專(zhuān)利名稱(chēng)：醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，具體涉及ー種醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)海洋魷釣業(yè)的迅速發(fā)展，魷魚(yú)成為我國(guó)主要的水產(chǎn)加工原料。魷魚(yú)年加エ量約為30 40萬(wàn)噸，加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生包括頭、足、內(nèi)臟及表皮等廢棄物，其中魷魚(yú)皮占加工量的8%-13%。水產(chǎn)品下腳料的高附加值開(kāi)發(fā)是當(dāng)前水產(chǎn)加工 產(chǎn)業(yè)的研究熱點(diǎn)。魷魚(yú)皮中膠原蛋白含量約為其干重的70% _80%，若將抗菌活性強(qiáng)的魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽提取出來(lái)并制備凝膠，將充分提升產(chǎn)品附加值，提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。凝膠系指藥物與形成凝膠劑的輔料混合制成均一、混懸或乳劑型的乳膠稠厚液體或半固體制劑，藥物溶解或均勻分散于凝膠中。一般是利用一些新型的高分子藥用輔料如卡波姆、聚こ烯醇、羥甲基纖維素鈉等將藥物制成凝膠，從而達(dá)到提高藥物局部濃度、延長(zhǎng)藥物的釋放或擴(kuò)散過(guò)程的目的，現(xiàn)廣泛用于緩釋、控釋系統(tǒng)。目前，卡波姆應(yīng)用較廣，為丙烯酸與烯丙基蔗糖或丙烯基季戊四醇交聯(lián)的高分子聚合物，以卡波姆為基質(zhì)的凝膠劑具有釋藥快、易涂展、無(wú)油膩性，對(duì)皮膚和黏膜無(wú)刺激性、藥膜的附著性和均勻性好、干燥快等優(yōu)點(diǎn)。而目前利用魷魚(yú)皮制備凝膠尚未見(jiàn)報(bào)道。ー個(gè)公布日為2011. 02. 23、公布號(hào)為CN 101979654A、名為“ー種從魚(yú)皮中提取膠
原蛋白的方法”的發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了ー種從魚(yú)皮提取膠原蛋白的方法，主要是通過(guò)采用異丙醇脫脂，氯化鈉去除非膠原蛋白，醋酸浸提同時(shí)加酸性蛋白酶酶解，離心濃縮干燥得到魚(yú)皮膠原蛋白。這種方法只說(shuō)明了從魚(yú)皮中提取了膠原蛋白，并且并不能對(duì)所有海洋生物具有通用性，而對(duì)魷魚(yú)皮的膠原蛋白提取及魷魚(yú)皮膠原蛋白凝膠的制備并無(wú)闡述。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種利用魷魚(yú)皮制備膠原蛋白寡肽凝膠的方法，此方法不僅解決了目前市場(chǎng)上魷魚(yú)腳料的利用不當(dāng)?shù)膯?wèn)題，而且為醫(yī)藥用凝膠提供了良好的來(lái)源。本發(fā)明通過(guò)以下方案實(shí)行—種醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，制備方法包括以下步驟(I)原料處理將魷魚(yú)皮用水洗凈并切碎，放入濃度為O. 7 I. 5wt%0 NaOH水溶液中，浸泡3 5次，每次浸泡時(shí)間為5 8h ;然后將魷魚(yú)皮用水洗凈并放入濃度為O. 5 I. 3wt%0 HAc水溶液中，在40 50°C下浸泡3 5次，每次浸泡時(shí)間為5 8h ;由于魚(yú)皮中膠原纖維分子間和分子內(nèi)交聯(lián)的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，所以需進(jìn)行堿處理以打破這種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使膠原分子得以釋放，同時(shí)除去魚(yú)皮中的非膠原雜蛋白，以提高膠原蛋白含量，NaOH溶液用來(lái)破壞膠原纖維分子間和分子內(nèi)交聯(lián)的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)很，并脫除魚(yú)皮中的雜蛋白，O. 7 I. 5wt%。這個(gè)濃度不僅能夠去除雜蛋白，且能保護(hù)膠原蛋白不受損失。HAc的目的是為了去除魷魚(yú)皮上的脂肪并對(duì)魷魚(yú)皮進(jìn)行溶膠。(2)膠原蛋白肽制備將經(jīng)步驟(I)處理后的魷魚(yú)皮放入魷魚(yú)皮重量3 5倍的水中，調(diào)節(jié)溫度為40 60°C，調(diào)節(jié)pH值為6. O 8. 0，然后向水中加入魷魚(yú)皮重量3 5%的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，恒溫5 9h，然后滅酶并離心分離，取上清液，即為酶解液；酶解液通過(guò)截留分子量為IOOODa的超濾膜進(jìn)行超濾，接著將酶解液進(jìn)行真空濃縮脫色和低溫真空干燥，得到膠原蛋白肽；分子量小于IOOODa的肽具有更高的抗菌活性,經(jīng)過(guò)截留分子量為IOOODa的超濾
膜超濾后，得到的肽基本為寡肽。(3)膠原蛋白寡肽凝膠制備 按重量份數(shù)計(jì)，取2 4份卡波姆、14 17份甘油、O. 2 O. 4份十二烷基磺酸鈉、
O.2 O. 6份對(duì)羥基苯甲酸こ酯和50 60份水配置成凝膠基質(zhì)，然后對(duì)凝膠基質(zhì)進(jìn)行滅菌，最后將18 22份步驟(2)得到的膠原蛋白肽加入到滅菌后的凝膠基質(zhì)中，攪拌均勻，即得到膠原蛋白寡肽凝膠?？ú窞楸╊?lèi)聚合物，含有很多羧基，通過(guò)在水中溶脹，配置成凝膠基質(zhì)，為膠原蛋白肽提供媒介。作為優(yōu)選方案,步驟⑴中首先將魷魚(yú)皮用濃度為3 10wt%的鹽水浸泡10 20min。鹽水可以去除魷魚(yú)皮上的油潰等雜質(zhì)，排出雜質(zhì)對(duì)效果的影響。作為優(yōu)選方案，酶解液在進(jìn)行真空濃縮時(shí)的濃度為20 40波美度時(shí)，加入酶解液重量O. 2 4%的活性碳，40 60°C下脫色O. 8 I. 2h，并過(guò)濾去除活性碳。在濃度為20 40波美度進(jìn)行脫色，效果會(huì)更加顯著。40 60°C下進(jìn)行脫色不會(huì)破壞酶解液中酶解物的結(jié)構(gòu)，且有較高的脫色速度。作為優(yōu)選方案，所述的凝膠基質(zhì)，按重量份數(shù)計(jì)，取2 4份卡波姆并添加I 2份水與14 17份甘油和O. 2 O. 4份十二烷基磺酸鈉混合，研磨至透明得到基礎(chǔ)凝膠基質(zhì)；取O. 2 O. 6份對(duì)羥基苯甲酸こ酯并加入2 10份水在40 50°C下攪拌溶解得到對(duì)羥基苯甲酸こ酯溶液，將對(duì)羥基苯甲酸こ酯溶液添加到上述基礎(chǔ)凝膠基質(zhì)中，然后加入48 59水混合均勻并調(diào)節(jié)pH為6. O 7. 0，得到凝膠基質(zhì)。研磨可助于卡波姆分散，40 50°C下能夠更快的使對(duì)羥基苯甲酸こ酯溶解，PH為6. O 7. O的凝膠基質(zhì)能夠使得生成的凝膠效果更好。作為優(yōu)選方案，步驟(2)中離心分離時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6000 8000r/min，離心時(shí)間10 18min。由于酶解液中酶解物的顆粒較小，高速長(zhǎng)效的離心操作可以使酶解物的分離更加徹底。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所述的醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法具有方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，且制備的膠原蛋白寡肽凝膠抗菌活性好、綜合性能優(yōu)良。
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的說(shuō)明。
為了得到最優(yōu)結(jié)果，首先對(duì)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行選擇優(yōu)化。選擇例I :ー種醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，具體包括以下步驟(I)原料處理首先將魷魚(yú)皮用3wt%的鹽水浸泡15min,然后將魷魚(yú)皮用水洗凈并切碎,放入I. 5wt%。NaOH水溶液中，浸泡3次，每次浸泡時(shí)間為6h ;最后將魷魚(yú)皮用水洗凈并放入
I.3wt%0 HAc水溶液中，在40°C下浸泡4次,姆次浸泡時(shí)間為8h ；(2)膠原蛋白肽制備將經(jīng)步驟(I)處理后的魷魚(yú)皮放入重量為魷魚(yú)皮重量3倍的水中，調(diào)節(jié)溫度為 50°C，調(diào)節(jié)pH值為8. 0，然后向水中加入重量為魷魚(yú)皮重量3%的堿性蛋白酶，恒溫6h ;然后在100°C下滅酶5后離心分離，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為7000r/min，離心時(shí)間18min，取上清液，SP為酶解液；然后將酶解液在30°C進(jìn)行真空濃縮，在其濃度為30波美度時(shí)，加入重量為酶解液重量4%的活性碳，在40°C下脫色lh。最后對(duì)脫色后的酶解液在溫度為_(kāi)55°C、壓強(qiáng)為500Pa下進(jìn)行低溫真空干燥，得到膠原蛋白肽。選擇例2 ー種醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，具體包括以下步驟(I)原料處理將魷魚(yú)皮用5wt %的鹽水浸泡20min ;然后將魷魚(yú)皮用水洗凈并切碎，放入O. 7wt%0 NaOH水溶液中，浸泡4次，姆次浸泡時(shí)間為8h ;然后將魷魚(yú)皮用水洗凈并放入
O.5wt%0 HAc水溶液中，在45°C下浸泡5次，每次浸泡時(shí)間為5h ；(2)膠原蛋白肽制備將經(jīng)步驟(I)處理后的魷魚(yú)皮放入重量為魷魚(yú)皮重量4倍的水中，調(diào)節(jié)溫度為60°C，調(diào)節(jié)pH值為6. 0，然后向水中加入重量為魷魚(yú)皮重量4%的木瓜蛋白酶，恒溫9h ;然后在95°C下滅酶IOmin后離心分離，取上清液，即為酶解液；然后將酶解液在40°C進(jìn)行真空濃縮，在其濃度為20波美度時(shí)，加入重量為酶解液重量2%的活性碳，在60°C下脫色O. 8h。最后對(duì)脫色后的酶解液在溫度為_(kāi)58°C、壓強(qiáng)為IOOOPa下進(jìn)行低溫真空干燥，得到膠原蛋白肽。選擇例3 —種醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，具體包括以下步驟(1)原料處理將魷魚(yú)皮用IOwt %的鹽水浸泡IOmin ;然后將魷魚(yú)皮用水洗凈并切碎，放入Iwt%。NaOH水溶液中，浸泡5次，姆次浸泡時(shí)間為5h ;然后將魷魚(yú)皮用水洗凈并放入
O.8wt%0 HAc水溶液中，在50°C下浸泡3次，每次浸泡時(shí)間為6h ；(2)膠原蛋白肽制備將經(jīng)步驟(I)處理后的魷魚(yú)皮放入重量為魷魚(yú)皮重量5倍的水中，調(diào)節(jié)溫度為40°C，調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后向水中加入重量為魷魚(yú)皮重量5%的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，恒溫5h ;然后在97°C下滅酶15min后離心分離，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為7000r/min，離心時(shí)間18min，取上清液，即為酶解液；然后將酶解液在30°C進(jìn)行真空濃縮，在其濃度為40波美度時(shí)，加入重量為酶解液重量4%的活性碳，在40°C下脫色I(xiàn). 2h。最后對(duì)脫色后的酶解液在溫度為-60°C、壓強(qiáng)為SOOPa下進(jìn)行低溫真空干燥，得到膠原蛋白肽?？咕鷮?shí)驗(yàn)將金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，置37°C恒溫箱中培養(yǎng)18 24h，然后每種菌種分別挑取單個(gè)菌落分別接種于新鮮營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18 24h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法，用肉湯稀釋菌懸液濃度至含菌體約I X 105 I X 106CFU/mL,備用。選用濾紙用打孔器打成6mm直徑的圓形紙片，121°C高壓滅菌30min，再經(jīng)80°C烘干，置于干燥器中保存?zhèn)溆?。將制備好的紙片放入酶解物試液中浸?4h，取出揮干多余濾液，保存?zhèn)溆?。用濾紙片法。在超凈工作臺(tái)上將熔化的固體培養(yǎng)基倒入平板，待冷卻凝固后用微 量移液槍移取上述活化的供試菌懸液各O. lmL，用滅菌的涂布棒分別均勻涂布于平板上，制成含菌平板，待平皿稍干，用無(wú)菌鑷子將制備好的藥敏紙片均勻間隔貼于含菌平板表面，并輕壓紙片，使其與培養(yǎng)基接觸良好，將貼好的平板倒置，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，取出，觀察抑菌圈大小，用游標(biāo)卡尺測(cè)定并記錄結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值。采用濾紙片擴(kuò)散法分別測(cè)定堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶三種酶解物在40mg/mL濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的抑菌活性將堿性蛋白酶酶解液通過(guò)截留分子量為10000Da，5000Da，3000Da，IOOODa的超濾膜，收集膜上膜下各兩部分，獲得截流分子量范圍為5000Da <Mw< 10000Da、3000Da < Mw
<5000Da、IOOODa < Mw < 3000Da和Mw < IOOODa四種組分，并采用濾紙片擴(kuò)散法分別測(cè)定四種組分肽在40mg/mL濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的抑菌活性。對(duì)三個(gè)選擇例中的酶解液做抗菌試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表I。表I魷魚(yú)皮不同蛋白酶酶解物對(duì)細(xì)菌的體外抑菌活性
抑菌圈直徑(mean土S. D.，mm)
細(xì)菌 -
木瓜蛋白酶酶解物胰蛋白酶酶解物堿性蛋白酶酶解物陰性對(duì)照
金葡球菌10_02±0_3213_24±0_1215_70±0_216_00±0. 00
副溶弧茵9·34±0. 171(λ67±0·0913. 75±O. 306·00±0. 00與陰性對(duì)照相比魷魚(yú)皮三種不同蛋白酶的酶解物對(duì)2種供試菌均表現(xiàn)出極顯著的抑菌活性。三種不同蛋白酶酶解物之間比較堿性蛋白酶酶解物的抑菌活性顯著強(qiáng)于胰蛋白酶酶解物和木瓜蛋白酶酶解物，胰蛋白酶酶解物的抑菌效果優(yōu)于木瓜蛋白酶酶解物。將堿性蛋白酶酶解液通過(guò)截留分子量為10000Da，5000Da，3000Da，IOOODa的超濾膜，收集膜上膜下各兩部分，獲得截流分子量范圍為a 5000Da < Mw < 10000Da、b 3000Da
<Mw < 5000Da、c IOOODa < Mw < 3000Da 和 d Mw < IOOODa 四種組分，并采用濾紙片擴(kuò)散法分別測(cè)定四種組分肽在40mg/mL濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的抑菌活性。結(jié)果見(jiàn)表2。表2不同組分肽對(duì)細(xì)菌的體外抑菌活性
權(quán)利要求
1.ー種醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟 (1)原料處理 將魷魚(yú)皮用水洗凈并切碎，放入濃度為O. 7 I. 5wt %。NaOH水溶液中，浸泡3飛次，每次浸泡時(shí)間為5 8h ;然后將魷魚(yú)皮用水洗凈并放入濃度為O. 5^1. 3wt%0 HAc水溶液中，在4(T50°C下浸泡3飛次，每次浸泡時(shí)間為5 8h ； (2)月父原蛋白妝制備 將經(jīng)步驟(I)處理后的魷魚(yú)皮放入魷魚(yú)皮重量3飛倍的水中，調(diào)節(jié)溫度為4(T60°C，調(diào)節(jié)PH值為6. (Γ8. O,然后向水中加入魷魚(yú)皮重量3 5%的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，恒溫5 9h，然后滅酶并離心分離，取上清液，即為酶解液；酶解液通過(guò)截留分子量為IOOODa的超濾膜進(jìn)行超濾，接著將酶解液進(jìn)行真空濃縮脫色和低溫真空干燥，得到膠原蛋白妝； (3)膠原蛋白寡肽凝膠制備 按重量份數(shù)計(jì)，取2 4份卡波姆、14 17份甘油、O. 2 O. 4份十二烷基磺酸鈉、O.2 O. 6份對(duì)羥基苯甲酸こ酯和5(Γ60份水配置成凝膠基質(zhì)，然后對(duì)凝膠基質(zhì)進(jìn)行滅菌，最后將If 22份步驟(2)得到的膠原蛋白肽加入到滅菌后的凝膠基質(zhì)中，攪拌均勻，即得到膠原蛋白寡肽凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(I)中首先將魷魚(yú)皮用濃度為3 10wt%的鹽水浸泡l(T20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，其特征在于，酶解液在進(jìn)行真空濃縮時(shí)的濃度為2(Γ40波美度時(shí)，加入酶解液重量O. 2^4%的活性碳，4(T60°C下脫色O. 8^1. 2h，并過(guò)濾去除活性碳。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，其特征在干，所述的凝膠基質(zhì)，按重量份數(shù)計(jì)，取2 4份卡波姆并添加f 2份水與14 17份甘油和O. 2 O. 4份十二烷基磺酸鈉混合，研磨至透明得到基礎(chǔ)凝膠基質(zhì)；取O. 2 O. 6份對(duì)羥基苯甲酸こ酯并加入2 10份水在4(T50°C下攪拌溶解得到對(duì)羥基苯甲酸こ酯溶液，將對(duì)羥基苯甲酸こ酯溶液添加到上述基礎(chǔ)凝膠基質(zhì)中，然后加入48 59水混合均勻并調(diào)節(jié)pH為6.O 7.0，得到凝膠基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，其特征在干，步驟(2)中離心分離時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6000 8000r/min,離心時(shí)間10 18min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠的制備方法，該方法通過(guò)對(duì)魷魚(yú)皮去除雜質(zhì)和雜蛋白并溶膠，然后在40~60℃下，調(diào)節(jié)pH值為6.0~8.0通過(guò)蛋白酶酶解后真空濃縮脫色，然后低溫真空干燥得到膠原蛋白肽；取2～4份卡波姆、14～17份甘油和0.2～0.4份十二烷基磺酸鈉混合，與0.2～0.6份對(duì)羥基苯甲酸乙酯以及水配制成凝膠基質(zhì)，將之前得到的膠原蛋白肽與凝膠基質(zhì)混合得到醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠。本發(fā)明制備的醫(yī)用魷魚(yú)皮膠原蛋白寡肽凝膠具有抗菌活性高、綜合性能優(yōu)良的特點(diǎn)，該方法不僅解決了目前市場(chǎng)上魷魚(yú)腳料利用不當(dāng)?shù)膯?wèn)題，而且為醫(yī)藥用凝膠提供了良好的來(lái)源。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102688181SQ20121007903
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者付萬(wàn)冬, 周宇芳, 廖妙飛, 楊會(huì)成, 許丹, 鄭斌, 鐘明杰 申請(qǐng)人:浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院