專利名稱：一種蛋雞脾臟轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是轉(zhuǎn)移因子制備工藝的新技術(shù)。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)移因子是由具有生物活性的多肽及核苷酸組成的混合物，它能夠?qū)⒐w細(xì)胞所具有的細(xì)胞免疫功能轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞，非特異性地增強(qiáng)一般細(xì)胞免疫，提高受體的免疫功能，而且安全無毒、無藥物殘留，是一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑。主要用于對病毒性感染及自身免疫性疾病的治療，配合疫苗使用可顯著提高抗體滴度，增強(qiáng)免疫效果?，F(xiàn)有技術(shù)中轉(zhuǎn)移因子的一般提取工藝流程如下I對新鮮組織進(jìn)行預(yù)處理，勻漿機(jī)勻漿后_20°C -20°C，反復(fù)凍融3-8次。2高速冷凍離心機(jī)離心取上清。3透析或超濾，截留分子量5000-10000。4制備不同劑型轉(zhuǎn)移因子。上述制備轉(zhuǎn)移因子的工藝流程普遍存在細(xì)胞破碎不完全、提取率低，原材料浪費(fèi)多、成本高等缺陷，并且轉(zhuǎn)移因子在現(xiàn)有的提純工藝中易失活。另外，受限于提取工藝中的具體步驟和操作參數(shù)等，目前難以在產(chǎn)業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量合格的蛋雞脾臟轉(zhuǎn)移因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了以往轉(zhuǎn)移因子制備工藝中因凍融方法導(dǎo)致的成本高、生物活性受影響，或細(xì)胞破碎不完全，有效成分產(chǎn)出率低，等諸多不足之處。本發(fā)明的新制備工藝具有高活性、高得率、低成本等諸多優(yōu)點(diǎn)。適用于各種劑型、規(guī)格的制備需要。本發(fā)明提出的制備轉(zhuǎn)移因子的主要工藝流程如下I將新鮮或解凍后的健康蛋雞脾臟小心去除脂肪及筋膜，用生理鹽水洗凈、浙干、剪碎、稱重備用。 2取處理好的脾臟按重量加入等量生理鹽水，膠體磨連續(xù)研磨2-3次，每次3分鐘I320°C條件下用 lmol/L 的 HCl 調(diào) PH 至 3. 5。4將PH為3. 5的勻漿液置_20°C完全冰凍后，用25°C左右自來水完全融化，反復(fù)凍融3次。5 6000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心20分鐘，取上清液備用。取殘?jiān)碓俅翁砑优c起始蛋雞脾臟等量的生理鹽水，膠體磨研磨3分鐘，再次調(diào)PH至3. 5，反復(fù)凍融3次后離心取上清，合并上清液。6按所得上清液的量加萬分之5的甲醛滅活病毒。7將加有甲醛的上清液用截流值為5000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，所得濾液即為分子量小于5000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子原液。8原液在20°C條件下用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至7. O,按照所需濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按O. 6g/L的量添加山梨酸。
9用孔徑為O. 22 μ m的濾膜加壓過濾除菌，所得濾液灌裝即得。本制備工藝發(fā)明要點(diǎn)如下I采用膠體磨進(jìn)行研磨，取得了優(yōu)于勻漿機(jī)的勻漿效果，從而保證了轉(zhuǎn)移因子高釋放率，提高了轉(zhuǎn)移因子的提取率。2在整個(gè)提取工藝中使用HCl調(diào)整體系的PH至3. 5其優(yōu)點(diǎn)如下首先，pH3. 5的酸性環(huán)境有利于細(xì)胞的破膜作用，使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)充分釋放；其次，PH3. 5的酸性環(huán)境能顯著抑制細(xì)菌、病毒的生長，起到一定的殺菌抑菌效果；再次，PH3. 5的酸性條件使得大部分雜蛋白發(fā)生變性，而使分子較小的轉(zhuǎn)移因子處于可溶狀態(tài)，使得在離心除去細(xì)胞碎片的同時(shí)也除去了大量的雜蛋白，即保證了轉(zhuǎn)移因子的回收率，又簡化了其后的提取步驟；最后，在ph3. 5的條件下進(jìn)行凍融利于轉(zhuǎn)移因子活性的保持，減少了提取工藝中的轉(zhuǎn)移因子失活。3 6000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心20分鐘，取上清液備用。取殘?jiān)砑优c起始蛋雞脾臟等量的生理鹽水，膠體磨研磨3分鐘，再次調(diào)PH至3. 5，反復(fù)凍融3次后離心取上清，合并上清液。此步驟的優(yōu)點(diǎn)如下優(yōu)先分離出第一步凍融步驟中已經(jīng)釋放出來的轉(zhuǎn)移因子，然后進(jìn)行下一步凍融，避免了多次反復(fù)凍融對已經(jīng)釋放出來的轉(zhuǎn)移因子活性的破壞；收集殘?jiān)俅窝心ァ⒄{(diào)PH、反復(fù)凍融，使得沒有釋放完全的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)得以充分釋放，增加轉(zhuǎn)移因子的得率，節(jié)約成本。4添加加萬分之5的甲醛滅活病毒。添加加萬分之5的甲醛能夠有效地起到殺滅勻漿上清液中的病毒和其它病原微生物，并且在對勻漿上清液進(jìn)行超濾、稀釋的過程中降低了甲醛的濃度。選擇對勻漿液添加萬分之5的甲醛即保證了滅活病毒等病原微生物的效果又減少了終產(chǎn)品中甲醛的殘留，降低了副作用。本發(fā)明以目前通常提取方法和某品牌市售轉(zhuǎn)移因子為對照進(jìn)行轉(zhuǎn)移因子臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明，本發(fā)明的方法制備得到的轉(zhuǎn)移因子在多肽和核酸含量、活性、增強(qiáng)免疫方面及對NDV抗體滴度方面的效果均完全優(yōu)于通常提取方法和目前市售產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1轉(zhuǎn)移因子的制備(I)本申請的方法I將新鮮或解凍后的健康蛋雞脾臟小心去除脂肪及筋膜，用生理鹽水洗凈、浙干、剪碎、稱重備用。2取處理好的脾臟按重量加入等量生理鹽水，膠體磨連續(xù)研磨2-3次，每次3分鐘。3 20°C條件下用 lmol/L 的 HCl 調(diào) PH 至 3. 5。4將PH為3. 5的勻漿液置_20°C完全冰凍后，用25°C左右自來水完全融化，反復(fù)凍融3次。5 6000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心20分鐘，取上清液備用。取殘?jiān)砑优c起始蛋雞脾臟等量的生理鹽水，膠體磨研磨3分鐘，再次調(diào)PH至3. 5，反復(fù)凍融3次后離心取上清，合并上清液。6按所得上清液的量加萬分之5的甲醛滅活病毒。7將加有甲醛的上清液用截流值為5000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，所得濾液即為分子量小于5000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子原液。
8原液在20°C條件下用lmol/L氫氧化鈉調(diào)PH至7. O,按照所需濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按O. 6g/L的量添加山梨酸。9用孔徑為O. 22 μ m的濾膜加壓過濾除菌，所得濾液灌裝即得。(2)對比提取方法(即通常的提取方法):以同一批雞脾臟為原料，按照參考文獻(xiàn)《雞脾轉(zhuǎn)移因子的制備及對雛雞免疫應(yīng)答的作用研究》(喬宏興等，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012. 02，第I期，13-16)中記載的常規(guī)提取方法提取雞脾中的轉(zhuǎn)移因子。實(shí)施例2對本發(fā)明所述工藝制備的轉(zhuǎn)移因子的檢測性狀本品主要成分為低分子活性多肽和核糖，冷凍狀態(tài)下為白色或淡黃色固體，解凍后為無色或微黃色澄明液體，可有微量多肽凝聚物沉淀。pH值按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行測定，在20°C ±2°C時(shí)，pH值應(yīng)為 6. O 7. 5。蛋白定性取本品適量2ml，加入20%磺基水楊酸試劑2ml，搖勻，溶液不得出現(xiàn)沉淀或混池反應(yīng)。無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。支原體檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無支原體生長。外源病毒檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無外源病毒污染。禽白血病病毒的檢測按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無外源病毒污染。安全檢驗(yàn)對I日齡SPF雞分別進(jìn)行單劑量給藥(O. 5ml/只)、單劑量重復(fù)給藥(O. 5ml/只，每日一次，連用7日)、超劑量給藥(2. 5ml/只)的安全性試驗(yàn)，連續(xù)觀察14天，SPF雞應(yīng)全部健康存活。多肽按福林酚法進(jìn)行，每Iml應(yīng)不少于Img。核糖按核糖含量測定法進(jìn)行，每Iml應(yīng)不少于30 μ g。游離氨基酸采用高效液相色譜法，按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄進(jìn)行測定。每Iml中游離氨基酸的量不得少于1. 3mg。活力測定取本品適量，按T細(xì)胞活性測定法一一脫E受體法測定，供試品管的E玫瑰花結(jié)百分率與對照管的E玫瑰花結(jié)百分率之差應(yīng)不低于10. 0%。甲醛殘留量按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄進(jìn)行測定，不應(yīng)超過O. 2%甲醛溶液量。實(shí)施例3轉(zhuǎn)移因子的臨床應(yīng)用試驗(yàn)一不同提取方法產(chǎn)品含量比較

本專利方法提取的轉(zhuǎn)移因子與對比提取方法提取的轉(zhuǎn)移因子主要指標(biāo)比較
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)蛋雞脾臟轉(zhuǎn)移因子的方法，其特征在于生產(chǎn)方法如下所述 (1)取處理好的蛋雞脾臟按重量加入等量生理鹽水，用膠體磨連續(xù)2-3次研磨，每次3分鐘，得勻漿液； (2)20°C條件下用lmol/L的HCl將上述勻漿液調(diào)pH至3. 5 ; (3)將上述pH為3.5的勻漿液置_20°C完全冰凍后，用25°C左右的自來水完全融化，反復(fù)凍融3次； (4)將步驟(3)得到的勻漿液在6000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心20分鐘，取上清液備用，取殘?jiān)砑优c起始蛋雞脾臟等量的生理鹽水，膠體磨研磨3分鐘，再次調(diào)pH至3. 5，反復(fù)凍融3次后離心取上清，合并上清液； (5)按所得上清液的量加萬分之五的甲醛滅活病毒； (6)將上述加有甲醛的上清液用截流值為5000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，所得濾液即為分子量小于5000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子原液； (7)將上述轉(zhuǎn)移因子原液在20°C條件下用Imol/LNaOH調(diào)pH至7，進(jìn)行濃度測定后，按照所需濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按O. 6g/L的量添加山梨酸； (8)用孔徑為O.22 μ m的濾膜加壓過濾除菌，灌裝，得到轉(zhuǎn)移因子成品。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法生產(chǎn)的蛋雞脾臟轉(zhuǎn)移因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是轉(zhuǎn)移因子制備工藝的新技術(shù)。處理好的蛋雞脾臟加入等量生理鹽水，用膠體磨均漿后，20℃條件下調(diào)PH值至3.5。-20℃-25℃反復(fù)凍融3次。離心取上清液備用。取殘?jiān)俅窝心?、調(diào)PH、反復(fù)凍融3次、離心取上清，合并上清液。經(jīng)病毒滅活、超濾、調(diào)PH值至7.0、過濾除菌等過程即得蛋雞脾臟轉(zhuǎn)移因子口服溶液。轉(zhuǎn)移因子是由具有生物活性的多肽及核苷酸組成的混合物，它能夠?qū)⒐w細(xì)胞所具有的細(xì)胞免疫功能轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞，非特異性地增強(qiáng)一般細(xì)胞免疫，提高受體的免疫功能，而且安全無毒，是一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑。主要用于對病毒性感染及自身免疫性疾病的治療，配合疫苗使用可顯著增強(qiáng)免疫效果。
文檔編號A61P37/04GK103027927SQ201210536559
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者趙風(fēng)立, 尹建華, 呂振華, 侯娟娟 申請人:黑龍江省匯豐動物保健品有限公司, 青島科亞華動物藥業(yè)有限公司, 黑龍江省百洲生物工程有限公司