專利名稱：一種從桉屬植物提取的化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從桉屬植物中提取的三環(huán)倍半萜類化合物，含有該化合物的藥物組合物，及其在治療腫瘤方面的應用。
背景技術(shù)：
桉屬植物為桃金娘科植物的一個主要屬種，原產(chǎn)澳州，從1890年開始引入國內(nèi)，目前在我國已有大規(guī)模種植，成為我國3大造林樹種之一。
藍桉是桉屬植物中的一個主要成員，又名灰楊柳、玉樹、小球桉樹、藍油木、楊草果樹。
桉屬植物原有主要用途如下其莖、枝可用于做木材、枕木、包裝材料和造紙，從其葉中提取出的桉葉油可用于香料生產(chǎn)和醫(yī)藥用途中，用于醫(yī)藥用途中的桉葉油多為藍桉葉油。
已有報道表明藍桉葉油具有抗多種細菌的作用，能抑制金黃色葡萄球菌及副傷寒桿菌的氧消耗及其琥珀脫氫酶活性，其濃度在6％以上時還具有抗結(jié)核桿菌的作用。臨床上通過抑菌實驗，發(fā)現(xiàn)藍桉葉油有抑菌能力，其對呼吸道感染，特別是對上呼吸道感染、慢性支氣管炎，具有較好療效，可有效祛痰。通過吸入和氣管滴入兩法應用時，對治療肺結(jié)核病人有令人滿意的效果。在消除常見癥狀，尤其是空洞閉合上似較其它抗癆藥物為佳。藍桉葉油也可用于某些皮膚病，并作為創(chuàng)傷面、潰瘍、瘺管的沖洗劑、除臭劑及神經(jīng)病患者的鎮(zhèn)痛藥。此外藍桉葉油也常用于十滴水、清涼油、風油精、驅(qū)蚊油、止咳藥等。民間也有用藍桉果實(俗名一口鐘)煎服治療感冒、哮喘、跌打損傷及真菌引起的皮膚病等疾病的治療，效果不錯。
早先的研究發(fā)現(xiàn)，桉屬植物的提取物中含有抗腫瘤活性較好的總?cè)祁惢衔?ETA)，所提取出的ETA的主要成份有四種，其分別為熊果酸、白樺脂酸、白樺脂酮和2-羥基熊果酸。它們都有較好的抗腫瘤作用。
然而，目前為止對桉屬植物中的有用化合物的研究還不充分。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)桉屬植物的有藥用價值的新物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種具有藥用價值的，來自桉屬植物的三環(huán)倍半萜類化合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種式I的三環(huán)倍半萜類化合物或其藥學上可接受的鹽 所述的三環(huán)倍半萜類是從桉屬植物中提取的，其分子式為C28H42N2O9，分子量為550.29。所述化合物具有抑制以下細胞株生長的活性Huh-7人肝癌細胞株、Du-145人前列腺癌細胞株、K562人白血病細胞株、AGS人胃癌細胞株、或Eca-109人食管癌細胞株、786-0人腎癌細胞株、A549人肺癌細胞株、CS-174-T人結(jié)腸癌細胞株。
在另一優(yōu)選例中，所述的化合物用包括以下步驟的提取方法制備的(a)用95±3％乙醇提取桉屬植物的果實、葉或枝，得到乙醇浸膏；(b)取乙醇浸膏，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯相；(c)對步驟(b)的乙酸乙酯相，在硅膠柱上，用梯度為10∶1至2∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫劑進行洗脫，收集石油醚∶乙酸乙酯為2∶1的洗脫組分；
(d)對步驟(c)的洗脫組分進行濃縮，得褐紅色粘稠狀物質(zhì)；(e)將步驟(d)的濃縮物上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脫，收集洗脫組分；(f)將步驟(e)的洗脫組分，上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脫，收集洗脫組分(g)濃縮干燥，得到淡黃色粉末；(h)用甲醇進行重結(jié)晶，得到三環(huán)倍半萜類化合物沉淀。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明所述的三環(huán)倍半萜類化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明所述的三環(huán)倍半萜類化合物或其藥學上可接受的鹽的用途，用于制備治療腫瘤的藥物。較佳地，所述的腫瘤包括肝癌、前列腺癌、白血病、胃癌、食管癌、腎癌、肺癌及結(jié)腸癌。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備三環(huán)倍半萜類化合物的方法，包括以下步驟(a)用95±3％乙醇提取桉屬植物的果實，得到乙醇浸膏；(b)取乙醇浸膏，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯相；(c)對步驟(b)的乙酸乙酯相，在硅膠柱上，用梯度為10∶1至2∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫劑進行洗脫，收集石油醚∶乙酸乙酯為2∶1的洗脫組分；(d)對步驟(c)的洗脫組分進行濃縮，得褐紅色粘稠狀物質(zhì)；(e)將步驟(d)的濃縮物上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脫，收集洗脫組分；(f)將步驟(e)的洗脫組分，上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脫，收集洗脫組分(g)濃縮干燥，得到淡黃色粉末；(h)用甲醇進行重結(jié)晶，得到三環(huán)倍半萜類化合物沉淀。
在另一優(yōu)選例中，所述的桉屬植物是藍桉。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種保健品，它含有0.05-10wt％的式I化合物和食品上可接受的載體。


圖1顯示了TMAO及兩種陽性藥物對Huh-7人肝癌細胞株的抑制作用。
圖2顯示了TMAO及兩種陽性藥物對Du-145人前列腺癌細胞株的抑制作用。
圖3顯示了TMAO及兩種陽性藥物對K562人白血病細胞株的抑制作用。
圖4顯示了TMAO及兩種陽性藥物對AGS人胃癌細胞株的抑制作用。
圖5顯示了TMAO及兩種陽性藥物對Eca-109人食管癌細胞株的抑制作用。
圖6顯示了TMAO及兩種陽性藥物對786-0人腎癌細胞株的抑制作用。
圖7顯示了TMAO及兩種陽性藥物對A549人肺癌細胞株的抑制作用。
圖8顯示了TMAO及兩種陽性藥物對CS-174-T人結(jié)腸癌細胞株的抑制作用。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入研究，發(fā)現(xiàn)在藍桉果實提取物的抗腫瘤作用中，總?cè)祁惢衔镏蛔鞒隽瞬糠重暙I。另外的貢獻來自于一種在藍桉果實中提取到的新的三環(huán)倍半萜類化合物1，1，4，7-四甲基-7-[3-甲基-1-[4，5，6-三羥基-4，6-二(2-氧代乙?；?-2-氧代六氫嘧啶-5-基]-丁基]-十氫-環(huán)丙并[e]薁-4-醇，簡稱TMAO。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的化合物可從各種桉屬植物中提取出，例如藍桉、大葉桉、檸檬桉、斑皮桉、窿緣桉、柳葉桉、毛葉桉、尾葉桉、布氏桉、廣葉桉、粗皮桉、細葉桉或剛果桉。該化合物在桉屬植物中的提取部位為植物的枝、葉或果實部位。尤其是果實部位。
本發(fā)明的化合物可以以由藥學上或生理學可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下無機酸形成的鹽如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及與有機酸形成的鹽，而有機酸則指乙酸、草酸、丁二酸和馬來酸。其他鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的“前體藥物”的形式(當以這種形式給藥時，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成活性部分)。
本發(fā)明還包括藥物組合物以及治療方法，它包括給哺乳動物施用藥物有效量的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明的三環(huán)倍半萜類化合物可用于治療腫瘤。代表性的例子包括(但并不限于)肝癌、前列腺癌、白血病、胃癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等。
當化合物用于上述用途時，它們可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，而且可以用如下形式口服給藥片劑、膠囊、可分散的粉末、顆粒或懸浮液(含有如約0.05-5％懸浮劑)、糖漿(含有如約10-50％糖)、和酏劑(含有約20-50％乙醇)，或者以無菌可注射溶液或懸浮液形式(在等滲介質(zhì)中含有約0.05-5％懸浮劑)進行非腸胃給藥。例如，這些藥物制劑可含有與載體混合的約2.5-90％，通常約為5％-60％(重量)的活性成分。
所用的活性成分的有效劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度而變化。然而，通常當本發(fā)明的化合物每天以約0.5-500mg/kg動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以2-4次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言，每天的總劑量約為1-100mg。適用于內(nèi)服的劑量形式，包含與固態(tài)或液態(tài)藥學上可接受的載體混合的約0.5-500mg的活性化合物?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
本發(fā)明的化合物可通過口服以及靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態(tài)載體包括無菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合活性成分的特性和所需的特定給藥方式。在制備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。
從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是固態(tài)組合物，尤其是片劑和固體填充或液體填充的膠囊?；衔锏目诜o藥是優(yōu)選的。
這些活性化合物也可腸胃外或腹腔內(nèi)給藥。也可在適當混合有表面活性劑(如羥丙基纖維素)的水中制備這些活性化合物(作為游離堿或藥學上可接受的鹽)的溶液或懸浮液。還可在甘油、液體、聚乙二醇及其在油中的混合物中制備分散液。在常規(guī)儲存和使用條件下，這些制劑中含有防腐劑以防止微生物生長。
適應于注射的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和無菌粉(用于臨時制備無菌注射溶液或分散液)。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器排出流體。在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物(如細菌和真菌)的污染影響。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、它們的適當混合物和植物油。
在使用本發(fā)明化合物治療腫瘤時，還可與其他腫瘤手段(如放療)或其他治療劑(如TNFα等)聯(lián)用。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1從桉屬植物中提取出新化合物A.從藍桉果實中提取按以下步驟提取1、取已粉碎藥材(藍桉果實，俗名一口鐘)，先用95％乙醇常溫提取兩周，回收乙醇溶液得乙醇浸膏。
2、取乙醇浸膏，先用石油醚提取，再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯溶劑得乙酸乙酯部位。
3、取乙酸乙酯部位適量，上硅膠柱分離。洗脫梯度為石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝2∶14、收集石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1所洗脫部位，濃縮得褐紅色粘稠狀物質(zhì)。取此物質(zhì)上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脫，每20ml收集一次，經(jīng)薄層鑒別后，合并富集后的幾管收集液。
5、取富集后的收集液，再次上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脫，每20ml收集一次，經(jīng)薄層鑒別后，合并斑點較深的相同收集液(略含其它雜質(zhì)斑點)。濃縮此收集液，再次上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脫，每20ml收集一次，經(jīng)薄層鑒別后，合并斑點相同收集液，濃縮后得淡黃色粉末。
6、取此淡黃色粉末，用甲醇重結(jié)晶。放置一周后，有沉淀析出。過濾得略帶淡黃的透亮物質(zhì)。
7、經(jīng)結(jié)構(gòu)確認該化合物為三環(huán)倍半萜類化合物，結(jié)構(gòu)式為 分子式C28H42N2O9分子量550.29命名為1，1，4，7-Tetramethyl-7-[3-methyl-1-[4，5，6-trihydroxy-4，6-di(2-oxo-acetyl)-2-oxo-hexahydro-pyrimidin-5-yl]-butyl]-decahydro-cyclopropa[e]azulen-4-ol1，1，4，7-四甲基-7-[3-甲基-1-[4，5，6-三羥基-4，6-二(2-氧代乙酰基)-2-氧代六氫嘧啶-5-基]-丁基]-十氫-環(huán)丙并[e]薁-4-醇以下將該新三環(huán)倍半萜類化合物簡稱為TMAO。
B.從藍桉葉提取重復A中的步驟，不同點在于用粉碎的藍桉葉替換藍桉果實，結(jié)果同樣獲得了TMAO。只是TMAO在葉子中的含量低于果實。
C.從其他桉屬植物提取重復A中的步驟，不同點在于用以下植物的果實替換藍桉果實大葉桉、斑皮桉、柳葉桉、毛葉桉、尾葉桉、布氏桉、粗皮桉和剛果桉。結(jié)果同樣獲得了TMAO。這表明TMAO廣泛存在于桉屬植物中。
實施例2體外抗腫瘤作用的研究選用Huh-7人肝癌細胞株、Du-145人前列腺癌細胞株、K562人白血病細胞株、AGS人胃癌細胞株、Eca-109人食管癌細胞株、786-0人腎癌細胞株、A549人肺癌細胞株、CS-174-T人結(jié)腸癌細胞株進行藥物體外抗腫瘤實驗。將細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至細胞數(shù)達1×107個。將細胞消化后，用DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司)將細胞稀釋至3×104/ml。取96孔板，每孔加入200ul稀釋好的細胞液，于37℃5％CO2孵箱中溫孵。24小時后，棄去原有細胞培養(yǎng)液，在相應孔中分別加入用DMEM培養(yǎng)液配制好的含不同濃度各種受試藥物的溶液200ul后，繼續(xù)將細胞培養(yǎng)板置于37℃5％CO2孵箱中溫孵。48小時后，各孔中分別加入10mg/ml MTT(Sigma公司)20ul，在同樣條件下再溫孵4小時后，每孔加入200ul的二甲基亞砜，混勻，室溫下放置半小時后測定吸光值。將96孔板置酶標儀上測定各孔在570nm處的吸光值(OD)。按下式計算腫瘤抑制率腫瘤抑制率＝(1-OD用藥組/OD對照組)×100％選用5Fu(5-氟尿嘧啶)及長春新堿為陽性對照藥。受試藥物濃度分別為1ug/ml、3ug/ml、10ug/ml、30ug/ml、100ug/ml，對照組和各受試藥物各濃度組在96孔板上皆重復12孔。
試驗結(jié)果如圖1-8所示。結(jié)果表明TMAO對人肝癌細胞株、人前列腺癌細胞株、人白血病細胞株、人胃癌細胞株、人食管癌細胞株、人腎癌細胞株、人肺癌細胞株、人結(jié)腸癌細胞株都有很好的抑制效果。
實施例3體內(nèi)抗腫瘤作用的研究將Huh-7人肝癌細胞進行常規(guī)培養(yǎng)。取增殖期活性好的細胞，以體積為0.25ml、濃度為1×107細胞/只的劑量接種于裸鼠(購自中科院上海實驗動物中心)右大腿外側(cè)皮下。接種后次日將小鼠隨機分成2組，每組10只。飼養(yǎng)30天后，給受試藥組每只小鼠每天腹腔注射藥物(100mg/kg)溶液0.5ml；陰性對照組每只小鼠每天給予等體積的生理鹽水；各組小鼠每天皆給藥1次，連續(xù)給藥10天。于停藥24小時后，將各組小鼠皆放血處死，進行尸體解剖，取出瘤塊稱重，按下式計算腫瘤抑制率。
腫瘤抑制率＝(C-T)×100/C式中T為給藥組平均瘤重，C為對照組平均瘤重。
結(jié)果如表1所示，TMAO在體內(nèi)有顯著的抑制腫瘤的效果。
表1組別給藥劑量體重(g)瘤重 抑制率P值(mg/kg) 開始最后 (x±s)g (％)生理鹽水 0 19.422.12.15±0.47受試藥10019.622.80.93±0.6556.7＜0.01實施例4藥物組合物口服配方100毫克TMAO，50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉。
注射配方50毫克TMAO，50毫摩爾磷酸緩沖液，pH7.0，總體積1毫升。
實施例5保健食品組合物飲料、口服液和膠囊的制作a.取提純的TMAO 1g加2.5g阿拉伯膠，在干乳缽中研勻，一次加入25ml蒸鎦水，勻質(zhì)機中迅速磨成乳，然后加入甜菊甙水溶液適量，再緩緩加入西黃蓍膠漿(0.7g粉)加水適量制成漿，加入0.1％山梨酸鉀，加蒸鎦水至1000ml，將其灌瓶、滅菌即成。
b.藻藍蛋白1g，甜菊甙，檸檬酸適量，消毒滅菌水使成100ml，裝瓶消毒殺菌即成。
c.按20毫克TMAO，10毫克甘氨酸，10毫克賴氨酸，20毫克精氨酸，140毫克可溶性淀粉比例，制得大小為200mg的膠囊。
此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種式I的三環(huán)倍半萜類化合物或其藥學上可接受的鹽
2.一種三環(huán)倍半萜類化合物或其藥學上可接受的鹽，其特征在于，所述的三環(huán)倍半萜類的分子式為C28H42N2O9，分子量為550.29。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有抑制以下細胞株生長的活性Huh-7人肝癌細胞株、Du-145人前列腺癌細胞株、K562人白血病細胞株、AGS人胃癌細胞株、或Eca-109人食管癌細胞株、786-0人腎癌細胞株、A549人肺癌細胞株、CS-174-T人結(jié)腸癌細胞株。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，所述化合物是通過包括以下步驟的提取方法獲得的(a)用95±3％乙醇提取桉屬植物的果實、葉或枝，得到乙醇浸膏；(b)取乙醇浸膏，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯相；(c)對步驟(b)的乙酸乙酯相，在硅膠柱上，用梯度為10∶1至2∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫劑進行洗脫，收集石油醚∶乙酸乙酯為2∶1的洗脫組分；(d)對步驟(c)的洗脫組分進行濃縮，得褐紅色粘稠狀物質(zhì)；(e)將步驟(d)的濃縮物上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脫，收集洗脫組分；(f)將步驟(e)的洗脫組分，上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脫，收集洗脫組分(g)濃縮干燥，得到淡黃色粉末；(h)用甲醇進行重結(jié)晶，得到三環(huán)倍半萜類化合物沉淀。
5.如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，所述的桉屬植物包括藍桉、大葉桉、檸檬桉、斑皮桉、窿緣桉、柳葉桉、毛葉桉、尾葉桉、布氏桉、廣葉桉、粗皮桉、細葉桉或剛果桉。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1或2所述的三環(huán)倍半萜類化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求1所述的三環(huán)倍半萜類化合物或其藥學上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤的藥物。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括肝癌、前列腺癌、白血病、胃癌、食管癌、腎癌、肺癌及結(jié)腸癌。
9.一種制備三環(huán)倍半萜類化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)用95±3％乙醇提取桉屬植物的果實，得到乙醇浸膏；(b)取乙醇浸膏，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯相；(c)對步驟(b)的乙酸乙酯相，在硅膠柱上，用梯度為10∶1至2∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫劑進行洗脫，收集石油醚∶乙酸乙酯為2∶1的洗脫組分；(d)對步驟(c)的洗脫組分進行濃縮，得褐紅色粘稠狀物質(zhì)；(e)將步驟(d)的濃縮物上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脫，收集洗脫組分；(f)將步驟(e)的洗脫組分，上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脫，收集洗脫組分(g)濃縮干燥，得到淡黃色粉末；(h)用甲醇進行重結(jié)晶，得到三環(huán)倍半萜類化合物沉淀。
10.一種保健品，其特征在于，它含有0.05-10wt％的權(quán)利要求1所述的化合物和食品上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從桉屬植物中提取的三環(huán)倍半萜類化合物，含有該化合物的藥物組合物，及其在治療腫瘤方面的應用。體外和動物體內(nèi)實驗證明，這種從桉屬植物中提取的三環(huán)倍半萜類化合物對肝癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、腎癌、肺癌及結(jié)腸癌細胞株的生長有抑制作用，對小鼠接種腫瘤也有抑制作用。
文檔編號A61K31/505GK1583728SQ0315041
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月18日
發(fā)明者婁子洋, 劉玉明, 吳玉田, 朱洪莉, 戈萌, 謝天培 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院, 上海天甲生物醫(yī)藥有限公司, 上海源創(chuàng)生物醫(yī)藥有限公司