計算抑瘤率，并作t檢驗。實驗重復(fù)2次。公式
結(jié)果在5.0mg·(kg·d)-1、10.0mg·(kg·d)-1和20mg·(kg·d)-1劑量作用28天下，ZW-ON-III對肝癌裸鼠移植瘤的平均抑瘤率分別為42.44％、59.5％和65.6％(詳見表.2，3)。結(jié)果可見不同劑量的ZW-ON-III對人肝癌裸鼠移植瘤均有不同程度的抑瘤作用，抑制作用與劑量相關(guān)。表2查爾酮衍生物ZW-ON-III對人肝癌(Bel7402)裸鼠移植瘤的抑制率
表3查爾酮衍生物ZW-ON-III對人肝癌(GLC-82)裸鼠移植瘤的抑制率
本發(fā)明的上述實驗表明(1)通過查爾酮衍生物ZW-ON-III對血管內(nèi)皮細胞與癌細胞抑制試驗和癌細胞裸鼠移植瘤模型試驗，證明了天然化合物查爾酮衍生物ZW-ON-III，具有優(yōu)良的抗癌活性。
(2)使用本發(fā)明的查爾酮衍生物ZW-ON-III，使用劑量范圍是1-100mg/kg/day。
(3)使用本發(fā)明的查爾酮衍生物ZW-ON-III，在正常劑量下，其作為藥物應(yīng)用是安全的。
(4)本發(fā)明的化合物或它的藥學(xué)組合，具有抗癌效果好，副作用更小和應(yīng)用范圍廣的特點。
權(quán)利要求
1.一種2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮用于制備抗癌藥物的新用途，其特征在于2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮用于抗腫瘤藥物使用的新用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮用于制備抗癌藥物的新用途，其特征在于2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮為來自植物的天然化合物或來自化學(xué)合成的人工產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮用于制備抗癌藥物的新用途，其特征在于2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮是純化合物或含有2’，4’ -二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮的混合物，包括含這種查爾酮衍生物的植物提取物、分部提取物、分離部位以及化學(xué)合成中間體。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮用于制備抗癌藥物新用途，其特征在于2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮的藥學(xué)制劑用于抗腫瘤的新用途，藥學(xué)組合的使用劑量范圍是1-100mg/kg/day。
5.根據(jù)權(quán)利要求書1、4所述的2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮用于制備抗癌藥物的新用途，其特征在于2’，4’-二羥基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查爾酮的藥學(xué)制劑是注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑、乳劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種2’，4’－二羥基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查爾酮用于制備抗癌藥物中的新用途。其特征為2’，4’－二羥基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查爾酮用于抗腫瘤藥物使用的新用途。查爾酮衍生物2’，4’－二羥基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查爾酮對血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶具有強烈的抑制作用，對血管內(nèi)皮細胞株ECV304體外生長具有顯著的抑制作用，對人肝癌細胞株Bel7402、鼻咽癌細胞株CNE2具有一定的細胞生長抑制作用；同時也發(fā)現(xiàn)對人肝癌細胞株Bel7402以及肺腺癌GLC－82裸鼠移植瘤生長有很強抑制作用。
文檔編號A61P35/00GK1454895SQ0215192
公開日2003年11月12日 申請日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者朱孝峰, 劉宗潮, 謝冰芬, 馮公侃, 曾益新, 魏孝義, 張鳳仙, 劉梅芳 申請人:中山大學(xué)腫瘤防治中心, 中國科學(xué)院華南植物研究所