專利名稱：同時用于ct與mri的雙顯影劑及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種納米級多功能多平臺顯影劑及其制作方法，尤指一種可以同時用于陰極射線計算機斷層攝影(CT)與核磁共振攝影(MRI)的雙顯影劑及其制作方法。
背景技術(shù)：
近年來，各種圖像檢查已是醫(yī)療上常用的疾病檢測方法之一。其中，顯影劑為一種在進行圖像檢查時，可以提升各種不同組織之間的對比度，使圖像變得更清楚的藥劑。目前醫(yī)療上常用的圖像檢查包括有計算機斷層攝影(Computed tomography，CT)、及核磁共振攝影(Magnetic resonance imaging, MRI)等。其中，CT利用X射線穿透人體取得圖像后，再由計算機重組成三度圖像空間，以觀察身體內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)。由于CT具有高分辨率，且可以完整呈現(xiàn)病灶，故為一種醫(yī)療上常用的圖像檢查技術(shù)。一般而言，CT所使用的顯影劑為碘顯影劑，但碘顯影劑為一種具有高滲透度的離子性顯影劑，容易對腎臟有所危害，且具有顯像時間短的缺點。因此，為改善碘顯影劑的缺點，目前已發(fā)展如聚合物包覆的硫化鉍(polymer-coated bismuth sulfide (Bi2S!3))、及聚乙二醇(PEG)包覆的金納米粒子等納米粒子型顯影劑。另一方面，MRI則是利用磁場原理，改變體內(nèi)氫原子的旋轉(zhuǎn)方向排列，經(jīng)計算機處理后，以呈現(xiàn)人體組織的切片圖像。由于MRI是為一種非游離輻射技術(shù)，且對于水或其它生物分子具有高敏感度，已逐漸取代其它傳統(tǒng)檢查系統(tǒng)，而廣泛用于各種疾病檢驗及組織觀察上。對大部分MRI檢查而言，均不需施打顯影劑，但若需更精密檢查時，仍需施打顯影劑。目前MRI常用的顯影劑包括釓(gadolinium，Gd3+)基T1顯影劑、及超順磁氧化鐵 (superparamagnetic iron oxide)納米顆粒型 T2 顯影齊[J。即便CT及MRI檢驗已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療用途上，但若患者需同時進行CT及MRI檢驗時，需等待其中之一顯影劑排除后，才可以進行另一檢驗，反而造成檢查時間加長。目前已發(fā)展出一種可以用于CT及MRI的雙顯影劑，其為一種金納米與釓離子螯合的復(fù)合納米粒子。然而，這種復(fù)合納米粒子工藝相當復(fù)雜，且顯影效果仍不如預(yù)期。因此，目前極需發(fā)展出一種制備方法較簡單且具有良好顯影效果的CT及MRI的雙顯影劑，以在臨床上縮短檢查時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法，使能以簡單工藝制作出可以同時應(yīng)用于CT及MRI攝影的雙顯影劑。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于CT及MRI的雙顯影劑，使能解決傳統(tǒng)MRI/CT 顯影劑所產(chǎn)生的腎毒性及其它禁忌癥。為達成上述目的，本發(fā)明的用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法包括下列步驟
(A)提供一混合溶液，其包含一鉬化合物、一鐵化合物、一多元醇、一界面活性劑、及一溶劑；
(B)加熱該混合溶液以使該鉬化合物與該鐵化合物進行反應(yīng)，以得一鐵鉬納米粒子；(C)冷CN 102526769 A卻該混合溶液，并將該鐵鉬納米粒子由該混合溶液中分離出；以及(D)將該鐵鉬納米粒子與一表面改質(zhì)分子混合，以得到一表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑。此外，本發(fā)明還提供一種使用上述方法制備的CT及MRI的雙顯影劑，包括一鐵鉬納米粒子；以及一表面改質(zhì)分子，連結(jié)于該鐵鉬納米粒子的表面，使該鐵鉬納米粒子的表面修飾有一胺基、一羧基、或一生物素(biotin)；其中，該鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)，且該鐵鉬納米粒子如下式(I) 所示FexPt100_x (I)其中，χ為30 60，而巰基也可以稱之為硫醇基、或氫硫基。本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法，通過一種簡單工藝制作出具有高度生物兼容性的納米粒子，其中，表面改質(zhì)分子化學(xué)修飾于鐵鉬納米粒子表面，并露出表面修飾官能基以與后續(xù)生物分子連接。此外，本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑，可以提升CT及 MRI攝影的辨識程度，并同時作為CT及MRI的雙顯影劑。相比于以往所使用的顯影劑，本發(fā)明所提供的顯影劑不會產(chǎn)生腎毒性及其它禁忌癥。在本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法中，鉬化合物可以為至少一選自由 Pt(acac)2、PtCl2, PtCl4, H2PtCl4, H2PtCl6, K2PtCl4、及 K2PtCl6 所組成的群組。此外， 鐵化合物可以為至少一選自由I^e(CO) 5、Fe (acac)2, ！^ (acac) 3、及i^-oleate所組成的群組。再者，多元醇為C8_2(l的醇類。優(yōu)選為，多元醇為至少一選自由1，2_十六烷二醇(1， 2-hexa-decanediol) >1,2-十二；^二酉享(1, 2-Dodecanediol)、及聚乙二酉享(polyethylene glycol)所組成的群組。此外，表面改質(zhì)分子可以為一胺基表面改質(zhì)分子，如半胱胺(cysteinamine)、胱胺(cystamine)、或巰基烷基胺(mercaptoalkylamine)。其中，胺基表面改質(zhì)分子優(yōu)選是具有巰基(-SH)及胺基(-NH2),且胺基表面改質(zhì)分子通過巰基連結(jié)于鐵鉬納米粒子的表面，使鐵鉬納米粒子的表面修飾有胺基。除了可以于鐵鉬納米粒子表面以胺基表面改質(zhì)分子修飾外，還可以于鐵鉬納米粒子表面以具有羧基的分子、生物素、亞硝基三乙酸酯 (nitrilotriacetate)等可以與生物分子交聯(lián)的官能基進行修飾。在本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法中，接口活性劑可以為至少一選自由油酸(oleic acid)、及油胺(oleyl amine)所組成的群組。優(yōu)選為，接口活性劑包括油酸、及油胺。優(yōu)選為，接口活性劑中油酸及油胺的體積比介于1 1至3 1之間。通過調(diào)整接口活性劑的成分比例，可以精確調(diào)整鐵鉬納米粒子尺寸與形狀。其中，鐵鉬納米粒子的粒徑可以為1 lOOnm，優(yōu)選為1 20nm。通過調(diào)整鐵鉬納米粒子尺寸與形狀，可以調(diào)控鐵鉬納米粒子活體生物分布、藥物動力學(xué)、循環(huán)代謝及排除時間。當油酸及油胺的體積比為1 1時，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向為(111)面 (facet)，而可以形成八足狀結(jié)構(gòu)的納米粒子。當油酸及油胺的體積比為3 1時，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向為(111)及(100)面，而可以形成立方八面體結(jié)構(gòu)的納米粒子。若反應(yīng)時間較短時，則所形成的鐵鉬納米粒子形狀則接近球狀。此外，在本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑的制作方法中，在步驟(D)后可以還包括一步驟(E)將表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑與一標靶分子混合，以得到一具標靶能力的分子造影雙顯影劑。因此，本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑可以還包括一標靶分子，其與表面改質(zhì)分子連接。其中，標靶分子可以為一抗體、一蛋白質(zhì)、一核酸、一納米體、或一分子模板等。優(yōu)選為，標靶分子為一抗體，其可以依照欲檢測的標的進行選擇，如抗Her2抗體， 其中Her2為人類表皮生長因子受體。例如，當鐵鉬納米粒子連接有一胺基表面改質(zhì)分子， 即鐵鉬納米粒子表面修飾有胺基(-NH2),則可以選擇具有一羧基(-C00H)的標靶分子，通過羧基與胺基的鍵結(jié)，以將標靶分子與表面改質(zhì)分子連結(jié)，而形成一具標靶能力的分子造影雙顯影劑。因此，本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法，可以化學(xué)修飾方法，在鐵鉬納米粒子表面做一適合的生物修飾，由此可以精準標定生物體內(nèi)腫瘤位置，而作為一具標靶能力的分子造影雙顯影劑。


圖1為本發(fā)明實施例4的用于CT及MRI雙顯影劑的示意圖。圖2為本發(fā)明實施例1 3的鐵鉬納米粒子的磁滯回線(hysteresis loop)圖。圖3為本發(fā)明實施例1 3的鐵鉬納米粒子MTT試驗結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明實施例1 3的鐵鉬納米粒子的血球溶解性試驗結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明實施例1 3的鐵鉬納米粒子于器官中的分布結(jié)果圖。圖6為本發(fā)明實施例1 3的鐵鉬納米粒子體外MRI試驗結(jié)果圖。圖7為本發(fā)明實施例1 3的鐵鉬納米粒子體外CT試驗結(jié)果圖。圖8為本發(fā)明實施例4及6的用于CT及MRI的雙顯影劑體外MRI試驗結(jié)果圖。圖9為本發(fā)明實施例4及6的用于CT及MRI的雙顯影劑體外CT試驗結(jié)果圖。主要元件符號說明100 鐵鉬納米粒子101 胺基表面改質(zhì)分子102 抗體
具體實施例方式以下是通過特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以由本說明書所公開的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點與功效。本發(fā)明也可以通過其它不同的具體實施例加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在不悖離本發(fā)明的精神下進行各種修飾與變更。在本發(fā)明中，用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法所采用的材料主要如下 二乙酰丙酮鉬(Platinum acetylacetonate, Pt(acac)2, ACR0S,97% )、五羰基鐵(iron pentacarbonyl，F(xiàn)e (CO) 5，Aldrich，99. 99 % )、1，2_ 十六烷二醇(1，2-hexadecanediol， Aldrich,90% )、二辛醚(dioctyl ether, ACR0S,90 % )、油胺(oleyl amine, Aldirch, 70%)、油酸(oleic acid，Aldrich，90% )、及半胱胺(cysteamine, Sigma,95% ) 實施例1-制備3 4nm的鐵鉬納米粒子在氮氣氛下將Pt(acac)2(97mg)、l，2-十六烷二醇(195mg)、及二辛醚(IOmL)混合，并加熱至100°c，10分鐘。而后，在100°C下，在此混合溶液中加入!^e (CO) 5 (66 μ L)、油胺 (80 μ L)、及油酸(80 μ L)，并將此反應(yīng)混合物加熱至297°C。反應(yīng)30分鐘后，將產(chǎn)物冷卻至室溫，再添加乙醇以沉淀產(chǎn)物，而后以離心方式將產(chǎn)物分離，則得到本實施例的鐵鉬納米粒子。在本實施例中，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向為(111)。在此，使用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy，TEM)及能量散射X射線光譜儀(Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX)測量鐵鉬納米粒子的特性。在此，TEM及EDX分析是使用JEOL Philips/FEI Tecnai 20 G2 S-Twin透射電子顯微鏡。此外，實施例2及3也使用相同方式測量，故往后將不再贅述。首先，先將少量鐵鉬納米粒子分散于甲苯(toluene)中，而后將溶液滴至銅網(wǎng)支撐的非晶碳膜上。接著，以50k、100k、200k的倍率測量，并以X射線衍射儀(Bruker D8 Advance diffractometer)收集X射線衍射數(shù)據(jù)。此外，鐵鉬納米粒子粉末也放置在非晶硅硅片上，并以Cu Ka射線(λ =1.54178 Α)進行測量。再者，磁性分析則是使用超導(dǎo)量子干涉石茲量儀(Superconducting quantum interference device (SQUID) magnetometer) (MPMS, Quantum Design)，且在 300K 下紀錄-10000 Oe 至 10000 Oe 的磁矩。經(jīng)TEM圖像測量后，本實施例的鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且粒徑為 3. 58士0. 34nm。此外，經(jīng)EDX測量后，鐵鉬納米粒子組成為 ^58Ρ 42。再者，經(jīng)磁性分析后， 鐵鉬納米粒子在300Κ下的磁矩(magnetization, Ms)為1. 7emu/g Fe，如圖2所示。實施例2-制備6 7nm的鐵鉬納米粒子在氮氣氛下將Pt (acac) 2 (97mg)、芐醚(benzyl ether) (4mL)、Fe (CO) 5 (66 μ L)、 油胺(100 μ L)、及油酸(100 μ L)混合。而后，將反應(yīng)溶液以15°c /分的加熱速率加熱至 240°C。反應(yīng)30分鐘后，將產(chǎn)物冷卻至室溫，再以離心方式將產(chǎn)物分離，則得到本實施例的鐵鉬納米粒子。在本實施例中，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向為(111)。經(jīng)TEM圖像測量后，本實施例的鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且粒徑為 6. 12 士 0.63nm。此外，經(jīng)EDX測量后，本實施例的鐵鉬納米粒子組成為i^e51Pt49。再者，經(jīng)磁性分析后，鐵鉬納米粒子在300K下的Ms為3. 2emu/gFe,如圖2所示。實施例3-制備12 13nm的鐵鉬納米粒子在氮氣氛下將Pt(acac)2(195mg)、l，2-十六烷二醇(1.05g)、二辛醚(4mL)、 ！^ (CO)5(66 μ L)、油胺(4mL)、及油酸(4mL)混合。而后，將反應(yīng)溶液以15°C /分的加熱速率加熱至240°C，并將反應(yīng)溶液維持在240°C下60分鐘。接著，將反應(yīng)溶液冷卻至室溫，再添加乙醇以沉淀產(chǎn)物，而后以離心方式將產(chǎn)物分離，則得到本實施例的鐵鉬納米粒子。在本實施例中，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向為(100)。經(jīng)TEM圖像測量后，本實施例的鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且粒徑為 12. 80士 1. 76nm。此外，經(jīng)EDX測量后，本實施例的鐵鉬納米粒子組成為 ^33Ρ 67。再者，經(jīng)磁性分析后，鐵鉬納米粒子在300Κ下的Ms為12. !Bemu/gFe，如圖2所示。實施例4-制備3 4nm的用于CT及MRI的雙顯影劑將實施例1的干燥鐵鉬納米粒子(IOOmg)利用超聲波震蕩分散于乙醇中。而后， 在室溫下，將半胱胺( Ig)添加并溶解于鐵鉬納米粒子分散液中，并在40 50°C下隔夜超聲波震蕩反應(yīng)溶液。接著，利用乙醇清洗產(chǎn)物以移除吸附于鐵鉬納米粒子的半胱胺。最后，將所得的胺基修飾的鐵鉬納米粒子收集并儲存于氮氣下。將所得的胺基修飾的鐵鉬納米粒子與鹽酸乙基-3-[3_ 二甲基胺基丙基]碳二亞胺(Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride, EDC)、及老鼠抗 Her2抗體混合，并置于4°C下攪拌1小時。而后，以13000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘以收集沉淀物，并以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗兩次，可以得本實施例的雙顯影劑。經(jīng)由上述工藝，本實施例的用于CT及MRI的雙顯影劑如圖1所示，包括一鐵鉬納米粒子100 ；—胺基表面改質(zhì)分子101，具有一巰基(-SH)、及一胺基(-NH2)，其中胺基表面改質(zhì)分子101通過巰基連結(jié)于鐵鉬納米粒子100的表面；以及一抗體102，具有一羧基 (-C00H)，其中通過羧基與胺基的鍵結(jié)，以將抗體102與胺基表面改質(zhì)分子101連結(jié)。其中， 鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且鐵鉬納米粒子組成是I^e58Pt4215實施例5-制備6 7nm的用于CT及MRI的雙顯影劑本實施例的用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法與實施例4相同，除了使用實施例2的鐵鉬納米粒子取代實施例1的鐵鉬納米粒子。實施例6-制備12 13nm的用于CT及MRI的雙顯影劑本實施例的用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法與實施例4相同，除了使用實施例3的鐵鉬納米粒子取代實施例1的鐵鉬納米粒子。評估測試[細胞株]人類口腔表皮癌細胞株(Human oral epidermoid carcinoma cell line，0ECMl) 以含有10% (v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。腎臟細胞(Vero cell)則以含有10 % (ν/ν)胎牛血清、2mM的L-麩胺酰胺(L-glutamine)、及50mg/mL的慶大霉素(gentamicin)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。人類膀胱癌細胞株(MBT-2)則取自由C3H/HeN老鼠的致癌物質(zhì)誘發(fā)的膀胱癌細胞，其中C3H/HeN老鼠是經(jīng)美國標準生物品收藏中(ATCC， Manassas, VA)取得。在此，細胞以含有10 %胎牛血清(FBQ、25mM的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid, HEPES)、2mM 的L-麩胺酰胺、及ImM的丙酮酸鈉(sodium pyruvate)，并在37°C的培養(yǎng)箱中，以含有5% CO2的空氣培養(yǎng)細胞株，且每兩天更換培養(yǎng)基。[體外細胞毒理試驗(MTTassay)]在96孔盤中種殖切IO3腎細胞/孔，并以含有10% FBS、2mM L-麩胺酰胺、 及50mg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。M小時后，加入各種粒徑(實施例1 3)且連續(xù)10倍稀釋的鐵鉬納米粒子，使最終鐵鉬納米粒子濃度(鐵離子濃度)為0. 01至 IOOmM之間，并培養(yǎng)M小時。而后，使用5- 二甲基噻唑-2-基-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽 (5-dimethyl-thiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)試驗檢測細胞活性。當MTT加入細胞后，在37°C下反應(yīng)4小時，以分光光度計測量懸浮液中紫色甲臜在 595nm的吸收值。MTT試驗結(jié)果如圖3所示。在M小時反應(yīng)后，當鐵鉬納米粒子濃度為IOmM以下， 細胞活性(細胞生存率)大于90%，故無明顯的細胞毒性產(chǎn)生。此外，即便鐵鉬納米粒子濃度高達IOOmM,細胞活性仍約75%。[血球溶解性試驗(hemolysis assay)]血球溶解性試驗使用人體全血進行試驗。將實施例1 3的鐵鉬納米粒子添加至 200 μ L的人類全血中，使最終鐵鉬納米粒子濃度(鐵離子濃度)為0. 0001至IOOmM之間，其中人類全血儲存在含有MIU肝素鈉(IU sodium heparin)的真空采血管中(Vacutainer，BD Inc. , USA) 0而后，以回轉(zhuǎn)式震蕩器均勻混合，并置于37°C下反應(yīng)4小時。接著，以 1200rpm轉(zhuǎn)速離心樣品10分鐘，并收集血清；再以13000rpm轉(zhuǎn)速離心血清15分鐘，以移除鐵鉬納米粒子。最后，以分光光度計分析懸浮液，而M5nm波長的吸收值即為紅血球含量。血球溶解性試驗結(jié)果如圖4所示。在各種不同濃度及粒徑的鐵鉬納米粒子下，仍無明顯血球溶解情形發(fā)生(< 5% )。因此，由上述MTT試驗及血球溶解性試驗結(jié)果顯示，不同粒徑的鐵鉬納米粒子均可以呈現(xiàn)高細胞生存率及低血球溶解性。[鐵鉬納米粒子在器官中的分布]首先，將由成功大學(xué)動物中心購得的六個月大的C3H/HeN公鼠，以40mg/Kg噴妥撒 (pentothal)麻醉，再從尾巴靜脈注射5mg/kg實施例1 3的鐵鉬納米粒子。經(jīng)12，24,48， 96，168小時后，殺死老鼠。以鹽水灌注后，收集如腦、心臟、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、睪丸、及血液等組織，并以硝基-氫氯酸(nitro-hydrochloride acid)研磨細胞。過濾后，以火焰原子吸收光譜儀(flame atomic absorption spectrometer) (UNICAM solar M6 series) 分析溶液樣品，而分析結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，在一周后(168小時)，多數(shù)鐵鉬納米粒子均排除體外。較大粒徑的鐵鉬納米粒子具有較高血清濃度、及較高血清半衰期；且在96小時后，三種粒徑的鐵鉬納米粒子含量均與背景值相同。在注射48小時后，血清中約含有102. 2μ g/g的實施例3的鐵鉬納米粒子，但僅含有22. 2 μ g/g的實施例1的鐵鉬納米粒子、及49. 6 μ g/g的實施例2 的鐵鉬納米粒子。鐵鉬納米粒子主要聚集在脾臟中，其次為肺及肝臟中，并隨著時間拉長而排除。實施例3的鐵鉬納米粒子在器官中的濃度最高點是在注射12小時后，但實施例1及 2的濃度最高點則發(fā)生在注射48小時后。在注射12小時后的鐵鉬納米粒子在脾臟及肺臟中，實施例3的鐵鉬納米粒子濃度為Ml. 5 μ g/g及120. 4 μ g/g,而實施例2的鐵鉬納米粒子濃度為204. 9 μ g/g及M7. 9 μ g/g。在注射48小時后，實施例1的鐵鉬納米粒子在脾臟中的濃度為146. 6 μ g/g，在肝臟中的濃度為96. 5 μ g/g。此外，實施例2的鐵鉬納米粒子的非專一性肝吸收最低。此外，實施例1 3的鐵鉬納米粒子在M小時內(nèi)均呈現(xiàn)短暫聚集， 且實施例1的鐵鉬納米粒子在腦部中的濃度最高，此與血腦屏障(blood-brain-barrier) 的尺寸限制理論相符合。經(jīng)由上述實驗證實，鐵鉬納米粒子可以用于體內(nèi)試驗上。[體外MRI及CT攝影]將不同濃度實施例1 3的鐵鉬納米粒子(0. 01 IOOmM)與PBS控制組置于微量管中進行MRI及CT對比造影試驗。體外MRI試驗參數(shù)如下所述T2加權(quán)三維快速回波序列(T2-Weighted three dimensional fast-field echo sequences)(重復(fù)時間為 550ms/回波時間為 15ms/偏向角為15° /信號提取(acquisition)數(shù)為3)，視野范圍140 X 100mm，矩陣大小256 X 196像素 (pixels)，切片厚度為1. 4mm。體外MRI試驗結(jié)果顯示，實施例1 3的鐵鉬納米粒子均可呈現(xiàn)顯著的劑量依賴逆向磁振圖像對比(inverse MR image contrast)。經(jīng)量化后，如圖6所示，實施例3的鐵鉬納米粒子可以呈現(xiàn)最佳的負向磁振對比(negative MR contrast)，且當鐵鉬納米粒子濃度低至ImM Fe，信號強度減少86%。25mM ！^的實施例1的鐵鉬納米粒子圖像信號減弱(image darkening)約觀％，而實施例1的鐵鉬納米粒子圖像信號減弱約33%。此外，在體外試驗中，實施例3的鐵鉬納米粒子具有最佳劑量依賴逆向磁振圖像對比效果。此外，CT掃描則使用美國GE公司所生產(chǎn)的64排螺旋掃描CT(GE Light Speed VCT 64-detector CT)，參數(shù)如下切片厚度為0. 625mm ； 120kVp，30mA ；視野范圍512x 512，機架旋轉(zhuǎn)時間0. 4s ；檢查臺移動速度40mm/rotation。體外CT試驗結(jié)果顯示，實施例1 3的鐵鉬納米粒子均可以呈現(xiàn)劑量依賴正向?qū)Ρ仍鰪娦Ч?，且以ImM ！^濃度下效果最佳。經(jīng)量化后，如圖7所示，IOOmM !^e濃度(相當于44.7mg FePt/mL)的實施例3的鐵鉬納米粒子的CT信號，與一般常用的含碘CT試劑 (48. 4mg/mL)的信號相當。換言之，在相同試劑濃度下，實施例3的鐵鉬納米粒子的顯影效果與現(xiàn)今所用的含碘CT試劑效果相同。此外，實施例1及2的鐵鉬納米粒子的顯影效果約是現(xiàn)今所用的含碘CT試劑效果的兩倍。經(jīng)由上述實驗證實，實施例1 3的鐵鉬納米粒子因其超順磁性而可以幫助縮短T2質(zhì)子弛豫效應(yīng)(proton relaxation)，且高X射線吸收系數(shù)(Pt成分的吸收系數(shù)為 4. 99cm2/g)可以提升CT對比度。此外，質(zhì)量磁性及X射線吸收與粒徑的關(guān)系，可以反應(yīng)至磁振顯影及CT對比上，故實施例1 3的鐵鉬納米粒子可以有效用于CT及MRI的雙顯影劑。[用于CT及MRI的雙顯影劑的體外測試]在此，使用野生細胞(MBT2)及MBT2 Her2抑制細胞(MBT-KD)作為細胞模型。107 個細胞使用4%的三聚甲醛(paraformaldehyde)固定后，再懸浮在15mL試管中，而后與實施例4及6的用于CT及MRI的雙顯影劑(FePt-anti-Her2)反應(yīng)，并以實施例1及3的鐵鉬納米粒子(FePt)作為對照組，其中最終鐵濃度為ImM。在反應(yīng)4小時后，IO7之系分別放置于微量管中，并測量其磁振圖像。在此，MRI試驗參數(shù)如下所述仏加權(quán)序列，其中快速回波重復(fù)時間(TR)為550ms，回波時間(TE)為15ms，而回波鏈長度(echo train length, ET) 為10ms。而后，以上述體外CT攝影參數(shù)，進行體外CT試驗。雙顯影劑的體外MRI試驗結(jié)果量化如圖8所示，而體外CT試驗結(jié)果量化如圖9所示。如圖8所示，實施例1的鐵鉬納米粒子對MBT-KD細胞的磁振信號減少約3. 6 %， 但對MBT2細胞的信號減少約42%，此結(jié)果表示Her2/neu基因表現(xiàn)對3nm的鐵鉬納米粒子會產(chǎn)生非專一性影響。然而，實施例3的鐵鉬納米粒子對MBT-KD細胞及MBT2細胞均會使信號大幅度的減少(MBT-KD為47. 6%，而MBT2為49. 7% )，故Her2/neu基因表現(xiàn)對12nm 的鐵鉬納米粒子不會產(chǎn)生明顯的專一性影響。相反的，實施例4及6的雙顯影劑均會產(chǎn)生顯著的Herf/neu基因表現(xiàn)相關(guān)的信號減少。當MBT-KD細胞的MRI信號與使用雙顯影劑的 MBT-KD細胞的MRI信號比較時，實施例4的雙顯影劑的MRI信號減少約73. 7%，而實施例 4的雙顯影劑減少約65. 0%。因此，鐵鉬納米粒子表面的胺基表面改質(zhì)分子(半胱胺)可以幫助細胞胞飲作用。此外，實施例4及6的雙顯影劑也對大量表現(xiàn)Her2/neU的細胞具有選擇性，且因?qū)嵤├?的雙顯影劑具有高磁化率，故可以呈現(xiàn)極佳磁振對比度。如圖9所示，相比于MBT-KD細胞，MBT2細胞的正向?qū)Ρ仍鰪姙?. 3倍，但仍以12nm 粒子的CT對比增強最為顯著。12nm鐵鉬納米粒子對MBT-KD的CT對比增強為7. 7倍，而對 MBT2的CT對比增強為3. 1倍。此外，12nm的雙顯影劑可以明顯區(qū)分MBT-KD與MBT2的差另IJ，其中，12nm的雙顯影劑對MBT2的CT對比增強為MBT-KD的3. 1倍。
上述結(jié)果顯示，實施例6的12nm的表面修飾有抗Her2抗體的納米粒子，可以同時作為MRI (逆向?qū)Ρ?與CT(正向?qū)Ρ?的雙顯影劑。[用于CT及MRI的雙顯影劑的體內(nèi)測試]在此，使用轉(zhuǎn)殖有MBT2癌細胞的老鼠進行體內(nèi)測試。將由成功大學(xué)動物中心購得的六至八個月大的C3H/HeN公鼠，通過背腹皮下注射IO7個癌細胞(溶于100 μ L正常鹽水中，以形成ΜΒΤ-2癌細胞損害。轉(zhuǎn)殖一周后可以觀察到癌細胞。使用動物麻醉傳遞系統(tǒng)(ADS 1000 ；Engler EngineeringCorp.，Hialeah, FL)，以混合有 100% O2 的 2%異氟燒(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)麻醉老鼠。經(jīng)靜脈注射實施例4及6的雙顯影劑(5mg Fe/ kg)后，進行造影以分析癌細胞損傷情況。MTI攝影時序為注射后0及M小時，并以下列參數(shù)進行T2加權(quán)磁振提取序列快速自旋回旋(fast spin echo)的TR/TE為3000ms/99. 7ms， 且ET為10ms。每一樣品的組織信號強度以圖像量化軟件，通過組織剖面圖像的標準感興趣區(qū)塊測量(standard region-of-interest measurements)進行分析。而后，體內(nèi)微電腦斷層攝影(Skyscan 1076 X-ray Microtomograph, Skyscan, Aartselaar, Belgium)則是使用微聚焦 X 射線源(micro-focused x-ray)照射 (50keV/200fe)，每旋轉(zhuǎn)1°進行一次每一圖像提取，共旋轉(zhuǎn)360 °。同時，使用軟件 (NRecon (Skyscan) software)進行剖面圖像重組。實驗結(jié)果顯示，相比于注射后直接進行磁振造影(0小時)，經(jīng)M小時后癌細胞損害信號強度明顯減少51%。反之，CT圖像分析，經(jīng)M小時后，癌細胞組織對比明顯增強 138%。由上述結(jié)果可知，本發(fā)明實施例4至6的雙顯影劑可以選擇性的檢測癌細胞損害， 并可以提升T2MRI序列造影及CT攝影的對比度。尤其是，實施例6的粒徑為12nm的雙顯影劑效果更加顯著。上述實施例僅為了方便說明而舉例而已，本發(fā)明所主張的權(quán)利范圍自應(yīng)以權(quán)利要求所述為準，而非僅限于上述實施例。
權(quán)利要求
1.一種用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法，其特征在于，包括下列步驟A，提供一混合溶液，其包含一鉬化合物、一鐵化合物、一多元醇、一界面活性劑、及一溶劑；B，加熱該混合溶液以使該鉬化合物與該鐵化合物進行反應(yīng)，以得一鐵鉬納米粒子；C，冷卻該混合溶液，并將該鐵鉬納米粒子由該混合溶液中分離出；以及D，將該鐵鉬納米粒子與一表面改質(zhì)分子混合，以得到一表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，在步驟(D)后還包括一步驟E將該表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑與一標靶分子混合，以得到一具標靶能力的分子造影雙顯影劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鉬化合物為至少一選自由 Pt (acac) 2、PtCl2, PtCl4, H2PtCl4, H2PtCl6, K2PtCl4、及 K2PtCl6 所組成的群組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵化合物為至少一選自由 Fe (CO) 5、Fe (acac) 2、Fe (acac) 3、及 i^e-oleate 所組成的群組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該接口活性劑為至少一選自由油酸、 及油胺所組成的群組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該接口活性劑包括油酸、及油胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制作方法，其特征在于，油酸及油胺的體積比介于1 1至 3 1之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該多元醇為C8_2(l的醇類。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該多元醇為至少一選自由1，2_十六烷二醇、1，2_十二烷二醇、及聚乙二醇所組成的群組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該表面改質(zhì)分子為半胱胺、胱胺、或巰基烷基胺。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該標靶分子為抗Her2抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵鉬納米粒子如下式所示其中，X為30 60。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵鉬納米粒子的粒徑為1 20nmo
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)。
15.一種用于CT及MRI的雙顯影劑，其特征在于，包括 一鐵鉬納米粒子；以及一表面改質(zhì)分子，連結(jié)于該鐵鉬納米粒子的表面，使該鐵鉬納米粒子的表面修飾有一胺基、一羧基、或一生物素；其中，該鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)，且該鐵鉬納米粒子如下式所示 FesPt100-X 其中，χ為30 60。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，還包括一標靶分子，其與該表面分子連接，且該標靶分子為一抗體、一蛋白質(zhì)、一核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該表面改質(zhì)分子為一胺基表面改質(zhì)分子，其具有巰基及胺基，且該胺基表面改質(zhì)分子通過該巰基連結(jié)于該鐵鉬納米粒子的表面，使該鐵鉬納米粒子的表面修飾有該胺基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的雙顯影劑，其特征在于，還包括一標靶分子，其具有一羧基，且通過該羧基與該鐵鉬納米粒子表面上的該胺基的鍵結(jié)，以將該標靶分子與該胺基表面改質(zhì)分子連結(jié)。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該表面改質(zhì)分子為半胱胺、胱胺、或巰基烷基胺。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該鐵鉬納米粒子的粒徑為1 20nmo
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該抗體為抗Her2抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該雙顯影劑經(jīng)由下列步驟所制成 a，提供一混合溶液，其包含一鉬化合物、一鐵化合物、一多元醇、一界面活性劑、及一溶劑；b，加熱該混合溶液以使該鉬化合物與該鐵化合物進行反應(yīng)，以得該鐵鉬納米粒子；c，冷卻該混合溶液，并將該鐵鉬納米粒子由該混合溶液中分離出；以及d，將該鐵鉬納米粒子與該表面改質(zhì)分子混合，以得到一用于CT及MRI的雙顯影劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的雙顯影劑，其特征在于，該接口活性劑包括油酸、及油胺。
24.根據(jù)權(quán)利要求第23項所述的雙顯影劑，其特征在于，油酸及油胺的體積比介于 1 1至3 1之間。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種同時用于陰極射線計算機斷層攝影與核磁共振攝影的雙顯影劑及其制作方法，其中雙顯影劑包括一鐵鉑納米粒子；一表面改質(zhì)分子，連結(jié)于該鐵鉑納米粒子的表面，使鐵鉑納米粒子的表面修飾有一胺基、一羧基、或一生物素；其中，鐵鉑納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)，且該鐵鉑納米粒子如下式(I)所示FexPt100-x(I)其中，x為30～60。
文檔編號A61K51/00GK102526769SQ201110268380
公開日2012年7月4日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者吳炳慶, 周尚威, 楊雨桑, 蕭宇宏, 謝達斌, 陳家俊 申請人:謝達斌, 陳家俊