專利名稱：一組乙型肝炎病毒特異型的hla_a33限制性表位肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學領域，具體涉及乙型肝炎病毒(HBV)特異型的HLA_A33限制性表位肽及其應用。
背景技術：
一 發(fā)現(xiàn)HLA_A33限制型HBV特異表位的意義乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染目前仍為全球重要的健康問題之一，至2009年底全世界大約有3億5千萬慢性感染人口，每年直接或間接因HBV感染而死亡的人數(shù)達I百萬。我國HBV感染人群比例更大，估計接近總?cè)丝诘?0%。HBV感染可出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)，包括按疾病發(fā)病速度分為的急性、慢性、重型肝炎，也有按發(fā)展進程而出 現(xiàn)的肝硬化、肝癌，最終常因肝衰竭而死亡。對上述復雜的發(fā)病機制已經(jīng)做了不少研究，其中有明確結論的是感染的年齡段、免疫反應的個體差異、免疫耐受機制的形成等因素。但在個體差異中，受MHC-I (Major Histocompatibility Complex-I)類分子嚴格限制的抗原特異性CTL(cytotoxic lymphocytes)識別感染肝細胞是免疫清除的重要機制之一，同時，在急性感染期也是造成肝損傷的主要原因，而在慢性感染中，由于CTL機制被抑制而出現(xiàn)的免疫耐受則是導致該病長期攜帶的原因之一。因此，無論誘導抗原特異性CTL或者控制抗原性特異的CTL，在HBV的治療中均具有重要作用。而鑒定抗原特異的T細胞表位肽是該項理論研究及實踐應用的基礎中的基礎。常用于免疫研究的三種HLA_A, B, DRBl (Human leukocyte antigen_A, B, DRBI)的基因多態(tài)型分布中，以HLA_A的分布具體比較集中，其中HLA_A位點的分布，主要以HLA_A02，Al，A24，A33，A30為主，合計約占86 %左右。因此，研究HLA_A位點的幾個重要型的HBV特異性表位，是分析個體差異的一個重要入口。截止2004年底，已經(jīng)對HLA_A02，11有了較深入的研究，發(fā)現(xiàn)存在多個表位，而HLA_A33型表位發(fā)現(xiàn)幾乎為零。而HLA_33型人群的基因型占總?cè)巳旱?%，加上與HLA_A33非常相近似的HLA_A31，兩者合計占總?cè)巳旱?2%左右，因此，發(fā)現(xiàn)HLA_A33的HBV特異性表位，有著重要的意義。二 表位肽在免疫耐受性疾病治療的作用免疫耐受性病毒是指可導致機體免疫系統(tǒng)反應能力低下的病毒。各種病毒的引發(fā)免疫耐受的機理不同，但最終都會導致B細胞產(chǎn)生抗體、T細胞和細胞免疫的能力下降或消失，兩者之一或者兩者均有，而使得病毒的持續(xù)存在。免疫耐受性病毒可有效的逃逸機體免疫，引起免疫耐受，使人體的免疫機制不再對抗原產(chǎn)生免疫應答，使病毒在體內(nèi)長期存在。HBV是典型的免疫耐受性病毒，感病母親所產(chǎn)90%新生兒成為病毒攜帶者，部分成人HBV患者也會形成乙肝的慢性感染。HBV的持續(xù)性感染和抗原的過量表達以及病毒的變異往往導致患者體內(nèi)持續(xù)的病毒復制、胸腺中病毒特異的與免疫調(diào)節(jié)相關的Thl類細胞被克隆剔除、外周血和肝臟中與病毒清除和感染細胞裂解相關的CTL反應能力下降、消失或者克隆剔除。
近期一系列的研究顯示，乙肝病毒抗原特異性細胞毒T淋巴細胞應答在乙肝感染中有重要意義。HBV特異性CTL通過分泌大量IFN- y等發(fā)揮非損傷清除HBV作用，這種作用發(fā)生在肝細胞損傷前，后續(xù)引起的肝細胞損傷可能與特異性應答后引起非特異性免疫活性細胞在肝內(nèi)浸潤、凋亡激活等有關。進一步研究揭示，HBV特異性應答功能的差異與乙肝患者的不同臨床轉(zhuǎn)歸密切相關。在自限性急性乙型肝炎患者中，特異性CTL應答作用強，可能與病毒被迅速清除而肝細胞損傷輕有關，而在慢性乙型肝炎患者中，特異性CTL應答能力弱，可能與清除病毒能力不足而導致炎癥細胞浸潤和慢性化有關。新近研究認識到，通過刺激特異性CTL應答可能是促進慢性乙肝患者病毒清除和機體恢復的一種有效途徑
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明屬于免疫學領域，具體涉及乙型肝炎病毒(HBV)特異型的HLA_A33限制性表位肽及其應用。具體地，本發(fā)明構建了 HLA_A33限制型的細胞水平表位肽篩選平臺，并通過結合計算機模擬分析，在該細胞水平表位肽篩選平臺上檢測，聯(lián)合運用三聚體蛋白水平復性、四聚體病人血樣檢測、Elispot檢測三種檢測技術，確認了 5條重要的乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽(即，SEQ ID No :5，7，9，10和19)。本發(fā)明還提供了所篩選的乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽用于制備治療受試者中的乙型肝炎的藥物中的應用，更具體地，所述受試者的乙型肝炎為HLA_A33型的。本發(fā)明還提供一種治療受試者中HLA_A33型乙型肝炎的藥物，所述藥物包含上述5種HBV特異型的HLA_A33限制性表位肽(即，SEQ ID No :5，7，9，10和19)中的一種或多種，和藥用載體。具體而言，本發(fā)明的特征在于運用已知的技術，構建了 HLA_A33限制型的細胞水平表位肽篩選平臺，并通過計算機模擬分析，尋找了 16條HBVB，C亞型的候選肽，并進一步通過上述細胞水平篩選平臺的檢測后，聯(lián)合運用三聚體蛋白水平復性、四聚體病人血樣檢測、Elispot檢測三種檢測技術，確認了 5條重要的表位肽(即，其氨基序列為SEQ ID No 5,7,9,10 和 19)。在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明提供了一種用于HLA_A33限制型細胞水平表位肽的篩選平臺，該平臺是利用VSVG假病毒系統(tǒng)(見下文的術語說明)穩(wěn)定細胞系構建技術，將優(yōu)化后的HLA_A33型基因轉(zhuǎn)入RMA-S細胞(購自上海復祥生物科技有限公司)，該細胞是一種TAP酶(抗原呈遞相關轉(zhuǎn)運蛋白)缺陷型的細胞，在37°C培養(yǎng)時，不呈遞表位到細胞膜上。因而無法檢出該蛋白在膜上的表位，當加入外源肽后，如果該蛋白與肽能夠結合，并與事先加入的0 2m蛋白形成穩(wěn)定的復合物，可以在細胞外膜上檢測到該蛋白存在。由此可以判斷肽是否與特異HLA_A33分子結合。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明綜合運用三聚體蛋白水平復性、四聚體病人血樣檢測、Elispot檢測三種檢測技術，發(fā)現(xiàn)了 5條HBV特異型的HLA_A33限制性表位肽及候選表位肽。具體地，這5條HBV特異型的HLA_A33限制性表位肽的氨基酸序列分別為GYRWMCLRR(肽 1，SEQ ID No 5)；YLffEffASVRdt 3，SEQ ID No 7)；LVSFGVffIRdt 5，SEQ ID No 9)；HISCLTFGR(肽 6，SEQ ID No 10)；VVDFSQFSRdt 17, SEQ ID No 19)。
在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明通過Elispot實驗驗證了上述5條HBV特異型的HLA_A33限制性表位肽的在乙肝患者體內(nèi)能夠激發(fā)IFN- y的分泌功能，通過四聚體技術證實了上述5條肽在乙肝患者體內(nèi)能與特定的外周血中CD8+細胞特異結合。具體而言，本發(fā)明的HBV特異型的HLA_A33限制性表位肽具有引發(fā)體內(nèi)CD8+細胞識別已經(jīng)感染HBV的細胞以及同時誘發(fā)免疫反應的能力。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了所篩選的乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽用于制備治療受試者中的乙型肝炎的藥物中的應用。更具體地，所述受試者的乙型肝炎為HLA_A33型的。所述受試者是哺乳動物,包括人和非人哺乳動物,例如,轉(zhuǎn)人HLA_A33的乙肝模型小鼠，或者適合免疫治療的乙型肝炎患者，等等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種治療受試者中HLA_A33型乙型肝炎的藥物，所述藥物包含上述5種HBV特異型的HLA_A33限制性表位肽(即，SEQ ID No :5，7，9，10和19)中的一種或多種，和藥用載體。更具體地，所述受試者是人。另外，當用于本文時，下述術語的定義為 HLA_A33 :人白細胞抗原(Human Leucocyte Antigen) A 血清型 33 亞型。GR-9 :在約定的T細胞表位簡稱中，常用表位肽的第一位及最后一位氨基酸殘基加上肽的長度表示，如GR-9可以用來代表肽GYRWMCLRR。由于本文中相同的AR-9等有多個,因此本文敘述時以肽I,肽2的方式為主。VSVG假病毒系統(tǒng)VSVG是皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G，它可以通過受體介導的內(nèi)吞作用將包裝的假病毒中的基因帶入多種真核細胞中。本實驗中用的是可整合型慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)。CTL(cytotoxic lymphocytes) :HBV感染肝細胞后，病毒抗原被抗原提呈細胞(APC)的蛋白酶體裂解成小分子的寡肽，并與肝細胞內(nèi)HLA-I類分子結合成復合物，表達于細胞表面，成為T細胞表位。CTL通過表面的⑶8+分子與HLA-I類分子產(chǎn)生粘附，并由T細胞受體識別上述寡肽表位，此類CTL即為HBV抗原特異性CTL(HBV antigens specificcytotoxic lymphocytes, HBV sCTL)。HBV (Hepatitis B virus):乙型肝炎病毒。PBMC :外周血單個核細胞ELISP0T :酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay)Tetramer-PE :用PE標記的特異性的四聚體，四聚體中的每個單體由HLA_A33的重鏈、^ 2m,及肽組成。本文中九種不同Tetramer-PE的差別是其中所含的肽不同。


從下面結合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中圖I顯示肽結合實驗的結果，標“ + ”的線是已知陽性肽FFVDGAANR在帶有HLA_A33的細胞表面形成三聚體時的峰(肽濃度為50mM)，標的已知陽性肽FDVDGAANR結合時的結果，其它峰為只加肽和P2m，但細胞系為未轉(zhuǎn)染基因的結果。結果說明所構建的轉(zhuǎn)染HLA_A33的MRS-A細胞可以用于篩選能與HLA_A33特異結合的肽段。圖2顯示本發(fā)明的肽1-5和7-8的細胞篩選結果。S2_3是指不加肽的對照組，Ll_8是加肽的實驗組；抗體染色是用FITC標記的W6/32，細胞計數(shù)為50萬個。從圖中可以看出，肽1，3，5可以明顯增強細胞表面特異的A3303三聚體的表達。而2，4，7,8的圖的結合峰偏移不明顯，說明在細胞水平，在這幾條肽中，肽1，3，5能夠與HLA_A33和P 2m形成三聚體。圖3顯示體外折疊的分子篩層析圖。其中橫軸為洗脫的體積，縱軸為280nm的光吸收值。圖3A :肽1，圖3B :肽3，圖3C :肽5，圖3D :肽6，圖3E :肽17，顯示的是9個折疊陽性的肽中的五個肽(即，肽1，肽3，肽5，肽6，肽17)的折疊后的分子篩圖，圖3F為已知的陽性對照，圖3G為已知的陰性對照的折疊結果。該結果說明，HC+P 2m的峰在肽1，肽3，肽5，肽6，肽17能與HLA_A33重鏈體外其折疊時，可以形成很好的三聚體結果。圖4 :顯示了兩例HLA_A33型乙肝患者血樣Elispot的結果,肽I,肽3，肽5，肽6，肽17均可以刺激產(chǎn)生大于6個以上的斑點，說明這5條肽均能誘發(fā)免疫反應。圖5 :顯示了 HLA_A33型乙肝患者血樣用四聚體染色的結果，說明患者體內(nèi)存在能與這五條肽所形成的HLA_A33四聚體結合的、⑶8+染色陽性的細胞。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實施例I :HLA_A33限制性的表位肽篩選平臺的構建I HLA_A3303穩(wěn)定細胞系的構建本實施例中，分別用VSVG假病毒系統(tǒng)(購自Biovector Science Lab, Inc)形式，將人的HLA_A3303全基因(以下簡稱人HLA_A3303，GenBank U09740. I)兩端加上Nhel，XhoI位點后，在上海旭冠生物公司全合成該序列(核酸序列為SEQ ID No :1，其表達可以產(chǎn)生如SEQ ID No 2所表示的蛋白)，再利用Nhel，XhoI兩個位點構建于載體plentilox
3.7-RRP (是上述VSVG假病毒系統(tǒng)(購自Biovector Science Lab, Inc)中質(zhì)粒)中，形成重組質(zhì)粒plentilox-HLA_A33，大提該重組質(zhì)粒15 u g,再與5ug VSVG質(zhì)粒，5u g RSV/REV質(zhì)粒，5iig pMDLG質(zhì)粒(上述三種質(zhì)粒同樣是是上述VSVG假病毒系統(tǒng)中的質(zhì)粒)共同轉(zhuǎn)染提前24小時準備細胞好的、細胞匯合度為70-80%的IOcm2細胞培養(yǎng)皿中的293T細胞(該細胞購自NIH)，轉(zhuǎn)染用常規(guī)脂質(zhì)體方法進行。在37°C、5% CO2下培養(yǎng)，4小時換液后，同樣條件再培養(yǎng)48小時后吸出細胞培養(yǎng)上清，2000 3000rpm，18°C溫度下離心10分鐘。收取上清。于_80°C保存。此即為包裝好的帶有HLA_A3303基因的假病毒。用上述假病毒感染RMA-S細胞(購自上海復祥生物科技有限公司)，以2 4 ii g/mL的濃度的嘌呤霉素(購自AMRIS0)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，經(jīng)Western Blot檢測以及細胞熒光染色的方法確定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆已經(jīng)將HLA_A3303表達在細胞外膜上。2:肽的合成該實驗用的陽性肽的氨基酸序列為FFVDGAANR、陰性肽的氨基酸序列為FDVDGAANR，每條肽合成20mg，95%純度，由上海吉爾生化公司合成。3 :肽結合實驗將RMS-A-A3303細胞在26°C培養(yǎng)14 18小時，用含20%胎牛血清(購自GIBIC0)的PBS重懸細胞，調(diào)整濃度為每毫升2*105個細胞，每次實驗取50 u L，分別加入陽性肽及陰性肽使最終濃度為梯度0. Iii M，Iii M，IOii M，IOOii M，lmM，加入P 2m微球蛋白(購自Sigma)(終濃度為10 u g/mL)，每個實驗組重復3個復孔，26°C培養(yǎng)I小時后，置于37°C再培養(yǎng)3小時。細胞用含20%胎牛血清的PBS洗滌后，4°C，500g離心，保留體積為50yL，置冰上，加入FITC標記的HLA_A抗體W6/32 (購自eBioscience)，室溫下孵育10分鐘，PBS洗滌3次后，流式細胞儀檢測熒光強度。圖I顯示肽結合實驗的結果，標“ + ”的線是已知陽性肽FFVDGAANR在帶有HLA_A33的細胞表面形成三聚體時的峰(肽濃度為50mM)，標的已知陽性肽FDVDGAANR結合時的結果，其它峰為只加肽和P2m，但細胞系為未轉(zhuǎn)染基因的結果。結果說明所構建的轉(zhuǎn)染HLA_A33的RMS-A細胞可以用于篩選能與HLA_A33特異結合的肽段。實施例2 =HBV特異型HLA_A33特異性表位的篩選用網(wǎng)絡上已經(jīng)公布的如下資源，分別對HBV的B，C亞型的可能候選多肽做了預測三維定量構效關系程序為MHCPred 打分距陣程序為SYFPEITHITAP程序為 TAPpred按三者的結果，選擇了 16條肽做為候選多肽?？偟慕Y果見下表I。
權利要求
1.一組乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽，其由下述氨基酸序列組成GYRWMCLRR, YLWEWASVR, LVSFGVWIR, HISCLTFGR,，或 VVDFSQFSR。
2.權利要求I所述的乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽用于制備治療受試者中的乙型肝炎的藥物中的應用，其中所述受試者的乙型肝炎是HLA_A33型的。
3.權利要求2所述的應用，其中所述受試者是哺乳動物。
4.權利要求3所述的應用，其中所述受試者是人。
5.一種治療受試者中HLA_A33型乙型肝炎的藥物，其包含權利要求I的乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽中的一種或多種，和藥用載體。
6.權利要求5所述的藥物，其中所述受試者是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽及其應用。本發(fā)明構建了HLA_A33限制型的細胞水平表位肽篩選平臺，并通過結合計算機模擬分析，在該細胞水平表位肽篩選平臺上檢測，聯(lián)合運用三聚體蛋白水平復性、四聚體病人血樣檢測、Elispot檢測三種檢測技術，確認了5條重要的乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽(即，SEQ ID No5，7，9，10和19)。本發(fā)明還提供了所篩選的乙型肝炎病毒特異型的HLA_A33限制性表位肽用于制備治療受試者中的乙型肝炎的藥物中的應用，更具體地，所述受試者的乙型肝炎為HLA_A33型的。本發(fā)明還提供一種治療受試者中HLA_A33型乙型肝炎的藥物，所述藥物包含上述5種HBV特異型的HLA_A33限制性表位肽(即，SEQ ID No5，7，9，10和19)中的一種或多種，和藥用載體。
文檔編號A61K39/29GK102796172SQ201110135718
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權日2011年5月23日
發(fā)明者田波, 高福, 潘煦文 申請人:中國科學院微生物研究所