專利名稱：新的人kunitz型抑制劑和其相關(guān)方法
血液凝固是一由各種血液成分或因子的復(fù)雜相互作用組成的過程，其最終產(chǎn)生血纖維蛋白凝塊。一般說來，參與稱為凝血“級聯(lián)”的血液成分是酶原，即在激活劑作用下轉(zhuǎn)化成蛋白水解酶和無酶促活性的蛋白質(zhì)，所說的激活劑本身則是活化的凝血因子。已受到這種轉(zhuǎn)化的凝血因子一般稱為“活性因子”，并可在其符號后下方加“a”表示之(如因子VIIa)。
兩系統(tǒng)促進(jìn)血液凝固并因而參與正常止血。這些系統(tǒng)已被稱為“內(nèi)在性”和“外在性”凝血途徑?，F(xiàn)在認(rèn)為，內(nèi)在性途徑在血纖維蛋白形成的生長和維持中起作用，“外在性”途徑是一個對于血纖維蛋白形成的起始起重要作用的交迭機(jī)制。這些途徑旨在將因子X活化成Xa，并通過一共同途徑導(dǎo)致血纖維蛋白生成。在血管損傷后，組織因子以一種鈣依賴性方式與因子VII復(fù)合而啟動“外在性”凝血途徑，以有利于因子VII轉(zhuǎn)化成VIIa。因子VIIa-組織因子復(fù)合物可直接將因子X活化成Xa。可通過凝血酶或因子XIIa的產(chǎn)生激活內(nèi)在性途徑，其中因子XIIa裂解因子XI以產(chǎn)生因子XIa，即啟動“內(nèi)在性”凝血級聯(lián)所需的酶。
通過“外在性”途徑生成血纖維蛋白的過程因組織因子途徑抑制蛋白(TFPI)的存在而受到控制，后者因子Xa依賴性方式調(diào)節(jié)該途徑。據(jù)信多價Kunitz型抑制劑TFPI通過與因子Xa、組織因子和因子VIIa形成四元復(fù)合物，進(jìn)而抑制游離因子Xa和因子VIIa的生成來調(diào)節(jié)外在性途徑(Broze et al.，Biochemistry 297539-7546，1990；該文獻(xiàn)全文列入本文作為參考文獻(xiàn))。
在某些情況下，例如腎透析、深靜脈血栓形成及彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)情況下，有必要使用肝素、香豆素、香豆素衍生物、2，3-二氫-1，3-茚二酮衍生物等抗凝劑阻斷凝血級聯(lián)。例如可在透析治療中進(jìn)行肝素處理或用檸檬酸鹽離子進(jìn)行體外處理(美國專利4,500,309)以防止治療過程中發(fā)生凝血。對進(jìn)行外科手術(shù)的病人也使用肝素防心深部靜脈血栓形成。但既使使用低劑量的肝素也可引起嚴(yán)重出血。另外，因?yàn)楦嗡匕雺燮趦H大約80分鐘，所以可迅速從血液中清除。由于肝素是作為抗凝血酶III(ATIII)的輔助因子起作用的，并且在DIC治療中抗凝血酶III被迅速耗盡，所以常常難以維持為連續(xù)監(jiān)測ATIII和肝素水平所必需的適當(dāng)肝素劑量。如果ATIII極端耗竭，肝素也是無效的。此外，長期使用可增加血小板聚集，降低血小板計數(shù)，并卷入骨質(zhì)疏松的發(fā)展過程。2，3-二氫-1，3-茚二酮衍生物還可能具有毒付作用。
除了上文簡述的抗凝劑外，本領(lǐng)域內(nèi)還公開了各種據(jù)說有抗凝劑活性的組合物。Rutelingsperger等人(Eur.J.biochem.1S1625-629，1985)公開了一種這樣的組合物，即他們從人臍帶動脈中分離的一種32,000道爾頓多肽。Warn-Cramer等人(Circulation suppl.，Part 2，742-408 ii，Abstract#1630，1986)公開了第一種組合物。他們從血漿中檢測到一種表觀分子量34，500道爾頓的因子VIIa抑制劑。
根據(jù)蛋白質(zhì)抑制劑家族成員的廣泛序列同源性和鏈內(nèi)二硫橋鍵的保守性而將其分為一系列家族(參見Laskowski and Kato，Ann.Rev.Biochem.49593-626，1980)。Kunitz家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑的特征是它們與抑蛋白酶肽(牛胰蛋白酶抑制劑)同源。已知抑蛋白酶肽抑制包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纖溶酶和激肽釋放酶在內(nèi)的多種絲氨酸蛋白酶。已報導(dǎo)了較大蛋白質(zhì)如內(nèi)-2-胰蛋白酶抑制劑(Huchstrasser et al.，Hoppe-Seylers ZPhysiol.Chem.3571659-1661，1969和Tschersche et al.，Eur.J.Biochem.16187-198，1970)、β-淀粉樣蛋白前體及α3-膠原蛋白VI型(Chu et al.，EMBO J.9385-393，1990)中的Kunitz型抑制劑區(qū)域。TFPI(也稱為外在性途徑抑制劑(EPI)或脂蛋白相關(guān)凝血抑制劑(LACI))是由三個串聯(lián)的Kunitz型抑制劑組成的側(cè)翼有帶負(fù)電荷氨基末端和帶正電荷羧基末端的血漿蛋白酶抑制劑。已顯示第一和第二個Kunitz型區(qū)域分別抑制因子VIIa和因子Xa活性。
本領(lǐng)域仍要求具有抗凝血劑活性的，并且不產(chǎn)生與傳統(tǒng)抗凝組合物相關(guān)聯(lián)之不良付作用的改良組合物。本發(fā)明滿足了這一需要，并進(jìn)一步提供了其他相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
因此本發(fā)明的目的是提供與用作抗凝劑的并用于治療深靜脈血栓形成和DIC的抑制劑有相似特征的，Kunitz家族的新的人蛋白酶抑制劑。
簡單地說，本發(fā)明提供包含編碼Kunitz型抑制劑之DNA序列的DNA分子，其中該DNA片段含有SEQ ID NO1 4中核苷酸1至165的序列，其中各核苷酸三聯(lián)體1-3、4-6、160-162和163-165分別編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本發(fā)明的一個方面，Kunitz型抑制劑包含SEQ ID NO1中核苷酸138至305的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個方面，Kunitz型抑制劑包含SEQ ID NO1中核苷酸39至743的核苷酸序列。再一個方面，Kunitz型抑制劑包含SEQ ID NO1中核苷酸138至493的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個方面，Kunitz型抑制劑包含SEQ ID NO1中核苷酸138至671的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個方面，DNA片段編碼包括SEQ ID NO15所示之氨基酸序列的Kunitz型抑制劑，所說的序列中各Xaa分別是除半胱氨酸外的氨基酸。在本發(fā)明的一個方面，DNA片段編號包含SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34即谷氨酸到氨基酸編號89即異亮氨酸之氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。在本發(fā)明的另一個方面，DNA片段編號包含SEQ ID NO2中從氨酸1的Met到氨基酸235的Phe之氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。在本發(fā)明的另一個方面，DNA序列編號包含SEQ ID NO2中從氨基酸編號34的谷氨酸到氨基酸編號152的賴氨酸之氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。在本發(fā)明另一個方面，DNA序列編號包含從SEQ ID NO2中氨基酸編號34的谷氨酸到氨基酸編號211的丙氨酸之氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。
本發(fā)明還提供包含編碼人Kunitz型抑制劑之第一DNA片段的DNA構(gòu)建體，其中所說的第一DNA片段可操作地連接到為表達(dá)第一DNA片段所必需的附加DNA片段上，并提供含有這樣的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)人Kunitz型抑制劑的方法，該方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞及分離所說的Kunitz型抑制劑的步驟。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的Kunitz型抑制劑。在另一個實(shí)施方案中，分離的人Kunitz型抑制劑包含SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本發(fā)明的一個方面，Kunitz型抑制劑包含SEQ ID NO2中從氨基酸編號1之Met到氨基酸編號235之Phe的氨基酸序列；SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列；SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個方面，Kunitz型抑制劑進(jìn)一步在其氨基末端包含SEQ ID NO12或SEQ ID NO13的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的與人Kunitz型抑制劑特異結(jié)合的抗體。在一個實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了包括SEQ ID NO15之氨基酸序列的藥物組合物，所說的序列中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本發(fā)明的一個方面中，藥物組合物包含人Kunitz型抑制劑，所說的抑制劑含有SEQ ID NO2中從氨基酸編號1之Met到氨基酸編號235之Phe的氨基酸序列；SEQ IDNO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列；SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個方面，公開了抑制哺乳動物血液凝集的方法，該方法包括以足以抑制血液凝固的量，投用包括SEQ ID NO15之氨基酸序列的人Kunitz抑制劑，所說的序列中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本發(fā)明的另一個方面，公開了抑制哺乳動物血液凝固的方法，該方法包括以足以抑制血液凝固的量投用其中包含SEQ ID NO2中從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯丙氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。在本發(fā)明另一個方面，提供了抑哺乳動物血液凝固的方法，該方法包括以足以抑制血液凝固的量投用其中進(jìn)一步在其氨基末端包括SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。
在本發(fā)明的另一個方面。提供了至少有12個核苷酸的探針，其中探針能夠與編碼Kunitz型抑制劑區(qū)域的核酸或編碼與SEQID NO1或其變體互補(bǔ)之DNA序列的DNA片段雜交，其中所說的核酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列、SEQ ID NO1的核苷酸變體。
參見下列詳述描述后將會更加明顯地了解本發(fā)明的這些及其他方面。
本發(fā)明提供了新的人Kunitz型抑制劑。本發(fā)明抑制劑的一個優(yōu)點(diǎn)是它們在沒有因子Xa的情況下抑制因子VIIa，因此不需要通過內(nèi)在或外在性途徑產(chǎn)生因子Xa更具體地說，本發(fā)明提供了新的、以前不知道的Kunitz型抑制劑，該抑制劑與組織因子途徑抑制劑(TFPI)共享氨基酸序列同源性及所有區(qū)域組織。已將此新的Kunitz型抑制劑定名的TFPI-2。
本發(fā)明的特征包括分離的編碼新的人Kunitz型抑制劑的DNA分子。這些分離的分子是從其天然環(huán)境中分離的分子并包括cDNA和基因組克隆。所提出的本發(fā)明的分離的DNA分子沒有天然與之聯(lián)系的其他基因并可包含代表調(diào)節(jié)區(qū)域如啟動子和終止子的天然存在的5’和3’非翻譯序列。有關(guān)天然存在之5’和3’非翻譯區(qū)內(nèi)調(diào)節(jié)區(qū)域的鑒定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的(如參見Dynan and Tiian，Nature 316774-778，1985；Birnstiel et al.，Cell 41349-359，1985；Proudfoot，Trends in biochem.Sci.14105-110，1989；和Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，second Ed.，Cold Spring Harbor，NY，1989；這些文獻(xiàn)均列入本文作為參考文獻(xiàn))。
本發(fā)明的分離的DNA分子可用于生產(chǎn)重組人Kunitz型抑制劑。因此，本發(fā)明提供了可以大量生產(chǎn)并可很容易地用本領(lǐng)域已知方法純化人Kunitz型抑制劑的優(yōu)點(diǎn)(參見Scopes，ProteinPurification，springer-Verlag，NY，1982)。另外，也可以使用常規(guī)合成方法如Barany和Merrifield(The Peptides.Analysis，Synthesis，Biology，Vol.2，Gross and Meienhofer，eds，AcadernicPress，NY，PP.1-284，1980)所述固相合成法、部分固相合成技術(shù)、片段綜合法或傳統(tǒng)溶液加入法合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明另一特征是分離的人Kunitz型抑制劑。本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)和肽是與一種特別適于作藥物使用的蛋白質(zhì)制劑至少有大約50％同源性，更好有70-80％同源性，最好有95-99％同源性的蛋白質(zhì)。
可以基本上按照Norris等人(Biol.Chem.，Hoppe-Seyler37137-42，1990)所述的方法檢測Kunitz型抑制劑活性。簡單地說，在100mM NaCl、50mM Tris-HCl、0.01％Tween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯)(PH 7.4)中，于0.24μg/ml獵胰蛋白酶(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Penmark)、12.8CU/L人血漿(Kabi，Stockholm，sweden)或0.16nKat/ml人血漿激肽釋放酶(Kabi)存在下，25℃保溫各種固定濃度的Kunitz型抑制劑。30分鐘保溫后，經(jīng)裂解含有溶于檢測緩沖液中之0.6mM產(chǎn)色肽酰硝基酰苯胺胰蛋白酶/纖溶酶底物S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Kabi)或S2302(D-Pro-Phe-Arg-Nan；Kabi)的溶液，以檢測殘留品酶促活性，之后將樣品保溫30分鐘，于405nm處檢測各樣品的吸光率。根據(jù)405nm吸光率或460nm熒光Em的降低檢測酶活性的抑制率。根據(jù)檢測結(jié)果計算表觀抑制常數(shù)Ki。
可按已公開的治療深靜脈血栓形成、彌散性血管內(nèi)凝血、肺栓塞及預(yù)防手術(shù)后血栓形成的方法使用本發(fā)明的Kunitz型抑制劑。
本發(fā)明涉及新的人Kunitz型抑制劑，其包含由包括SEQ IDNO14、SEQ ID NO1的核苷酸序列或其部分編碼的SEQ IDNO15、SEQ ID NO2中所示的氨基酸序或其部分。將SEQID NO2所示TFPI-2的氨基酸序列與其他Kunitz型抑制劑特別是與TFPI相比較，顯示該蛋白質(zhì)包含三個推測的Kunitz型抑制劑區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知道，用于每個各別區(qū)域或區(qū)域組合均可用化學(xué)方法或本發(fā)明中使用的重組DNA技術(shù)制得。推測的Kunitz型抑制劑區(qū)域包括SEQ ID NO2所示從氨基酸編號36之半胱氨酸到氨基酸編號86之半胱氨酸、從氨基酸編號96之半胱氨酸到氨基酸編號149之半胱氨酸，和從氨基酸編號158之半胱氨酸到氨基酸編號208之半胱氨酸的氨基酸序列。更具體地說，本發(fā)明的Kunitz型抑制劑包括SEQ ID NO2中從氨基酸編號36之半胱氨酸到氨基酸編號86之半胱氨酸的氨基酸序列。Kunitz區(qū)域是由據(jù)信形成二硫橋鍵的六個有特定位置之半胱氨酸酸基的定位限定的(參見Laskowski and Kato，出處同上；Brozeet al.，Biochemistry 297539-7546，1990)。第一和第六個半胱氨酸殘基限定各Kunitz區(qū)域的邊界。因此就TFPI-2來說，Kunitz區(qū)域是由殘基36和89、96和149、158和208為邊界的(按照SEQ ID NO2的氨基酸編號)。為了提供適當(dāng)?shù)亩蜴I形成和蛋白質(zhì)構(gòu)象，期望在限定Kunitz區(qū)域之各半胱氨酸側(cè)冀包括至少兩個氨基酸。然而，這些側(cè)翼殘基的同一性并不是嚴(yán)格的。因此有可能制備包括上述“核心”Kunitz序列之個別Kunitz區(qū)域的變體，其中在其氨基或羧基末端上間隔除半胱氨酸殘基外的2-4個或多個氨基酸殘基而側(cè)接多肽核心。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出的，可以使用化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)制備Kunitz型抑制劑的氨基末端和/或羧基末端延伸部分并試驗(yàn)抑制活性。
在使用與抑制劑編織序列的一部分互補(bǔ)的反義寡核苷酸探針篩選相當(dāng)于相關(guān)但不同的Kunitz型抑制劑之基因組克隆的cDNA期間，意外地鑒定了編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列。分析cDNA克隆后揭示，這些克隆編碼稱為TFPI-2的獨(dú)特的，以前未知的Kunitz型抑制劑。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可由實(shí)質(zhì)上相似于本文公開之DNA序列的DNA序列編碼。本文中所說的“實(shí)質(zhì)上相似的”DNA序列包括含有保守氨基酸取代和/或小的氨基酸加入、取代或缺失的，TFPI-2的等位基因變體及基因工程改造的或合成的變體。DNA序列變體也包括DNA密碼的簡并，其中宿主偏愛密碼子取代了人序列中的類似密碼子。另外，基本上相似的DNA序列是能夠在高或低嚴(yán)格條件下(參見Sambrook et al.，31文同上)與本發(fā)明的DNA序列雜交的序列，以及例如由于遺傳密碼的結(jié)果而與本發(fā)明的氨基酸序列簡并的序列?？梢允褂霉押塑账岫c(diǎn)特異性誘變、使用限制性核酸內(nèi)切酶消化及接頭連接，或使用文獻(xiàn)中已確定的其他方法(例如參見Sambrook et al.，出處同上；Smith et al.，Genetic EngineeringPrinciples and methods，Plenum Press，1981；其列入本文作為參考文獻(xiàn))制得基因工程改造的變體。
可使用例如Maniatis等人(Molecular Cloning A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，NY，1982；列為本文參考文獻(xiàn))、Sambrook等人(Molecular cloningA Laboratory Manual，Second Ed.，Cold Spring Harbor，NY，1989；列為本文參考文獻(xiàn))或Mullis等人(美國專利No.4,683,195；列為本文參考文獻(xiàn))所述的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法分離本發(fā)明的DNA分子?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如在自動DNA合成儀上合成本發(fā)明的編碼序列。如將在下文中更詳細(xì)討論的，一種新的，以前未知的人Kunitz型抑制劑被鑒定為1.0 Kb cDNA插入段并包含SEQ ID NO1所示的DNA片段。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，使用根據(jù)SEQ IDNO1或其互補(bǔ)序列設(shè)計的引物，以PCR擴(kuò)增法制得編碼本發(fā)明Kunitz型抑制劑的DNA序列。
也可以使用本文所述的DNA序列和方法，篩選胎盤、肝或臍帶靜脈細(xì)胞cDNA或基因組文庫，從非人動物如狗、兔、雞、豬，小鼠、大鼠和牛得到編碼TFPI-2的DNA分子。
例如，可以使用本發(fā)明的DNA分子或其部分作為探針，以直接檢測細(xì)胞中的TFPI-2序列。這樣的DNA分子一般是合成寡核苷酸，但可從克隆的cDNA或基因組序列產(chǎn)生，并且一般將至少包含12個核苷酸，更常見包括大約14到25個或更多個，有時是40到60個核苷酸，在某些情況下包括一個實(shí)質(zhì)性部分，甚或是整個TFPI-2基因或cDNA。本發(fā)明的合成寡核苷酸與相應(yīng)TFPI-2DNA序列(SEQ ID NO1)或其互補(bǔ)序列至少有85％同一性。為了用作探針，標(biāo)記這些分子以提供可檢測信號，例如按本領(lǐng)域已知方法用酶、生物素、放射性核素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光劑、順磁顆粒等標(biāo)記所說的分子。
可使用本發(fā)明的探針，以診斷方法檢測細(xì)胞代謝紊亂如血栓形成紊亂。
可以標(biāo)記本發(fā)明中使用的DNA分子并用于與Southern或點(diǎn)印跡相似的雜交程序中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解到的。可以使用本領(lǐng)域已知的并且例如由Sambrook等人(MolecularCloningA Laboratory Manual，2th Ed.，Cold Spring Harbor，NY，1989；其被列入本文作為參考文獻(xiàn))綜述的方法，確定本發(fā)明的DNA分子與TFPI-2序列雜交的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用文獻(xiàn)中公開的方法(例如參見Sambrook et al.，出處同上，pp.11.45-11.53)改變DNA分子的雜交條件(即雜交的嚴(yán)格性)以適用于各種雜交程序。雜交的嚴(yán)格性較高，檢測出的錯配序列的數(shù)目越少。另外，較低的嚴(yán)格性可充許鑒定相關(guān)序列。
或者，可以使用本發(fā)明的DNA分子鑒定TFPI-2蛋白質(zhì)序列變體，并且使用經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(由Saiki et al.，Science239487，1987；Mullis et al.，U.S.Paten 4,686,195；和Mullis et al.，U.S.Patent 4,683,202公開的)擴(kuò)增DNA序列，然后根據(jù)其在瓊脂糖凝膠上的特征性大小檢測之，或者進(jìn)行序列分析的檢測序列異常性。
可以將本發(fā)明的編碼Kunitz型抑制劑的DNA分子插入到DNA構(gòu)建體中。本文中使用的術(shù)語“DNA構(gòu)建體”(也稱為表態(tài)載體)是指單鏈或雙鏈的DNA分子或這種分子的克隆，其已通過人類干預(yù)受到修飾而含有的一種另外存在于自然界中的方式組合的拼接的DNA片段。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含編碼Kunitz型抑制劑的第一DNA片段，該片段則可通過人工操作連接到為表達(dá)該第一DNA片段所需要的附加DNA片段上。在本發(fā)明的內(nèi)容中，附加DNA片段一般將包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子，并可進(jìn)一步包括增強(qiáng)子和其他元件。還可包括一個或多個可選擇標(biāo)記?？梢杂煤苋菀椎玫降慕M分或者可從商業(yè)途徑購得商品制備在各種原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)已克隆之DNA片段所需的DNA構(gòu)建體。
在一個實(shí)施方案中，該DNA序列編碼包括SEQ ID NO15中所示氨基酸序列的Kunitz型抑制劑，所說的序列中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在另一個實(shí)施方案中，該DNA序列編碼包括SEQ ID NO2中從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編碼235之苯丙氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。在另一個實(shí)施方案中，第一DNA序列編碼包括從SEQ ID NO2中氨基酸編碼34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制劑。在另一個實(shí)施方案中Kunitz型抑制劑包括SEQID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，Kunitz型抑制劑包括SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
DNA構(gòu)建體也可含有指導(dǎo)感興趣多肽或蛋白質(zhì)的分泌所必需的DNA片段。這樣的DNA片段可包括至少一個分泌信號序列。也稱為前導(dǎo)序列、早前序列和/或前序列的分泌信號序列是起指導(dǎo)成熟多肽或蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌作用的氨基酸序列。這樣的序列是以一個疏水氨基酸核心為特征是，并通常(但不是絕對地)見于所合成之蛋白質(zhì)的氨基末端。在分泌期間分泌肽常常從成熟蛋白質(zhì)上被裂解掉。這種分泌肽含有當(dāng)其通過分泌途徑時充許從成熟蛋白質(zhì)上裂解分泌肽的加工位點(diǎn)。一個優(yōu)選的加工位點(diǎn)是例如由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KEX2基因識別的二堿基裂解位點(diǎn)。一個特別優(yōu)選的加工位點(diǎn)是Lys-Arg加工位點(diǎn)。加工位點(diǎn)可能編碼在分泌肽內(nèi)或者可以例如經(jīng)體外誘變加到該肽上。
優(yōu)選的分泌信號包括α因子信號序列(早前序列Kurjan andHerskowitz，Cell 30933-943，1982；Kurjan et al.，U.S.Patent No.4,546,082；Brake，EP 116，201)、PH05信號序列(Beck et al.，WO 86/00637)、BARI分泌信號序列(Mackay et al.，U.S.PatentNo.4,613,572；Mackay，wo 87/002670)SUC2信號序列(Carlsonet al.，Molecular and cellular biology 3439-447，1983)，α-1-抗胰蛋白酶信號序列(Kurachi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786826-6830，1981)、α-2血漿抑制劑信號序列(Tone etal.，J.Biochem.(Tokyo)1021033-1042，1987)，和組織血纖維蛋白溶酶原激活劑信號序列(Pennica et al.，Nature 301214-221，1983)?；蛘?，可以按照已確定的例如由von Heinje確定的規(guī)則(European Journal of Biochemistry 13317-21，1983；J.ofMolecular Biology 18499-105，1985；Nucleic Acids Research 144683-4690，1986)合成分泌信號。一個特別優(yōu)選的信號序列是WO90/10075(該文獻(xiàn)全文列入本文作為參考文獻(xiàn))中所述的合成信號Lac ZR spx(1-47)-ERLE。
可以單一地或組合使用分泌信號序列。例如，可將第一分泌信號序列與編碼第三屏障區(qū)域的序列組合使用(參見U.S.PatentNo.5,037,243，該文獻(xiàn)列入本文作為參考)。第三屏障區(qū)域可定位在感興趣DAN片段的適當(dāng)閱讀框架3’端或該DNA片段的5’端，并在有分泌信號序列和感興趣DNA片段的適當(dāng)閱讀框架中。
適當(dāng)啟動子、終止子和分泌信號的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在釀酒酵母中表達(dá)已克隆基因的方法總地說來是本領(lǐng)域已知的(參見“Gene Expression TechNology”，Methods inEnzymology，vol.185，Goeddel(ed.)，academic Press，San Diego，CA 1990和“Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”，Methods in Enzymology Guthrie and Fink(eds.)，Academic Press，San Diego，CA，1991；這些文獻(xiàn)均列入本文作為參考文獻(xiàn))。也可以在絲狀真菌例如曲霉質(zhì)真菌的菌株(Mcknight et al.，V.S.Patent No.4,935,349，該文獻(xiàn)列入本文作為參考文獻(xiàn))中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如Sambrook等人(Molecular CleningALaboratory Mamcal，2th Eds.Cold spring Harbor，NY，1989)詳細(xì)討論了在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中和大腸桿菌中表達(dá)已克隆基因的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，可使用文獻(xiàn)中確認(rèn)為調(diào)節(jié)序列、載體和方法，在其他宿主細(xì)胞和鳥、昆蟲和植物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
在酵母中，用于本發(fā)明的適當(dāng)酵母載體包括YRp 7(struhl etal.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 761035-1039，1978)、YEp 13(Broach et al.，Gene 8121-133，1979)、POT載體(Kawasakiet al.，U.S.Patent No.4,931,373，該文獻(xiàn)列入本文參考文獻(xiàn))、pJDB 249和pJDB 219(Beggs，Nature 275104-108；1978)及其衍生物。用于酵母中的優(yōu)選啟動子包括得自酵母糖酵解基因(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.25512073-80，1980；Alber andKawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，U.S.Patent No.4,599,311)或醇脫氫酶基因(Young et al.，GeneticEngineering of Midroorganisms for Chemicals，Mollaender et al.，(eds)，pp.355，Plenum，N.Y.1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)的啟動子。其中特別優(yōu)選的啟動子是TPI1啟動子(Kawasaki，U.S.Patent No.4,599,311,1986)和ADH2-4c啟動子(Russell et al.，Nature 304652-654，1983；Irani andKilgore，U.S.Patent Application Serial No.07/784,683、CA1,304,020和EP 284 044)。表達(dá)單位也可包括轉(zhuǎn)錄終止子。一個優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是TPI1終止子(Alber and kawasaki，引文同上)。
然后培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生Kunitz型抑制劑。按照標(biāo)準(zhǔn)方法在含有特定宿主細(xì)胞生長所需營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。多種適當(dāng)培養(yǎng)基都本領(lǐng)域中已知的并且一般都含有碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及生長因子。生長培養(yǎng)基一般是例如借助藥物選擇或基于必需營養(yǎng)素的缺陷來選擇含DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，其中所說的缺陷則由DNA構(gòu)建體上的可選擇標(biāo)志或用DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染得以補(bǔ)償。
例如，較好將酵母細(xì)胞培養(yǎng)在含有非氨基酸氮源、無機(jī)鹽、維生素及必需氨基酸添加物的化學(xué)上限定的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的pH較好保持在大于2和小于8的pH范圍內(nèi)，更好是pH6.5。保持適當(dāng)PH的方法包括緩沖的恒定PH控制，較好是通過加入氫氧化鈉。優(yōu)選緩沖劑包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical co.，St.Louis，MO)。較好將天冬酰胺連接的糖基化所需基因有缺陷的酵母細(xì)胞培養(yǎng)在含有滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中。優(yōu)選的滲透穩(wěn)定劑是以0.1M至1.5M，較好0.5M到1.0M的濃度添加到培養(yǎng)基中的山梨醇。哺乳動物細(xì)胞一般是培養(yǎng)在商業(yè)上可購得的含血清或無血清培養(yǎng)基中。對用于培養(yǎng)特定宿主細(xì)胞之培養(yǎng)基的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞中的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法(Wigler et al.，Ceu 14725，1978；Corsaroand Pearsou，somatic Cell Genetics 7603，1981Graham and Vander Eb，Virology 52456，1973)、電穿孔法(Neumann et al.，EMBO J.1841-845，1982)及DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法(Ausubel et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)(上述文獻(xiàn)均列入本文參考文獻(xiàn))。也可以按照制造商提供的說明書，使用包括BoehringerMannheim轉(zhuǎn)染試劑(N-〔1-(2，3-二油酰氧基)丙基〕-N，N，N-三甲基甲基硫酸銨、Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)或LIPOFECT試劑(N-〔1-(2，3-二油酰氧基)丙基〕-N，N，N-三甲基氨化銨和二甲酰氧基磷酯酰乙胺；GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)在內(nèi)的商品試劑進(jìn)行陰離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。例如，美國專利No.4,713,339 Kevinso等人、美國專利No 4,784,950 Hagen等人、美國專利No 4,579,821(Palmiter等人)和美國專利No.4,656,134(Ringold)中公開了在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法。優(yōu)選的培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-F(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)和293(ATCC No.CRL1573；Graham et al.，J.Gen.Virol.3659-72，1977)細(xì)胞系。其他適用細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的并可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type culture collection，Rockville，Maryland)等公共保藏機(jī)構(gòu)得到之。
用常規(guī)方法分離和純化按本文所述方法表述的重組Kunitz型抑制劑，這些方法包括經(jīng)離心和過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，借助鹽如硫酸銨沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)成分、以各種層析方法如離子交換層析或親和層析等進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)純化方法是本領(lǐng)域中已知的(總地參見Swpes，R.，Rrotein Purification，springer-Verlag，NY(1982)，該文獻(xiàn)列為本文參考文獻(xiàn))并可用于純化本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的Kunitz型抑制劑可以利用抑制劑的能力與胰蛋白酶結(jié)合。簡單地說，加入固體Tris-HCL至終濃度50mM并用4同NaOH滴定，將總共約1升發(fā)酵上清液調(diào)到pH 8.0。過濾后除去細(xì)胞碎片，將上清液加樣到吸附于CNBr活化之Sepharose上之牛胰蛋白酶柱上(每35ml凝膠350mg牛胰蛋白酶)。相繼用150ml0.1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.5 M NaCl、150ml 0.01MTris-HCL(pH 8.0)洗柱，然后用200ml 0.2M甘氨鹽-HCL(pH 3.0)洗脫結(jié)合的材料。以10ml一管收集洗脫物并用反相HPLC分析之。合并含蛋白質(zhì)的部分。
將合并加樣于已用5％B(溶于乙腈的7％TFA)和95％A(加于水中的0.1％TFA)平衡過的制備性反相HPLC柱上。流速保持在4ml/分鐘。上樣后，用5％B洗柱直至達(dá)到214nm吸光率基線。在80分鐘內(nèi)用5-85％B進(jìn)行梯度洗脫并收集洗脫物。用反相HPLC(Vydac)柱分析含UV吸收材料的各管，合并得到層析純材料。真空離心從合并的部分中除去溶劑。經(jīng)反相HPLC分析并與抑蛋白酶肽標(biāo)準(zhǔn)品比較。以估計主合并洗脫物中抑制劑的濃度和總產(chǎn)率。用電子噴射質(zhì)譜法(SCIEX API III)等方法定性終制劑。
當(dāng)存在蛋白水解裂解Kunitz型抑制劑的潛在問題時，也可使用基本如Norris等人(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 37137-42，1992，該文獻(xiàn)全文列為本文參考文獻(xiàn))所述的方法純化本發(fā)明的抑制劑。簡單地說，使選擇的轉(zhuǎn)化株于30℃在10升YEPD中生長約40小時，直至OD 600達(dá)到大約25。離心培養(yǎng)物，并棄去上清。上300-1000ml等份的上清液調(diào)到pH 2.3，并加樣于裝有已用20mM Bicine，pH 8.7(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)平衡過的珠狀瓊脂糖基質(zhì)如-Sepharaose(Pharmacia-LKBBiotechNology AS，Alleroed，Denmark)等的層析柱上。用20mMBicine(pH 8.7)徹底洗滌后，用30ml含有1M NaCl的20mM Bicine(pH 8.7)洗脫Kunitz型抑制劑。將洗脫的材料加于已用20mMNH4HCO3，pH 7.8平衡過的Sephadex G-25柱(小珠狀葡聚糖基質(zhì)，Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；2.5×30cm)或其他脫鹽層析柱上進(jìn)行脫鹽。用20mM NH4HCO3(pH 7.8)洗脫Kunitz型抑制劑。
在含有偶聯(lián)于小珠狀親水樹脂上之有帶電荷磺酸基團(tuán)的陽離子交換劑的柱上，如已用20mM Bicine(pH 8.7)平衡過的MONO S柱(Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；0.5×5cm)上，進(jìn)一步層析純化和濃縮Kunitz型抑制劑。用平衡緩沖液以2ml/分鐘的流速洗10分鐘后，用加在平衡緩沖液中的0-0.6M NaCl，在12分鐘時間以1ml/分鐘流速梯度洗脫Kunitz型抑制劑。合并峰值部分的樣品，并在例如Vydac 214 TP 510柱(Mikro-lab，Aarhus，Denmark；1.0×25cm)上使用反相HPLC純化Kunitz型抑制劑，其中用從5％A(溶于水的0.1％三氟乙酸(TFA))到45％B(加在乙腈中的0.7％TFA)的梯度在20分鐘內(nèi)以4ml/分鐘流速進(jìn)行洗脫。在水中凍干純化的產(chǎn)物，并檢測抑制劑活性。
或者，可使用肝素-瓊脂糖、帶有交聯(lián)到珠狀親水樹脂如NONO Q(Pharmacia)等上的季胺基團(tuán)的陰離子交換劑、有與珠狀親水樹脂如NONO S(Pharmacia)等交換之帶電荷磺酸基團(tuán)的陽離子交換劑及具有用于制備1×103到1×105MW蛋白質(zhì)之不同孔隙度的交換瓊脂糖凝膠過濾基質(zhì)如SUPEROSE 12(Pharmacia)等進(jìn)行系列層析，以從條件培養(yǎng)基中純化TFPI-2。簡單地說，將用1N NaOH調(diào)到pH 7.5并通過0.22μm濾器過濾的無血清條件培養(yǎng)基加到例如已用緩沖液A(50mMTris-HCl(pH 7.5)、10％甘油)于4℃下平衡過的肝素-Sepharose柱(Pharmacia biotech Inc.，Piscataway，NJ)上。將過濾的培養(yǎng)基于3ml/分鐘的流速過柱。用含有0.2M NaCl的緩沖液A洗柱。用含有1M NaCl的緩沖液A從柱上洗脫根據(jù)其抑制胰蛋白酶之能力(實(shí)施例4A)判定的TFPI-2活性。在4℃對25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油透析從肝素-Sepharose柱上得到的洗脫物。在含有陰離子交換劑的5×50mm柱上對保留物進(jìn)行HPLC(Pharmacia Biotech Inc.)，其中所說的交換劑具有與已在室溫下用25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油平衡過的水珠狀親水樹脂如MONO Q(MONO Q HR 5/5；Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)上的季胺基團(tuán)。以1ml/分鐘的流速用線性NaCl梯度(從0到0.5M NaCl)從柱上洗脫TFPI-2。合并TPPI-2活性部分并對25mM檸檬酸鈉(pH 5.0)、10％甘油透析。然后在具有與小珠狀疏水樹脂如MONO S(MONO S HR 5/5，Pharmacia Biotech Inc.)上之帶電荷磺酸基團(tuán)的陽離子交換劑上，以0.5ml/分鐘的流速對滯留物進(jìn)行FPLC層析。用從25ml檸檬酸鈉(pH5.0)、10％甘油至25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油、1M NaCl的梯度從MONO S柱上洗脫TFPI-2活性。合并合TFPI-2活性的部分并經(jīng)超濾濃縮到1ml。通過已過室溫下在50mM Tris-HCl(pH7.5)100mM NaCl中平衡的具有適于分離1×103至3×105MW之蛋白質(zhì)的孔隙度的交聯(lián)瓊脂糖凝膠過濾基質(zhì)如SUPEROSER(Pharmacia Bitech Inc.，Piscataway，NJ)，對濃縮的樣品進(jìn)行FPLC。對從FPLC上洗脫的具有TFPI-2活性的部分進(jìn)行SDS-PAGE，并合純的TFPI-2部分并于-80℃下貯存之。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明Kunitz型抑制劑連同藥學(xué)上可接受之載體的藥物組合物。在本發(fā)明的組合物中，可按照已建立的配制藥物組合物的方法(如參見Remington’s PharmacecuticalSciences，1985)配制Kunitz型抑制劑。該組合物一般可以是適于全身注射或輸注形式的，并可以用無菌水或等滲鹽水或葡萄糖溶液進(jìn)行配制。
因此，預(yù)想本發(fā)明的Kunitz型抑制劑可有利地用于需要使用組織因子途徑抑制劑的治療目的。這些應(yīng)用目的包括治療彌散性血管內(nèi)凝血、深靜脈血栓形成，肺栓塞及用于預(yù)防外科創(chuàng)傷后血栓形成。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會了解到的，本發(fā)明的Kunitz型抑制劑可以與其他治療劑合用以增強(qiáng)這些藥劑的抗血栓或抗凝血活性。例如，TFPI-2可以與組織血纖維蛋白溶酶原激活劑聯(lián)合用于溶栓治療。由于它們能夠抑制因子VIIa/組織因子復(fù)合物而適用使用本發(fā)明的這些Kunitz型抑制劑。
因此本發(fā)明的Kunitz型抑制劑可用于抑制哺乳動物血液凝固的方法中。這些方法一般包括以足以抑制血液凝固的量投用Kunitz型抑制劑。可根據(jù)被治療之病理狀態(tài)的嚴(yán)重程度確定用量，并可在大約10μg/kg到10mg/kg體重范圍內(nèi)有所變化。投用的優(yōu)選Kunitz型抑制劑劑量為每公斤體重100mg和5mg范圍內(nèi)，最佳范圍為每公斤體重100mg和1mg范圍內(nèi)。
除了如上文指出的藥用目的外，還可使用上文指定的Kunitz型抑制劑，例如用篩選檢測法或親和層析法從直接或間接與Kunitz型抑制劑結(jié)合的人材料中分離有用的天然物質(zhì)，例如蛋白酶或受體。
在本發(fā)明的一個方面，利用Kunitz型抑制劑，包括其衍生物及這些蛋白質(zhì)的部分或片段制備與Kunitz型抑制劑特異結(jié)合的抗體。本文所述的術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段如F(ab’)和Fab片段，以及重組產(chǎn)生的結(jié)合對象。這些結(jié)合對象摻入了來自編碼特異性結(jié)合單克隆抗體的可變區(qū)。如果抗體以大于或等于107/M的Ka值與Kunitz型抑制劑結(jié)合，則它們即被限定為特異性結(jié)合?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法(參Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51660-672，1949)很容易地檢測單克隆抗體或結(jié)合對象的親和性。分離的抗體是那些實(shí)質(zhì)上沒有其他血液成分的抗體。
文獻(xiàn)中已充分描述了制備單克隆和多克隆抗體的方法(例如參見Sambrook et al.，引文同上；Hurrell.J.G.R.，Ed.，MoNoclonal Mybridoma AntibodiesTechniques and Applications，CrE Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L，1982)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可會看出的，可以從馬、牛、山羊、綿羊、狗、雞、免、小鼠或大鼠等多種溫血動物體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗體?？赏ㄟ^使用佐劑如弗氏完全估劑或不完全佐劑來提高Kunitz型抑制劑的免疫原性?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種檢測法檢測與Kunitz型抑制劑特異結(jié)合的抗體。文獻(xiàn)(AntibodiesA Laboratory Manual，Harlowand Lane(Eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)中已詳細(xì)描述了這些檢測法。這些檢測法的有代表性的例子包括并行免疫電泳法、放射免疫法、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附法、點(diǎn)印跡法、抑制或競爭法及夾心法。
可利用制備單克隆抗體的其他技術(shù)構(gòu)建和表述重組單克隆坑體。簡單地說，從B細(xì)胞群體中分離mRNA并用以在適當(dāng)載體如可得自Stratocyte(La Jolla，CA)的λIMMUNOZAP(H)和λIMMUNOZAP(L)載體中產(chǎn)生重和輕鏈免疫球蛋白cDNA表達(dá)文庫。然后個別篩選共表達(dá)這些載體，以生成Fab或抗體(Huseet al.，Science 2461275-1281，1989；Sastry et al.，Proc.Natl.Acad.sci.USA 865728-5732，1989)。然后將陽性噬斑轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢栽诖竽c桿菌中高水平表達(dá)單克隆抗體片段的非裂解質(zhì)粒。
也可以利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建如上文所述的結(jié)合對象，以摻入編碼特異性結(jié)合抗體之基因的可變區(qū)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地完成這些蛋白質(zhì)的構(gòu)建(例如參見Larrick et al.，BiotechNology 7934-938，1989；Reichmann et al.，Nature 322323-327，1988和Roberts et al.，Nature 328731-734，1987)。一旦制得了適當(dāng)?shù)目贵w或結(jié)合對象，即可用文獻(xiàn)中充分描述的許多技術(shù)分離或純化之(例如參見AntibodiesA Laboratory Manual，引文同上)。適用的技術(shù)包括蛋白質(zhì)或肽親和柱層析、HPLC或RP-HPLC、在蛋白A或蛋白G柱上層析純化或這些技術(shù)的組合使用。本發(fā)明中用以限定抗體或結(jié)合對象的術(shù)語“分離的”是指“實(shí)質(zhì)上沒有其他血液成分”。
可以按多種方法使用本發(fā)明的抗體或結(jié)合對象。例如可以將組織切片與特異性結(jié)合Kunitz型抑制劑的標(biāo)記的單克隆抗體一起保溫，然后檢測已結(jié)合之抗體的存在，以確定Kunitz型抑制劑的組織分布，本發(fā)明中適用的標(biāo)記物是本領(lǐng)域已知的，并包括但不只限于熒光素、異硫氰酸鹽、藻紅蛋白、辣根過氧化物酶及膠體金。也可以使用本發(fā)明的抗體純化本發(fā)明的Kunitz型抑制劑。文獻(xiàn)中已公開了抗體與固相載體偶聯(lián)的方法以及它們在純化蛋白質(zhì)中的應(yīng)用(例如參見Methods in Molecular Biology，Vol.1，Wallker(Ed.)，Humana Press，New Jersey，1984；該文獻(xiàn)全文列為本文參考文獻(xiàn))。
以舉例說明而不是限制的方式提供下列實(shí)施例。
實(shí)施例限制性核酸內(nèi)切酶及其他DNA修飾酶(如T4多聚核苷酸激酶、小牛堿性磷酸酶、DNA聚合酶I(KleNoW片段)、T4多聚核苷酸連接酶)得自GIBCO BRL Life TechNologies，Inc.(GIBCOBRL)和New Fngland Biolabs，并且除另有說明者外，并按制造者的指導(dǎo)使用之。
在Applied Biosysterms Model 380A DNA合成儀上合成寡核苷酸，并在變性凝膠上經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化之。按照Maniatis等人(Molecular ClomingA Laboratory Manual，Coldspring Harbor Laboratory，1982)或Sambrook等人(MolecularClomingA Laboratory Manual，2th ed.，Cold Spring Harbor，New York，1989)所述的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞?；旧习凑誗ambrook等人(文獻(xiàn)出處同上)所述的方法制備放射標(biāo)記的探針及雜交溶液。
實(shí)施例1新的人Kunitz押制劑cDNA的克隆使用30mer反義寡核苷酸(ZC4 792；SEQ ID NO3)篩選自各人組織來源的poly(A)+RNA。從Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)得到心臟、腦、胎盤、肝臟、肺、骨骼肌、腎臟和胰臟中人ploly(A)+RNA的印跡(HUMAN MTN BLOT)。使印跡在預(yù)雜交溶液(5×SSPE(表1)、2×Denhardt’s(表1)、0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)、100μg/ml超聲處理的硅魚精子DNA)中55℃預(yù)雜交4小時。預(yù)雜交后，除去預(yù)雜交溶液并換成含有4.7×106cpm/ml32p標(biāo)記之ZC 4792(SEQ ID NO3)的預(yù)雜交溶液。55℃保溫過夜后除去預(yù)雜交溶液，室溫下將印跡在2×SSC(表1)、0.05％SDS中洗20分鐘，再于55℃在2×SSC(表1)、0.1％SDS中洗20分鐘。使印跡對膠片曝光2.5小時。所得到的放射自顯影顯示在大多數(shù)泳道中有多條帶，表明呈現(xiàn)于印跡中的大多數(shù)組織中存在有相關(guān)序列。在2×SSC(表1)中，于60℃-65℃溫度下以高嚴(yán)格性條件將印跡洗30分鐘，然后使印跡對膠片曝光過夜。第二次射自顯影顯示胎盤和肝組織中存在1.6Kb帶，并且在胰臟組織中存在約1.2Kb的明顯較小的帶。
表1
20×SSPE175.3g NaCl27.6g NaH2PO4·H2O7.4g EDTA將固體物溶解在800ml蒸餾水中。用NaOH(約6.5ml 10N溶液)將pH調(diào)到7.4。用蒸餾水將體積調(diào)到1升。經(jīng)高壓除菌。
50×Denhardt’s5g Ficoll5g聚乙烯吡咯烷硐5g牛血清白蛋白(部分V)將固體物溶解到500ml終體積。將溶液過濾除菌并貯存于-20℃。
20×SSCE175.3g NaCl88.2g檸檬酸鈉將固體物溶解在800ml蒸餾水中。添加10N NaOH將pH調(diào)到7.0。用蒸餾水調(diào)整體積至1升。進(jìn)行高壓滅菌。
預(yù)雜交溶液#15×SSPF5×Denhardt’s0.5％SDS100μg/ml剪切的鮭精子DNA預(yù)雜交溶液#25×SSC
5×Denhardt’s0.5％SDS100μg/ml剪切的鮭精子DNA生長培養(yǎng)基含有5％胎牛血清、2mM L-谷氨酸、1×PSN(50μg/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、100μg/ml新霉素；GIBCO BRL)、10μM氨甲蝶呤的Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)。
無血清培養(yǎng)基500ml Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)0.29mg/ml L-谷氨酰胺10mg/L運(yùn)鐵蛋白5mg/L胎球蛋白(Aldrich，Milwaukee，WI)5mg/L胰島素(GIBCO BRL，Grrand Island，NY)2μg/L硒(Aldrich，Milwaukee，WI)除了上述成分外，培養(yǎng)基中還添加有10μM氨甲蝶呤、25-50mM HEPES緩沖溶液(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(pH 7.2)；JRH Biosciences，Lenxa，KS)和IXPSN(GIBCOBRL)。
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)8g氯化鈉0.2g氯化鉀1g磷酸鈉2g磷酸鉀將固體物溶解在蒸餾水中。將溶液體積調(diào)到1升。高壓滅菌。
為了得到編碼來自Kunitz家族之人胎盤蛋白質(zhì)抑制劑的DNA，使用基本上如上文所述的放射標(biāo)記的ZC 4792(SEQ IDNO3)篩選λgt11中的人胎盤cDNA庫(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)。滴定文庫，并以2×105pfn/平板鋪蓋在總共12個平板上，以得到2.4×106個獨(dú)立的噬斑。使用ICNBIOTRANS尼龍膜(ICN，Irvine，CA)制備復(fù)制噬斑。在5×SSC(表1)、0.5％SDS中50℃預(yù)洗滌膜1小時，然后在預(yù)雜交溶液#1(表1)中55℃預(yù)雜交過夜。除去預(yù)雜交溶液并換成含有7.2×107cpm ZC 4792探針(SEQ ID NO3)的新鮮預(yù)雜交溶液#1(表1)。在與預(yù)雜交相同的條件下進(jìn)行雜交。除于雜交溶液，于60℃在2×SSC(表1)、0.1％SDS中洗印跡。鑒定出14個陽性噬斑并使用放射標(biāo)記的ZC 4792(SEQ ID NO3)純化噬斑。
用ZGKI 13的特異性片段探查對14個克隆進(jìn)行噬斑純化所得到的三重濾膜，以鑒定并除去與淀粉樣前體蛋白類似物有同源性的克隆，其中ZGKI 13為含有淀粉樣前體蛋白類似物編碼序列的克隆(已作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化體于1992年10月14日保藏在American Type Culture Collection，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD，保藏登記號為ATCC 69090)。使用ZGKI 13的隨機(jī)引導(dǎo)的880bp Pst I-Xho I片段作為探針。濾膜在含有2×106cpm/ml標(biāo)記探針的預(yù)雜交溶液#2中65℃雜交過夜。雜交后，除去溶液，并在0.2×SSC(表1)、0.1％SDS中65℃洗濾膜。14個噬斑中有4個顯示編碼ZGKI13淀粉樣蛋白前體。棄去這4個克隆。
從稱為J-2-11的10個保留之純化噬菌體克隆之一中制備雙鏈DNA。用EcoRI消化質(zhì)粒DNA以分離約1kb cDNA插入段。將EcoRI亞克隆到用EcoRI切成線性的pUC 19中。對克隆之片段的序列分析證明了三個顯示與蛋白酶押制劑的Kunitz家族有強(qiáng)同源性的區(qū)域。使用對J-2-11克隆特異的標(biāo)記探針篩選9個其余噬菌體克隆(如上文所述)的三重濾膜。將三重濾膜在含有2×106cpm/ml激酶處理的寡核苷酸ZC 6281探針(SEQ IDNO4)的預(yù)雜交溶液#2(表1)中55℃雜交過夜。雜交后除去探針，并在2×SSC(表1)、0.1％SDS中60℃洗濾膜。濾膜的放射自顯影顯示，所有9個候選克隆均含有與J-2-11同源的序列。選擇一個克隆并定名為J-2-11/pUC 19。
質(zhì)粒J-2-11/pUC 19作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化體于1993年9月17日保藏于American type Culture Collection(12301 Parklawn D.，Rockville，MD)，登記號為69425。質(zhì)粒含有SEQ ID NO1中所示的序列分析序列顯示有36核苷酸的5’非編碼區(qū)、編碼235氨基酸的705核苷酸開放閱讀框架，和235核苷酸3’非編碼區(qū)。推測的氨基酸序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)與其他Kunitz型抑制劑相比較，顯示與TFPI的氨基酸同源性和區(qū)域結(jié)構(gòu)相似性。
使用32P末端標(biāo)記的相當(dāng)于TEPI-2序列(ZC 6281；SEQID NO4)的寡核苷酸篩選人組織之poly(A)+mRNA的印跡，以確定轉(zhuǎn)錄物的組織分布。使印跡在含有5×SSPE(表1)、2×Denhardt’s(表1)、0.5％SDS、100μg/ml鮭精子DNA的預(yù)雜交溶液中于55℃預(yù)雜交幾個小時。預(yù)雜交后，除去溶液，并使印跡在含有激酶化ZC 6281(SEQ ID NO4)的新鮮預(yù)雜交溶液中55℃雜交過夜。在0.2×SSC(表1)、0.1％SDS中65℃洗印跡并對膠片曝光。分析放射自顯影顯示TFPI-2在胎盤和肝臟中轉(zhuǎn)錄。繼后的Northern分析證明人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中存在TEPI-2轉(zhuǎn)錄物。一個轉(zhuǎn)錄物表現(xiàn)為1.4kb，同時有一個可能的約2kb的小的轉(zhuǎn)錄物?；谧铋LTFPI-2克隆的大小，因?yàn)闆]看到多腺苷酸化序列，故有可能是該克隆代表了丟失某些3’非編碼序列的轉(zhuǎn)錄物。因?yàn)樵?’末端未見有接頭序列，所以該末端的EcoRI位點(diǎn)似乎是一個內(nèi)部位點(diǎn)。因此，該mRNA大小預(yù)示全長轉(zhuǎn)錄物中有一個附加的400bp 3’(或5’)非編碼序列。
實(shí)施例2在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)新的人Kunitz型抑制劑在哺乳動物表達(dá)載體Zem 229R中表達(dá)由克隆J-2-11編碼的新的人Kunitz型抑制劑。載體Zem 229R已作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化體于1993年9月28日保藏在American Type Culture Collection(12301 Partlawn Dr.Rockville，MD 20852)，登記號為69447。將J-2-11/pUC 19中的約1kb EcoRI片段連接到已用EcoRI切成線性的Zem 229R中。根據(jù)在與啟動子相關(guān)之適當(dāng)與向上含有插入段的質(zhì)粒的存在篩選轉(zhuǎn)化體。鑒定陽性克隆并制備質(zhì)粒DNA。使用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法(Wigler et al.，Cell 14725，1978；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Grraham and Van der Eb，Virology 52456，1973)，用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染BHK 570細(xì)胞。BHK細(xì)胞已于1989年12月20日保藏在American Type Culture Collection(ATCC，12301 Parklawn Dr.，Pockville，MD，20852，USA)，登記號為CRL 10314。首先在含1μM氨甲蝶呤培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后在含10μM氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中進(jìn)行更嚴(yán)格的選擇。在10μM氨甲蝶呤中選擇后，使隨機(jī)選擇的克隆的含生長培養(yǎng)基(表1)的6孔平皿中生長至細(xì)胞匯合。達(dá)到細(xì)胞匯合后，棄去已用過的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖鹽(PBS，表1)洗細(xì)胞以除掉殘留的血清。向細(xì)胞內(nèi)加入無血清培養(yǎng)基(表1)，并使細(xì)胞生長24-48小時。收集條件培養(yǎng)基并使用實(shí)施例4A中詳細(xì)描述的檢測法檢測胰蛋白酶抑制劑活性。
選擇具有最高胰蛋白酶抑制劑活性的克隆進(jìn)行大批量培養(yǎng)。擴(kuò)充該克隆的細(xì)胞并接種到小的大的細(xì)胞工廠中，使之在含有10mg/L抑蛋白酶肽(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)的生長培養(yǎng)基(表1)中生長到細(xì)胞匯合。達(dá)到匯合后除去培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞并加入含有10mg/L抑蛋白酶肽的無血清培養(yǎng)基(表1)。每2-4天收集一次培養(yǎng)基并貯存于-20℃下。
實(shí)施例3在釀酒酵母中表達(dá)Kunitz型抑制劑區(qū)域A.表達(dá)含有SEQ ID NO2中氨酸34到89之TFPI-2的Kunitz型抑制劑區(qū)域在釀酒酵母的菌株中從PCR產(chǎn)生的序列開始表達(dá)在質(zhì)粒pJ-2-11/pUC 19中編碼的并含有SEQ ID NO2所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制劑區(qū)域。擴(kuò)增從pJ-2-11/pUC 19得到的編碼Kunitz型抑制劑區(qū)域的DNA序列。設(shè)計作為PCR擴(kuò)增引物的合成的寡核苷酸引物M-2161和M-2177(分別見SEQ ID NO5和NO6)。合成的寡核苷酸M-2177互補(bǔ)于SEQ ID NO1的核苷酸288-305，還攜帶含有翻譯終止密碼及其后XbaI位點(diǎn)的5’延伸部分。寡核苷酸M-2161含有與SEQ ID NO7中所示合成前導(dǎo)序列之核苷酸215-235相同的序列，其后是SEQID NO1的核苷酸138-154。按照制造商提供的說明書，使用1μg質(zhì)粒pJ-2-11/pVC 19，各100pmole寡核苷酸M-21 61和M-2177(SEQ ID NO5和NO6)、及GENEAMP試劑盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)中提供的試劑，以100μl終體積進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)擴(kuò)增19次循環(huán)(94℃/20秒，50℃/20秒和72℃/30秒)，然后于72℃保溫10分鐘。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離205bp片段。
經(jīng)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pKFN-1000的一個片段得到編碼合成之信號序列(SEQ ID NO7)的DNA序列。質(zhì)粒pKFN-1000是含有編碼一合成的酵母信號前導(dǎo)肽之DNA序列的質(zhì)粒pTZ 19R(Meacl et al.，Prot.Engin.，167-74，1986)的衍生物。WO90/10075(該文獻(xiàn)全文列為本文參考文獻(xiàn))中描述了質(zhì)粒pKFN-1000。SEQ ID NO7和8中顯示了質(zhì)粒pKFN-1000之EcoRI位點(diǎn)下游235堿基對的并編碼氨基酸序列的DNA序列。使用質(zhì)粒pKFN-1000的0.7kb Pvu II片段作為模板。合成的寡核苷酸NOR-1478(SEQ ID NO9)相同于恰在EcoRI位點(diǎn)之上游的序列(SEQ ID NO7的核苷酸1-6)。合成的寡核苷酸NOR-2523(SEQ ID NO10)互補(bǔ)于SEQ ID NO7中所示的編碼序列的核苷酸215-235。按照制造商的說明書，使用0.1μg 0.7kb Pvu II片段、各100pmole寡核苷酸NOR-1478和NOR-2523(分別見SEQ ID NO9和NO10)及GENEAMP商品試劑盒(Perkin Elmer Cetus)中的試劑，以100μl終體積進(jìn)行PCR反應(yīng)。按上述程序完成PCR反應(yīng)。以瓊脂糖凝膠電泳法分離257bp PCR產(chǎn)物。
按上述方法擴(kuò)增兩個PCR片段，得到可操作地連接到Kunitz型抑制劑區(qū)域序列上的編碼完整合成信號序列上的DNA序列。使用的各100pmole引物NOR-1478(SEQ ID NO9)和M-2177(SEQ ID NO6)及各0.1μg上述兩PCR片段，按上述方法進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)擴(kuò)增16次循環(huán)(94℃/1分鐘，50℃/2分鐘，71℃/3分鐘)，然后于72℃保溫10分鐘。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離437bp片段。然后用EcoRI和XbaI消化該片段，并將該所得408bp片段與已用EcoRI和XbaI切成線性的質(zhì)粒PTZ 19R連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)限制-、修飾+大腸桿菌菌株，并在氨芐青霉素存在下選擇轉(zhuǎn)化體。測定由選擇之轉(zhuǎn)化體制備的質(zhì)粒DNA，并鑒定含有與Kunitz型抑制劑區(qū)域融合之合成酵母信號序列的DNA序列的質(zhì)粒。
然后分離編碼分泌信號-Kunitz型抑制劑區(qū)域的EcoRI-XhaI片段，并亞克隆到質(zhì)粒pMT-636中。質(zhì)粒pMT-636衍生于穿梭載體pCPOT(質(zhì)粒pCPOT已于1984年5月9日保藏在American Type Culture Collection，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD；登記號為No.39685)其中已刪除含釀酒酵母LEU2基因的0.4kb Hpa I-Hru I片段，另外含有釀酒酵母TPI1啟動子和側(cè)接EcoRI-XbaI定向克隆位點(diǎn)的TPI1終止子，從而使DNA插入段以與Schizosaccharomyces Pombe POT 1基因(Norris et al.，引文同上)相同的方向轉(zhuǎn)錄。WO 89/01968和WO90/10075(全文列為本文參考文獻(xiàn))中已描述過質(zhì)粒pMT-636。用NcoI和XbaI消化質(zhì)粒pMT-636以分離9.3kb片段。還用NcoI和EcoRI消化質(zhì)粒pMT-636以分離1.6kb片段。將得自pMT-636的這兩個片段與EcoRI-XbaI片段連接。將以正確方向令信號序列-Kunitz型抑制劑區(qū)域片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母MT-663(a/aΔtpi/Atpi pep 4-3/pep 4-3)中。根據(jù)其在以葡萄糖為唯一碳源之培養(yǎng)基上生長的情況選擇轉(zhuǎn)化株并在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)之。按實(shí)施例4中所述方法檢測轉(zhuǎn)化株的活性產(chǎn)物。按實(shí)施例5中所述方法純化Kunitz型抑制劑。
B.表達(dá)含有SEQ ID NO2中氨基酸34到152之TFPI-2Kunitz型抑制劑區(qū)域。
使用寡核苷酸引物M-2161和M-2162(SEQ ID NO5和NO11)，按實(shí)施例1中所述的方法，從人基因組DNA擴(kuò)增含有從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列的編碼TFPI-2之Kunitz型抑制劑區(qū)域的DNA構(gòu)建體。凝膠電泳純化所得到的PCR產(chǎn)生的片段，并連接到上述信號序列上。使用含有載體pTZ 19R中之合成信號序列及TFPI-2編碼序列的質(zhì)粒中間體，獲得用于構(gòu)建酵母表達(dá)載體的信號序列-TFPI-2片段。將編碼信號序列-TFPI-2之質(zhì)粒中間體的EcoRI-Xba片段亞克隆到上述酵母表達(dá)載體MT-636中。按上述方法將帶有正確插入段的候選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株MT-663中。
按實(shí)施例4中所述檢測所選擇之轉(zhuǎn)化體表達(dá)產(chǎn)物的活性。按實(shí)施例5中所述純化Kunitz型抑制劑。
C.表達(dá)含有SEQ ID NO2所示氨基酸34到211之TFPI-2的Kunitz型抑制劑區(qū)域。
首先用BglII和HindIII消化質(zhì)粒pJ-2-11/pUC 19。得到編碼三個Kunitz型區(qū)域的528bp BglII-HindIII片段，以構(gòu)建編碼TFPI-2之Kunitz型抑制劑區(qū)域的DNA構(gòu)建體，所說的區(qū)域包含從SEQ ID NO2中氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。通過置換實(shí)施例3B中所述質(zhì)粒中間體內(nèi)的TFPI-2編碼序列，將來自pJ-2-11/pUC19的Kunitz型抑制劑區(qū)域編碼序列連接到合成的信號序列(SEQ IDNO7)上。用BglII和XbaI消化質(zhì)粒中間體以分離含載體片段。將含BglII-XbaI載體的片段與來自PJ-2-11/pUC 19的BglII-HindIII片段和含有翻譯終止密碼子的HindIII-XbaI接頭相連接。鑒定含有以適當(dāng)方向與TFPI-2編碼序列連接之合成信號序列的質(zhì)粒。
將來自編碼信號序列-TFPI-2之質(zhì)粒中間體的EcoRI-XbaI片段亞克隆到上述酵母表達(dá)載體MT-636中。按上述方法將帶有正確插入段的候選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株MT-663中。
按實(shí)施例4中所述方法檢測選擇的轉(zhuǎn)化體的活性產(chǎn)物。按實(shí)施例5中所述方法純化Kunitz型抑制劑。
實(shí)施例4活性檢測法A.對哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的胰蛋白酶抑制活性檢測法。
檢測表達(dá)Kunitz型抑制劑之細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的胰蛋白質(zhì)抑制劑活性。對于各個克隆，均在含有2.4μg/ml胰蛋白酶(Worthington Biochemical，F(xiàn)rreehold，NJ)、100mM NaCl、50mM Tris(pH7.4)的溶液中加條件培養(yǎng)基達(dá)到終體積300μl。將反應(yīng)混合物于23℃保溫30分鐘，然后加入20μl 10mM產(chǎn)色底物S-2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Chromogenix，AB，Molndal，Sweden)至終濃度0.6mM。測405nm處吸光率以檢測殘留的胰蛋白酶活性。
B.對酵母培養(yǎng)物上清液的活性檢測法用80μl檢測緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、100mMNaCl、2mM CaCl2、0.1％(W/V)PEG 20,000)稀釋各3.2μl用過的培養(yǎng)基樣品，檢測來自上述酵母轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物之耗竭培養(yǎng)基中的胰蛋白酶抑制活性。將此稀釋的上清液加到在檢測緩沖液中稀釋的80μl 133nM牛胰蛋白酶(Novo Nordisk A/S)中，將在室溫下將混合物保溫10分鐘。保溫后，向各樣品中加入100μl在檢測緩沖液中稀釋的1.8mM肽酰硝基酰苯胺底物S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Kabi)，并將樣品與底物保溫30分鐘。由無色溶液指示胰蛋白酶抑制活性。由酵母菌株培養(yǎng)上清產(chǎn)生的形成黃色溶液的對照反應(yīng)不表達(dá)任何Kunitz型抑制劑。
實(shí)施例5Kunitz型抑制劑的純化A.從轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化Kunitz型抑制劑按下文詳細(xì)描述的方法相繼使用肝素-瓊脂糖、NONO Q、MONO S和SUPEROSE 12層析柱從條件培養(yǎng)基中純化重組TFPI-2。用1N NaOH將大約5升無血清條件培養(yǎng)基調(diào)到pH 7.5，并通過0.22μm濾膜過濾之。4℃下用緩沖液A(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油)平衡2.6×35cm肝素-Sepharose柱(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)。將經(jīng)過過濾的培養(yǎng)基以3ml/分鐘的流速上樣到經(jīng)過平衡的柱上。上樣之后，用含有NaCl的緩沖液A洗柱。用含有1M NaCl的緩沖液A從柱上洗脫根據(jù)其抑制胰蛋白酶的能力判定的TFPI-2活性(實(shí)施例4A)。4℃下將從肝素-Sepharose柱上得到的洗脫物對25mMTris-HCl(pH 7.5)、10％甘油透析。在含有陰離子交換劑的5×50mm柱上對滯留物進(jìn)行FPLC(Pharmacia Biotech Inc.)，所說的交換劑帶有交聯(lián)到已用25mM Tris-HCl(pH 7.5)、10％甘油中室溫下平衡過的小珠狀親水樹脂如MONO Q(MONO Q HR 5/5；Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)上的季胺基團(tuán)。以1ml/分鐘的流速用線性NaCl梯度(0-0.5M NaCl)從柱上洗脫TFPI-2。合并TFPI-2部分并對25mM檸檬酸鈉(pH 5.0)、10％甘油透析。然后于室溫下在含有陽離子交換劑的5×50mm柱上以0.5ml/分鐘的流速對滯留物進(jìn)行FPLC，其中所說的陽離子交換劑帶有與小珠狀親水樹脂和MONO S(MONO S HR 5/5，Pharmacia Biotech Inc.)偶聯(lián)的帶電荷磺酸基團(tuán)。用從25mM檸檬酸鈉(pH5.0)、10％甘油到25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油、1M NaCl的梯度從MONO S柱上洗脫TFPI-2活性。合并含有TFPI-2活性的各管并經(jīng)超離心濃縮到大約1ml。使?jié)饪s的樣品通過瓊脂糖凝膠過濾基質(zhì)進(jìn)行FPLC，所說的凝膠過濾基質(zhì)具有適于分離×103至3×105MW之蛋白質(zhì)的孔隙度，例如為在室溫下于50mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM NaCl中平衡過的WUPEROSE 12(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)。對從FPLC柱上洗脫的有TFPI-2活性的部分進(jìn)行SDS-PAGE，合并純的部分并貯存于-80℃。
B.從酵母培養(yǎng)物上清液中純化Kunitz型抑制劑基本上按照Norris等人(引文同上，列為本文參考文獻(xiàn))所述的方法從酵母培養(yǎng)物上清中純化Kunitz型抑制劑。使選擇的轉(zhuǎn)化體在10升YEPD中30℃生長約40小時，直到OD600達(dá)到約25。離心培養(yǎng)物分離上清液。
將300-1000ml等分的上清液調(diào)到pH2.3并加樣于裝有已用20mM Bicine，pH8.7(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)平衡過之8ml S-Sepharaose(Pharmacia-LKB biotechNology AS，Alleroed，Denmark)的柱上。用20mM Bicine，pH8.7徹底洗柱后，用30ml含有1M NaCl的20mM Bicine，pH8.7洗脫Kunitz型抑制劑。將洗脫的材料加樣于已用20mM NH4HCO3，pH 7.8平衡過的Sephadex G-25柱(Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；2.5×30cm)上進(jìn)行脫鹽。用20mMNH4HCO3，pH7.8洗脫Kunitz型抑制劑。
在已用20mM Bicine，pH 8.7平衡過的MONO S柱(Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；0.5×5cm)上層析，以進(jìn)一步純化和濃縮Kunitz型抑制劑。以2ml/分鐘的流速用平衡緩沖液洗10分鐘后，用加在平衡緩沖液中的0-0.6M NaCl在12分鐘內(nèi)梯度洗脫Kunitz型抑制劑。合并峰值樣品，在Vydac 214 TP 510柱(Mikro-lab，Aarhus，Denmark；1.0×25cm)上經(jīng)反相HPLC純化Kunitz型抑制劑，其中以4ml/分鐘的流速用從5％A(0.1％三氟乙酸(TFA)，加在水中)到45％B(0.7％TFA，加在乙腈中)的梯度洗脫液在20分鐘進(jìn)行洗脫。凍干純化的產(chǎn)物，并檢測抑制劑活性。
基本上按照Norries等人(引文同上)所述的方法檢測Kunitz抑制活性。簡單地說，在0.25μg/ml豬胰蛋白酶(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd.Denmart)、12.8W/L人纖溶酶(Kabi，Stockholm，Sweden)或0.16nKat/ml人血漿激肽釋放酶(Kabi)(加于100mMNaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.4中)存在下，保溫不同固定濃度的Kunitz型抑制劑。保溫30分鐘后，經(jīng)分割含有溶于檢測緩沖液內(nèi)之0.6mM產(chǎn)色肽酰硝基酰苯胺胰蛋白酶/纖溶酶底物S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Kabi)或S 2302(D-Pro-Phe-Arg-Nan；Kabi)的底物溶液檢測殘留的酶促活性。將樣品保溫30分鐘之后檢測405nm處各樣品的吸光率。根據(jù)405nm吸光率的降低測定纖溶酶或胰蛋白酶活性。根據(jù)測得的結(jié)果計算表觀抑制常數(shù)Ki。
實(shí)施例6重組TFPI-2對人凝血酶、人因子XA和人因子VIIa/組織因子復(fù)合物之酰胺水解活性的影響A.凝血酶酰胺水解活性檢測使用人凝血酶(按照Pedersen，et al.，J.Biol.Chem.26516786-16793，1990；其全文列為本文參考文獻(xiàn))以及各種濃度的重組TFPI-2以比色檢測法確定重組TFPI-2抑制人凝血酶之酰胺水解活性的能力。以微量滴定板規(guī)格建立檢測法。在微量滴定板的小孔中制備200μl反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物含有加在50mMTris-HCl(pH 7.5)、0.1％BSA、5mM CaCl2中的各種不同濃度的重組TFPI-2和20nM人凝血酶。37℃保溫反應(yīng)15分鐘。保溫后，向各小孔內(nèi)加入50μl的10mM產(chǎn)色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-對位硝基酰苯胺，Chromogenix，AB，Molndal，Sweden)。在動力學(xué)微量板讀數(shù)器(Model UVMAX，Molecular Devices)硝定405nm吸光率。重組TFPI-2沒有顯示對人凝血酶的酰胺水解活性(水解底物S-2238)有影響。
B.人因子Xa酰胺水解檢測使用20nM人因子Xa(按Kondo，and Kisiel，Blood 701947-1954，1987所述方法制備的；該文獻(xiàn)列為本文參考文獻(xiàn))代替上述20nM人凝血酶，以上述比色檢測法確定重組TFPI-2抑制因子Xa之酰胺水解活性的能力。按上述方法反應(yīng)并保溫(用人因子Xa代替人凝血酶)。保溫后，向各小孔內(nèi)加入10μl的10mM產(chǎn)色底物S-L222(芐氧基-Ile-Glu-Gly-Arg-對硝基酰苯胺，Chromogenix，AB，Molndal，Sweden)。在動力學(xué)微量板計數(shù)器(model UVMAX，Molecular Devices)中測得405nm吸光率。顯示重組TFPI-2以劑量依賴方式對20nM因子Xa的酰胺水解活性(針對產(chǎn)物底物S-2222的)有微弱的抑制作用。
C.人因子VIIa/組織因子酰胺水解檢測使用70nM由Gordon Vehar(Genentech Inc.，South SanFrancisco，CA)提供的由219氨基酸細(xì)胞外區(qū)域組成的重組的、剪短的人組織因子抑蛋白酶肽(TFI-219(按Paborsky et al.，J.Biol.Chem.26621911-21916，1991；其列為本文參考文獻(xiàn))，和20nM由Peter Wildgoose(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)提供的重組人因子VIIa(按Pedersen，et al.，Biochemistry 289331-9336，1989；其列為本文參考文獻(xiàn))代替上述的20nM人凝血酶，以比色檢測法檢測重組TFPI-2抑制因子VIIa/組織因子復(fù)合物之酰胺解活性的能力。建立該檢測法并用人因子VIIa和TF1-219代替上述人凝血酶按上述方法保溫。保溫后，向各孔內(nèi)加入50μl的10mM產(chǎn)色底物S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-對硝基酰苯胺，Chromogenix，AB)。在動力學(xué)微量板讀數(shù)器(Model UVMAX，Molecular Devices)中測405nm吸光率。顯示重組TFPI-2以劑量依賴方式抑制20nm因子VIIa-組織因子對產(chǎn)色底物S-2288的酰胺水解活性。
實(shí)施例7氨基酸序列分析在配有乙內(nèi)酰苯硫脲分析器的氣體蒸氣序列儀(BeclemanInstruments；Model LF 3000或其他廠家的產(chǎn)品)中進(jìn)行自動氨基酸序列分析。使用配有測序儀的SYSTEM GOLD軟件乙內(nèi)酰苯硫脲峰。對大約100pmole蛋白質(zhì)進(jìn)行序列分析。單一重組TFPI-2制劑的氨基末端氨基酸序列分析顯示出主序列(～70％)Asp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn(SEQID NO12)和次序列(～30％)Ala-Glu-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn(SEQ ID NO13)，提示存在信號肽酶的其他裂解位點(diǎn)，或者可能在其純化期間由外肽酶的作用導(dǎo)致氨基末端降解。
從上面描述可以看出，雖然為舉例說明目的描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況進(jìn)行多種修飾。因此，除待批權(quán)利要求外，這些描述并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
序列表(1)一般信息(i)APPLICANTZymoGenetics， Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattleWAUS98102University of New MexicoScholes Hall 102AlbuquerqueNMUS87131(ii)TITLE OF INVENTIONNOVEL HUMAN KUNITZ-TYPE INHIBITORS ANDMETHODS RELATING THERETO(iii)NUMBER OF SEQUENCES15(iv)CORRESPONDENCE ADDRESS(A)ADDRESSEEZymoGenetics，Inc.
(B)STREET1201 Eastlake Avenue East(C)CITYSeattle(D)STATEWA(E)COUNTRYUSA(F)ZIP98102(v)COMPUTER READABLE FORM(A)MEDIUM TYPEFloppy disk(B)COMPUTERIBM PC compatible(C)OPERATING SYSTEMPC-DOS/MS-DOS(D)SOFTWAREPatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)CURRENT APPLICATION DATA(A)APPLICATION NUMBER(B)FILING DATE(C)CLASSIFICATION(viii)ATTORNEY/AGENT INFORMATION(A)NAMEParker，Gary E(B)REGISTRATION NUMBER31-648(C)REFERENCE/DOCKET NUMBER93-14PC(ix)TELECOMMUNICATION INFORMATION(A)TELEPHONE206-442-6673(B)TELEFAX206-442-6678(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度979堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型CDNA(vi)原始來源(A)生物體Homo sapiens(F)組織類型胎盤(vii)中間來源(B)克隆J-2-11(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位39..746(xi)序列描述SEQ ID NO1GGACGCCTTG CCCAGCGGGC CGCCCGACCC CCTGCACC ATG GAC CCC GCT CGC 53Met Asp Pro Ala Arg1 5CCC CTG GGG CTG TCG ATT CTG CTG CTT TTC CTG ACG GAG GCT GCA CTG 101Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu Thr Glu Ala Ala Leu10 15 20GGC GAT GCT GCT CAG GAG CCA ACA GGA AAT AAC GCG GAG ATC TGT CTC 149Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu25 30 35CTG CCC CTA GAC TAC GGA CCC TGC CGG GCC CTA CTT CTC CGT TAC TAC 197Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr40 45 50TAC GAC AGG TAC ACG CAG AGC TGC CGC CAG TTC CTG TAC GGG GGC TGC 245Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys55 60 65GAG GGC AAC GCC AAC AAT TTC TAC ACC TGG GAG GCT TGC GAC GAT GCT 293Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala70 75 80 85TGC TGG AGG ATA GAA AAA GTT CCC AAA GTT TGC CGG CTG CAA GTG AGT 341Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys Arg Leu Gln Val Ser90 95 100GTG GAC GAC CAG TGT GAG GGG TCC ACA GAA AAG TAT TTC TTT AAT CTA 389Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys Tyr Phe Phe Asn Leu105 110 115AGT TCC ATG ACA TGT GAA AAA TTC TTT TCC GGT GGG TGT CAC CGG AAC 437Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly Gly Cys His Arg Asn120 125 130CGG ATT GAG AAC AGG TTT CCA GAT GAA GCT ACT TGT ATG GGC TTC TGC 485Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr Cys Met Gly Phe Cys135 140 145GCA CCA AAG AAA ATT CCA TCA TTT TGC TAC AGT CCA AAA GAT GAG GGA 533Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser Pro Lys Asp Glu Gly150 155 160 165CTG TGC TCT GCC AAT GTG ACT CGC TAT TAT TTT AAT CCA AGA TAC AGA 581Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe Asn Pro Arg Tyr Arg170 175 180ACC TGT GAT GCT TTC ACC TAT ACT GGC TGT GGA GGG AAT GAC AAT AAC 629Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly Gly Asn Asp Asn Asn185 190 195TTT GTT AGC AGG GAG GAT TGC AAA CGT GCA TGT GCA AAA GCT TTG AAA 677Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys Ala Lys Ala Leu Lys200 205 210AAG AAA AAG AAG ATG CCA AAG CTT CGC TIT GCC AGT AGA ATC CGG AAA 725Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala Ser Arg Ile Arg Lys215 220 225ATT CGG AAG AAG CAA TTT TAAACATTCT TAATATGTCA TCTTGTTTGT 773Ile Arg Lys Lys Gln Phe230 235CTTTATGGCT TATTTGCCTT TATGGTTGTA TCTGAAGAAT AATATGACAG CATGAGGAAA 833CAAATCATTG GTGATTTATT CACCAGTTTT TATTAATACA AGTCACTTTT TCAAAAATTT 893GGATTTTTTT ATATATAACT AGCTGCTATT CAAATGTGAG TCTACCATTT TTAATTTATG 953GTTCAACTGT TTGTGAGACT GAATTC 979(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度235氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Asp Pro Ala Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu1 5 10 15Thr Glu Ala Ala Leu Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn20 25 30Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu35 40 45Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe50 55 60Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu65 70 75 80Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys85 90 95Arg Leu Gln Val Ser Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys100 105 110Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly115 120 125Gly Cys His Arg Asn Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr130 135 140Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser145 150 155 160Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe165 170 175Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly180 185 190Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys195 200 205Ala Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala210 215 220Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe225 230 235(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(vii)中間來源(B)克隆ZC4792(xi)序列描述SEQ ID NO3GTTGTTGCTG TTGCCTCCGC AGCCTCCGTA(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(vii)中間來源(B)克隆ZC6281(xi)序列描述SEQ ID NO4ACAGATCTCC GCGTTATTTC CTGTTGGCTC(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(vii)中間來源(B)克隆M-2161(xi)序列描述SEQ ID NO5GCTGAGAGAT TGGAGAAGAG AGAGATCTGT CTCCTGCC(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(vii)中間來源(B)克隆M-2177(xi)序列描述SEQ ID NO6GAAACCTCTA GACTTATATC CTCCAGCAAG CATC(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度235堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位77..235(xi)序列描述SEQ ID NO7GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile1 5 10GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu15 20 25ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn30 35 40GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA 235Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg45 50(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度53堿基對(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala1 5 10 15Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser20 25 30Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu35 40 45Arg Leu Glu Lys Arg50(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(vii)中間來源(B)克隆NOR-1478
(xi)序列描述SEQ ID NO9GTAAAACGAC GGCCAGT(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(vii)中間來源(B)克隆NOR-2523(xi)序列描述SEQ ID NO10TCTCTTCTCC AATCTCTCAG C(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(vii)中間來源(B)克隆M-2162
(xi)序列描述SEQ ID NO11CTTTTACTCT AGACTTACTT TGGTGCGCAG AAGCC(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度10氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型N末端(xi)序列描述SEQ ID NO12Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn1 5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(v)片段類型N末端(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn1 5(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度165堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位1..165(ix)名稱(A)名稱/鍵-(B)定位1..3(D)其他信息/標(biāo)記＝密碼子-1/注＝“其中核苷酸三聯(lián)體1-3編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名稱/鍵(B)定位4..6(D)其他信息/標(biāo)記＝密碼子-2/注＝“其中核苷酸三聯(lián)體4-6編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名稱/鍵-(B)定位160-162(D)其他信息/標(biāo)記＝密碼子-54/注＝“其中核苷酸三聯(lián)體160..162編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名稱/鍵-(B)定位163..165(D)其他信息/標(biāo)記＝密碼子-55/注＝“其中核苷酸三聯(lián)體112-114編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO14NNNNNNTGTC TCCTGCCCCT AGACTACGGA CCCTGCCGGG CCCTACTTCT CCGTTACTAC 60TACGACAGGT ACACGCAGAG CTGCCGCCAG TTCCTGTACG GGGGCTGCGA GGGCAACGCC 120AACAATTTCT ACACCTGGGA GGCTTGCGAC GATGCTTGCN NNNNN 165(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度55氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(v)片段類型內(nèi)部(xi)特征(A)名稱/鍵區(qū)域(B)定位1..2(D)其他信息/標(biāo)記＝aa1-2/注＝“其中從位置1至2的各氨基酸分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名稱/鍵區(qū)域(B)定位54..55(D)其他信息/標(biāo)記＝aa54-55/注＝“其中從位置54到55的各氨基酸分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO15Xaa Xaa Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu1 5 10 15Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu20 25 30Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala35 40 45Cys Asp Asp Ala Cys Xaa Xaa50 5權(quán)利要求
1.包含編碼人Kunitz型抑制劑之DNA片段的分離的DNA分子，其中所說Kunitz型抑制劑含有SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分別是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中所說的DNA片段含有SEQ ID NO2中從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯丙氨酸的氨基酸序列，SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列、SEQ IDNO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中從氨基酸編號34至谷氨酸到氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中所說的DNA片段含有SEQ ID NO14中從1到165的核苷酸序列，其中各核苷酸三聯(lián)體1至3、4至6、160至162和163至165分別編碼除半胱氨酸以外的任何氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的DNA分子，其中所說的DNA片段含有SEQ ID NO1中從核苷酸39到核苷酸743的核苷酸序列、SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
5.包含編碼人Kunitz型抑制劑之第一DNA片段的DNA構(gòu)建體，所說的第一DNA片段可操作地連接到為表達(dá)該DNA片段所需的附加DNA片段上，其中所說的Kunitz型抑制劑包括SEQ IDNO15的氨基酸序列，其中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建體，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO2中從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯丙氨酸的氨基酸序列、從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮酸的氨基酸序列、從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列或氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建體，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO14中從1到165的核苷酸序列，其中各核苷酸三聯(lián)體1至3、4至6、160至162和163至165分別編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建體，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO1中從核苷酸39到核苷酸743的核苷酸序列，SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中的核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
9.含有包括編碼人Kunitz型抑制劑之第一DNA片段的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所說的第一DNA片段可操作地連接到為表達(dá)該片段所需的附加DNA片段上，其中所說的Kunitz型抑制劑包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO2中從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯丙氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列、SEQ IDNO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO14中從核苷酸1到核苷酸165的核苷酸序列，其中各核苷酸三聯(lián)體1至3、4至6、160至162和163-165分別編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO1中所示從核苷酸39至核苷酸743的核苷酸序列、SEQ ID NO1中所示從核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中所示從核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中所示從核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
13.生產(chǎn)人Kunitz型抑制劑的方法，其包括以下步驟培養(yǎng)包含DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所說的DNA構(gòu)建體包括與表達(dá)第一DNA片段所需附加DNA片段可操作地連接的編碼人Kunitz型抑制劑的第一DNA片段，其中所說的Kunitz型抑制劑包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸；以及分離所說的Kunitz型抑制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的生產(chǎn)人Kunitz型抑制劑的方法，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯為氨酸的氨基酸序列、SEQ IDNO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的生產(chǎn)人Kunitz型抑制劑的方法，其中所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO14中所示從核苷酸1到核苷酸165的核苷酸序列，其中各核苷酸三聯(lián)體1-3、4-6、160-162和163-165分別編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的生產(chǎn)人Kunitz型抑制劑的方法，其中的所說的第一DNA片段包括SEQ ID NO1中從核苷酸39到核苷酸743的核苷酸序列、SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中從核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
17.具有氨基末端和羧基末端的分離的人Kunitz型抑制劑，其包括SEQ ID NO15所示的氨基酸序列，其中各Xaa分別編碼除半胱氨酸外的任何氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的分離的人Kunitz型抑制劑，其中所說的抑制劑包括SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯為氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的分離的人Kunitz型抑制劑，其中所說的抑制劑進(jìn)一步在其氨基末端包括SEQ ID NO12或SEQ IDNO13的氨基酸序列。
20.含有根據(jù)權(quán)利要求17之人Kunitz型抑制劑并加有藥學(xué)上可接受之載體的藥物組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所說的Kunitz型抑制劑包括SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯為氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之為丙氨酸的氨基酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所說的人Kunitz型抑制劑進(jìn)一步在其氨基末端包括SEQ ID NO12或SEQ IDNO13的氨基酸序列。
23.與人Kunitz型抑制劑特異結(jié)合的分離的抗體，所說的抑制劑包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的分離的抗體，其中所說的抗體是單克隆抗體。
25.產(chǎn)生與人Kunitz型抑制劑特異結(jié)合之單克隆抗體的雜交瘤，所說的抑制劑包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分別是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
26.至少有12個核苷酸的探針，所說的探針能夠與編碼人Kunitz型抑制劑的核酸雜交，所說的核酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列，SEQ ID NO1的核苷酸變體、或編碼與SEQ IDNO1或其變體互補(bǔ)之DNA序列的DNA片段。
27.包含質(zhì)粒J-2-11/PUC19的大腸桿菌宿主細(xì)胞(ATCC登記號69425)。
28.抑制哺乳動物體內(nèi)血液凝固的方法，其包括以足以抑制血液凝固的量投用根據(jù)權(quán)利要求17的人Kunitz型抑制劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的抑制哺乳動物體內(nèi)血液凝固的方法，其中所說的Kunitz型抑制劑包括SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號1之蛋氨酸到氨基酸編號235之苯為氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號89之異亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號152之賴酸的氨基酸序列或SEQ IDNO2中所示從氨基酸編號34之谷氨酸到氨基酸編號211之丙氨酸的氨基酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的抑制哺乳動物體內(nèi)血液凝固的方法，其中所說的Kunitz型抑制劑進(jìn)一步在其氨基末端包括SEQ IDNO12或SEQ ID NO13的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供分離的DNA分子，該分子包括編碼新的人Kunita型抑制劑的DNA片段。還提供包括第一DNA片段的DNA構(gòu)建體，以及含有這些DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞和由所說的宿主細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其中所說的編碼新的人Kunitz型抑制劑的第一DNA片段可操作地連接到表達(dá)該第一DNA片段所需的附加DNA片段上。
文檔編號A61K38/55GK1139955SQ94194406
公開日1997年1月8日 申請日期1994年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月5日
發(fā)明者C·A·斯普里爾, W·凱瑟爾, D·C·佛斯特 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司, 新墨西哥大學(xué)