專利名稱：逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的培養(yǎng)液、方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的培養(yǎng)液、 方法及用途。
背景技術(shù)：
幾十年來，造血干細胞在臨床上應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病的治療，被證明是治療惡性血液疾病的有效方法。造血干細胞還被證明具有橫向分化能力，具有分化形成骨細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞等多種細胞的潛能。所以，自體造血干細胞還被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的多種疾病的再生性修復(fù)治療。由于異體或異種干細胞移植會不可避免地產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，自體干細胞已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)發(fā)展的最重要的領(lǐng)域之一。人和動物出生后，機體內(nèi)存留的造血干細胞數(shù)量極其稀少。因此，自體干細胞的來源困難和生產(chǎn)數(shù)量不足，一直是困擾著現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)和自體組織器官工程的進一步發(fā)展。如何獲得巨額數(shù)量的自體造血干細胞是當(dāng)前國際干細胞疾病治療的一個重大技術(shù)瓶頸。近年來，應(yīng)用基因重組技術(shù)已經(jīng)證明，體細胞可以被重新編碼而逆向分化，產(chǎn)生被稱為誘導(dǎo)性自體多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPS干細胞)，為自體干細胞的生產(chǎn)技術(shù)提供了新的途經(jīng)。因此，利用體細胞逆向分化產(chǎn)生自體多能干細胞已經(jīng)成為干細胞技術(shù)研發(fā)的熱點。目前造血干細胞的來源可分為三類骨髓造血干細胞，動員周圍血干細胞和臍帶血干細胞。骨髓造血干細胞和動員周圍血干細胞一般有核細胞數(shù)只達到5-10X108/Kg， CD34+細胞只達到l-^cl06/Kg ；80ml臍帶血干細胞數(shù)量更少，CD34+細胞只達到1_切106。 研究顯示，在非血液病領(lǐng)域的疾病和創(chuàng)傷的修復(fù)治療中，造血干細胞的用量與組織器官疾病及損傷修復(fù)的效果大小成正相關(guān)。以上三種造血干細胞的數(shù)量，還遠遠滿足不了重大實質(zhì)性組織器官疾病，如心臟病、大腦神經(jīng)疾病和損傷、肝病、腎衰竭等等疾病的再生和修復(fù)治療的需要，其療效明顯不足。因此，還有必要研究和開發(fā)出新的造血干細胞來源。

發(fā)明內(nèi)容
體細胞是干細胞順向分化產(chǎn)生的，具有某些具體功能的子代細胞。體細胞的染色體DNA和干細胞的染色體DNA在基因結(jié)構(gòu)和基因的數(shù)量上并不存在差異。體細胞和干細胞之間的最主要的差別可能只是某些功能基因處于不同的活性表達狀態(tài)。功能基因表達的差異決定了細胞的具體功能和形態(tài)的差異。我們推測，干細胞向體細胞順向分化的程序啟動后，干細胞本身的干細胞特性決定基因的開關(guān)就被關(guān)閉，隨后，干細胞就分化形成了具有某種特定功能的體細胞；換句話說，在體細胞染色體DNA序列中仍然存在造血干細胞特性決定基因，例如⑶34基因、ABCG2基因和⑶133基因等，這些基因只是處于關(guān)閉或靜止狀態(tài)。 利用某些物質(zhì)打開體細胞DNA序列中的造血干細胞特性決定基因⑶34、ABCG2和⑶133等基因開關(guān)，這些體細胞就可能重新逆向分化而形成新的造血干細胞。因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的培養(yǎng)液。本發(fā)明的另一個目的是提供一種逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為在RPMI1640培養(yǎng)基中添加以下成分當(dāng)歸提取物10 100mg/ml、人參提取物10 100mg/ml、Rho激酶抑制劑Y-276325 30口] 、干細胞因子5 301^/1111、白細胞介素-3 5 30ng/ml、白細胞介素-6 5 30ng/ ml、白細胞介素-11 5 30ng/ml ；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中還包括水蛭提取物80 120mg/ ml ο優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液為在RPMI 1640培養(yǎng)基中添加以下成分當(dāng)歸提取物50mg/ ml、人參提取物50mg/ml、I ho激酶抑制劑Y-27632 10 μ M、干細胞因子10ng/ml、白細胞介素-3 lOng/ml、白細胞介素-6 lOng/ml、白細胞介素-11 lOng/ml ；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中還包括水蛭提取物100mg/ml。此外，本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)液在逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞中的用途。另一方面，本發(fā)明提供一種逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的方法，所述方法包括采用上述培養(yǎng)液培養(yǎng)體細胞，使其逆向分化產(chǎn)生造血干細胞。優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟1)用添加以下成分的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)體細胞48-72小時當(dāng)歸提取物10 100mg/ml、人參提取物10 100mg/ml、I ho激酶抑制劑 Y-27632 5 30μΜ、干細胞因子5 30ng/ml、白細胞介素-3 5 30ng/ml、白細胞介素-6 5 30ng/ml、白細胞介素-11 5 30ng/ml ;2)換用添加以下成分的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng) 6-9天當(dāng)歸提取物10 100mg/ml、人參提取物10 100mg/ml、水蛭提取物80 120mg/ ml,Rho激酶抑制劑Y-276325 30 μ Μ、干細胞因子5 30ng/ml、白細胞介素-3 5 30ng/ ml、白細胞介素-6 5 30ng/ml、白細胞介素-11 5 30ng/ml。優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟1)用添加以下成分的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)體細胞48-72小時當(dāng)歸提取物50mg/ml、人參提取物50mg/ml、Rho激酶抑制劑Y-27632 1(^1、干細胞因子10叫/1111、白細胞介素-3 10ng/ml、白細胞介素-6 10ng/ml、白細胞介素-11 lOng/ml ;2)換用添加以下成分的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6-9天當(dāng)歸提取物50mg/ ml、人參提取物50mg/ml、水蛭提取物100mg/ml、Rho激酶抑制劑Y-27632 10 μ Μ、干細胞因子lOng/ml、白細胞介素-3 lOng/ml、白細胞介素-6 lOng/ml、白細胞介素-11 lOng/ml。優(yōu)選地，所述步驟1)和2)的培養(yǎng)條件如下5% CO2和37°C。優(yōu)選地，所述方法還包括用DMEM培養(yǎng)液在逆向分化體細胞之前培養(yǎng)體細胞的步驟；更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)條件為細胞密度2-^d07ml，5% C02，37°C，培養(yǎng)小時。優(yōu)選地，所述方法還包括檢測逆向分化體細胞產(chǎn)生的造血干細胞的步驟；更優(yōu)選地，所述檢測方法為以CD34、ABCG2和/或CD133作為特異細胞表型檢測指標，采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術(shù)和/或Western blot蛋白印跡技術(shù)進行檢測。優(yōu)選地，所述方法還包括冷凍保存逆向分化體細胞產(chǎn)生的造血干細胞的步驟；更優(yōu)選地，所述冷凍保存方法為將造血干細胞以IxIOltVml的細胞密度與二甲基亞砜混合， 以10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度降溫至-80°C，然后轉(zhuǎn)移到-186°C液氮中深低溫保存。
優(yōu)選地，所述方法中，體細胞選自血液單個核細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、成纖維細胞等。具體地，所述體細胞的來源包括臍帶血；胎盤；細胞專業(yè)公司商品化提供的非永生化人的各種體細胞株；細胞專業(yè)公司商品化提供的永生化人的各種體細胞株；常規(guī)血庫保存的血液和白細胞懸液；新鮮分離制備的人的皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞等；因手術(shù)切除而廢棄的部分健康組織器官，如腦、肌肉、肝、脾、腎、骨、和脂肪組織等。 此外，本發(fā)明還提供了上述方法制備的造血干細胞或造血干細胞庫。本發(fā)明還提供了上述造血干細胞作為種子細胞和再生修復(fù)細胞，在制備用于再生醫(yī)學(xué)/修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病和損傷；惡性血液?。豢顾ダ媳＝〉乃幬镏械挠猛?；優(yōu)選地，所述再生醫(yī)學(xué)/修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病和損傷選自缺血性心臟病、糖尿病、腦出血、腦梗死、股骨頭壞死、卵巢早衰、腦震蕩、腦挫裂傷、大腦損傷、開放性顱腦損傷、肝硬化、纖維肝、脂肪肝、出血性壞死性胰腺炎、胰腺損傷、胰腺纖維化、各種腫瘤化療后免疫功能減退綜合癥、放療后免疫功能減退綜合癥的免疫功能重建、慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、腺垂體功能減退癥、垂體前葉機能減退癥、中樞性尿崩癥，甲狀腺切除術(shù)后甲狀腺損傷、甲狀腺功能減退癥、 甲狀旁腺機能減退癥和腎功能衰竭；所述惡性血液病選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤， 先天性溶血性貧血、再生障礙性貧血和放射性疾病。由此可見，本發(fā)明不同于已有的利用基因重組技術(shù)誘導(dǎo)體細胞逆向分化產(chǎn)生干細胞(iP干細胞)，提供了一種新的人的體細胞逆向分化產(chǎn)生自體造血干細胞的生產(chǎn)調(diào)控技術(shù)，利用植物提取物和蛋白配方技術(shù)誘導(dǎo)體細胞逆向分化產(chǎn)生的干細胞(Plants and Proteins induced pluripotent stem cell，PPiPS干細胞)，使得細胞結(jié)構(gòu)接近于自然干細胞，安全性高。具體而言，本發(fā)明在不改變?nèi)说捏w細胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，應(yīng)用經(jīng)過篩選優(yōu)化設(shè)計的植物提取物和蛋白組成的培養(yǎng)液配方，在體外重新激活體細胞DNA序列中的造血干細胞特性決定基因開關(guān)，使這些體細胞就重新逆向分化而形成新的造血干細胞，并且可以冰凍長期保存植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體造血干細胞，建立個人的植物和蛋白誘導(dǎo)性自體造血干細胞庫。因此，本發(fā)明提供的技術(shù)方法解決了以下這些問題(1)選用什么樣的人的體細胞作為逆向分化生產(chǎn)人自體造血干細胞的原料細胞；(2)怎樣處理和培養(yǎng)各種原料細胞；(3)怎樣使原料細胞逆向分化生產(chǎn)人自體造血干細胞；(4)怎樣檢測生產(chǎn)的人自體造血干細胞；(5)怎樣冰凍長期保存植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體造血干細胞；(6)怎樣建立植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體造血干細胞庫的系統(tǒng)過程以及方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，提供的方法包括以下步驟(1)選用的人的原料體細胞及制備方法，原料體細胞可以是血液單個核細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞等；(2)選用的原料體細胞的培養(yǎng)方法以2-5xl06的密度，用相應(yīng)的細胞培養(yǎng)液在 5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)24-48小時；(3)使原料細胞逆向分化生產(chǎn)人自體造血干細胞的方法相應(yīng)的原料體細胞用相應(yīng)的細胞培養(yǎng)液在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)M-48小時后，換用細胞培養(yǎng)液Al (RPMI 1640Medium、當(dāng)歸提取物50mg/ml、人參提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、stem cell factor 10ng/ml、IL-3 10ng/ml、IL-610ng/ml、IL_ll lOng/ml)繼續(xù)在 5% CO2 和 37°C 條件下培養(yǎng)72小時，然后換用細胞培養(yǎng)液A2 (RPMI1640Medium、人參提取物50mg/ml、當(dāng)歸提取物50mg/ml、水蛭提取物 100mg/ml、Y-27632 10yM、stem cell factor 10ng/miaL-3 IOng/ ml、IL-6 10ng/ml、IL-Il lOng/ml)繼續(xù)在 5% CO2 和 37°C條件下培養(yǎng) 6-9 天。(4)檢測生產(chǎn)的人自體造血干細胞的方法利用造血干細胞的特異細胞表型 ⑶34、ABCG2、⑶117或⑶133等作為檢測指標，在換用細胞培養(yǎng)液A2繼續(xù)培養(yǎng)后的第3、第 6、第9和第12天，分別采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術(shù)和Western blot蛋白印跡技術(shù)檢測造血干細胞的生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度。國際上自1989年起就定義以特異細胞表型⑶34、ABCG2、⑶117或⑶133等作為造血干細胞的檢測指標，并且一般情況下僅 1-2個表型存在(如⑶34表型陽性)即可鑒定為造血干細胞，例如，臨床應(yīng)用多年的造血干細胞采集機就是采集CD34表型陽性細胞或采集CD133表型陽性細胞直接用于白血病的治療，具體還可參見韓忠朝編，《造血干細胞理論與移植技術(shù)》，河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000年。(5)冰凍長期保存植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體造血干細胞的方法吸打懸浮貼壁生長的植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞并收集到50ml毫升的離心管內(nèi)，在離心機內(nèi)以 1500rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞以lxliT/ml和 DMSO混合，以10% DMSO和低分子右旋糖酐濃度降溫至_80°C，然后轉(zhuǎn)移到液氮(-186°C ) 液相中深低溫保存，建立植物和蛋白誘導(dǎo)性自體造血干細胞庫。本發(fā)明適用于建立新型的自體造血干細胞庫，長期永久保存自體造血干細胞。與現(xiàn)有的臍帶血/骨髓/周圍血干細胞庫相比較，這種新型的自體造血干細胞庫具有生產(chǎn)/ 保存干細胞數(shù)量大，干細胞質(zhì)量可監(jiān)測性好，應(yīng)用領(lǐng)域廣等優(yōu)勢。具體而言，本發(fā)明的效果和優(yōu)勢在于以下幾方面首先，本發(fā)明提供的是一種新的體細胞逆向分化產(chǎn)生人自體造血干細胞的方法， 在不改變體細胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，使體細胞重新逆向分化而形成干細胞。其次，本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)干細胞的生產(chǎn)速度快，產(chǎn)量巨大，純度高。例如，僅用 200ml人周圍血液在1-2周內(nèi)，就可產(chǎn)生幾百億數(shù)量級別的第1代自體/異體造血干細胞， 純度達到6-50%。第三，本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的造血干細胞具有正常2倍體的染色體核型；并且裸鼠移植不產(chǎn)生腫瘤，具有較高的安全性。第四，本發(fā)明提供的方法適用于在任何年齡的人個體中生產(chǎn)造血干細胞，因此可以是一種可以在任何年齡的人個體中建立自體造血干細胞庫的新技術(shù)方法。此外，本發(fā)明提供的方法利用干細胞的特異表型作為檢測指標，各種植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體干細胞的生產(chǎn)工藝流程可以被嚴格地、多次地、系統(tǒng)地進行流式細胞技術(shù)和免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測。因此，作為自體種子細胞和再生修復(fù)細胞，本發(fā)明還具有大規(guī)模工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)自體造血干細胞的可能性。例如，在再生醫(yī)學(xué)、自體組織器官工程和自體造血干細胞生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域，植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體干細胞可能具有良好的潛在應(yīng)用前景。主要的應(yīng)用范圍包括本發(fā)明適用于再生醫(yī)學(xué)/修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病和損傷的治療，治療病種廣泛，如缺血性心臟病、糖尿病、腦出血、腦梗死、股骨頭壞死、卵巢早衰、腦震蕩、腦挫裂傷、大腦損傷、開放性顱腦損傷、肝硬化、纖維肝、脂肪肝、出血性壞死性胰腺炎、胰腺損傷、胰腺纖維化、各種腫瘤化療后免疫功能減退綜合癥、放療后免疫功能減退綜合癥的免疫功能重建、慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、腺垂體功能減退癥、垂體前葉機能減退癥、中樞性尿崩癥，甲狀腺切除術(shù)后甲狀腺損傷、甲狀腺功能減退癥、甲狀旁腺機能減退癥和腎功能衰竭的病損/ 創(chuàng)傷組織器官的再生性修復(fù)治療。本發(fā)明適用于各種惡性血液病，如白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，先天性溶血性貧血、再生障礙性貧血、放射性疾病。治療方法是應(yīng)用化療或放療等手段殺滅病人的腫瘤細胞，然后輸入健康的自體/異體造血干細胞。本發(fā)明適用于自體干細胞的抗衰老保健，利用巨額數(shù)量的自體造血干細胞再生性修復(fù)全身各組織器官的衰老變性，恢復(fù)組織器官的年青結(jié)構(gòu)和生理功能。作為器官組織再生和修復(fù)的種子細胞，植物和蛋白誘導(dǎo)性自體造血干細胞可以應(yīng)用于自身的抗衰老保健。 長期和定期補充植物和蛋白誘導(dǎo)性自體造血干細胞，通過再生、再造、修復(fù)、補充和替換的機制，綜合性修復(fù)和再生機體病損、衰老退化的組織器官結(jié)構(gòu)，恢復(fù)或再生其生理功能，產(chǎn)生了多細胞、多器官、多系統(tǒng)的綜合抗衰老效果，并獲得皮膚亮麗、外貌年青化、精神煥發(fā)、 青春重現(xiàn)、生物學(xué)年齡年輕、延緩衰老的全面抗衰老保健功效。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖IA為實施例1中作為原料細胞的血液單個核細胞，圖IB為采用本發(fā)明的方法， 用A2培養(yǎng)液培養(yǎng)第9天生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞。圖2為實施例1中采用本發(fā)明的方法，用A2培養(yǎng)液培養(yǎng)第9天，應(yīng)用細胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞的⑶34、ABCG2和⑶133特異表型。圖3為實施例1中采用本發(fā)明的方法，用A2培養(yǎng)液培養(yǎng)第9天，應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞的⑶34、ABCG2和⑶133特異表型的結(jié)果。圖4為實施例1中采用本發(fā)明的方法，用A2培養(yǎng)液培養(yǎng)第9天，應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞的⑶34、ABCG2和⑶133特異表型的結(jié)果。圖5為實施例1中采用本發(fā)明的方法，用A2培養(yǎng)液培養(yǎng)第3、6、9、12和15天，根據(jù)采用流式細胞儀技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞的CD34、ABCG2和CD133特異表型的結(jié)果而做出的造血干細胞的生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下各實施例中，采用的植物和蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)液如下Al培養(yǎng)液配方RPMI1640培養(yǎng)基(購自GICO公司)、當(dāng)歸提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州荔諾生物科技有限公司)50mg/ml、人參提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州荔諾生物科技有限公司)50mg/ml、Rho激酶抑制劑Y-27632 (購自Sigma公司)10 μ M、干細胞因子(stem cell factor，購自R&D公司)10ng/ml、白細胞介素-3 (IL-3，
8購自R&D公司)10ng/ml、白細胞介素_6 (IL-6，購自R&D公司)10ng/ml、白細胞介素-11 (IL-11，購自 R&D 公司)10ng/ml。A2培養(yǎng)液配方RPMI1640培養(yǎng)基、人參提取物50mg/ml、當(dāng)歸提取物50mg/ml、水蛭提取物(購自鄭州荔諾生物科技有限公司)100mg/ml、Rho激酶抑制劑Y-27632 10 μ Μ、干細胞因子10ng/ml、白細胞介素-3 (IL-3) lOng/ml、白細胞介素-6 (IL-6) lOng/ml、白細胞介素-11(IL-Il)10ng/ml。實施例1本實施例以周圍靜脈血、臍帶血作為原料細胞為例，采用本發(fā)明提供的植物和蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)液，生產(chǎn)并長期保存誘導(dǎo)性造血干細胞。1、周圍靜脈血的無菌采集和處理采集周圍靜脈血/臍帶血之前，應(yīng)征得供血本人或直系親屬的同意，并記錄供血本人及家庭的遺傳和傳染病史以及醫(yī)院所有相關(guān)的病毒檢查結(jié)果。周圍靜脈血/臍帶血常規(guī)抗凝，4°C保存。在M小時之內(nèi)送至干細胞制作生產(chǎn)中心。在中心需要再做相應(yīng)的病毒檢測后，進入中心電腦登記程序，在記錄相應(yīng)的條形碼編號后，血液標本進入無菌干細胞生產(chǎn)車間。2、誘導(dǎo)性造血干細胞的生產(chǎn)在干細胞生產(chǎn)車間，血液標示應(yīng)用Ficoll標準分離技術(shù)(具體參見沈關(guān)心等主編，《現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)》(第2版)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998年)分離單個核細胞后， 進行單個核細胞計數(shù)。應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液以2-切106的密度，在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng) 24-48小時；換用細胞培養(yǎng)液Al繼續(xù)在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)72小時，然后換用細胞培養(yǎng)液A2繼續(xù)在5% CO2和37 °C條件下培養(yǎng)6-9天。3、誘導(dǎo)性造血干細胞的檢測檢測生產(chǎn)的人自體造血干細胞的方法利用造血干細胞的特異細胞表型⑶34、 ABCG2和CD133等作為檢測指標，在換用細胞培養(yǎng)液A2繼續(xù)培養(yǎng)后的第3、第6、第9和第 12天，分別采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術(shù)和Western blot蛋白印跡技術(shù)檢測(具體參見沈關(guān)心等主編，《現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)》(第2版)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998年)造血干細胞的生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度。電鏡顯示原料細胞和由其誘導(dǎo)的造血干細胞的細胞形態(tài)分別如圖IA和圖IB所示。圖2中示出了應(yīng)用細胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞的CD34、ABCG2 和⑶133特異表型。應(yīng)用Western blot蛋白印跡技術(shù)檢測植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞 (PPiHPS)和⑶34、ABCG2和⑶133特異表型，并且以原料細胞(周圍血單個核細胞，PBMC) 作為對照。由電泳結(jié)果可見，PPiHPS干細胞⑶34、ABCG2和⑶133特異表型陽性，而PBMC 原料細胞CD34、ABCG2和CD133特異表型陰性。圖4為應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞的⑶34、ABCG2和⑶133特異表型的結(jié)果。如圖所示，用A2培養(yǎng)液培養(yǎng)第 9天，CD34、ABCG2和CD133特異表型的生成速度分別為5. 4%、6. 83%和9. 93%。而圖5示出用A2培養(yǎng)液培養(yǎng)第3、6、9、12和15天，根據(jù)應(yīng)采用流式細胞儀技術(shù)檢測生產(chǎn)的誘導(dǎo)性造血干細胞的⑶34、ABCG2和⑶133特異表型的結(jié)果而做出的從原料細胞生成造血干細胞的生成速度曲線圖。通過實驗結(jié)果可知，一般情況下，200ml周圍靜脈血/80ml臍帶血的單個核細胞在細胞培養(yǎng)液A2培養(yǎng)后的第6天，植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞的產(chǎn)量可達1-3.切10"，純度達到5-40%。4、誘導(dǎo)性造血干細胞的保存冰凍長期保存誘導(dǎo)性造血干細胞的方法吸打懸浮貼壁生長的造血干細胞并收集到50ml毫升的離心管內(nèi)，在離心機內(nèi)以1500rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。制備的誘導(dǎo)性造血干細胞以IxlOicVml和DMSO混合，以10% DMSO和低分子右旋糖酐濃度降溫至_80°C， 然后轉(zhuǎn)移到液氮(_186°C )液相中深低溫保存，建立植物和蛋白誘導(dǎo)性自體造血干細胞庫。實施例2本實施例以胎盤作為原料細胞為例，采用本發(fā)明提供的植物和蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)液， 生產(chǎn)并長期保存導(dǎo)性造血干細胞。1、胎盤的無菌采集和處理胎盤來源于婦產(chǎn)科醫(yī)院(北京五洲女子醫(yī)院、北京安定門醫(yī)院等)。采集胎盤直系親屬的同意，并記錄本人及家庭的遺傳和傳染病史以及醫(yī)院所有相關(guān)的病毒檢查結(jié)果。在中心需要再做相應(yīng)的病毒檢測后，進入中心電腦登記程序，在記錄相應(yīng)的條形碼編號后，胎盤標本進入無菌干細胞生產(chǎn)車間。用含有消毒劑的生理鹽水/磷酸緩沖液/DMEM培養(yǎng)液依序清洗胎盤，應(yīng)用剪碎、 研磨和DMEM培養(yǎng)液沖洗的方法，將胎盤細胞收集到50ml毫升的離心管內(nèi)，在離心機內(nèi)以 1500rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。再次用培養(yǎng)液清洗離心兩次。采用16G、18G和20G的針頭過濾，把胎盤細胞制成單個細胞并計數(shù)。2、誘導(dǎo)性造血干細胞的生產(chǎn)應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液以2_5xl06的密度，在5% CO2和37 °C條件下把胎盤細胞培養(yǎng) 24-48小時；換用細胞培養(yǎng)液Al繼續(xù)在5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)72小時，然后換用細胞培養(yǎng)液A2繼續(xù)在5% CO2和37 °C條件下培養(yǎng)6-9天。3、誘導(dǎo)性造血干細胞的檢測檢測生產(chǎn)的自體造血干細胞的方法利用造血干細胞的特異細胞表型⑶34、 ABCG2、CD117和CD133等作為檢測指標，在換用細胞培養(yǎng)液A2繼續(xù)培養(yǎng)后的第3、第6、第 9和第12天，分別采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術(shù)和Western blot蛋白印跡技術(shù)檢測造血干細胞的生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度。—般情況下，一個胎盤制備的單個胎盤細胞在細胞培養(yǎng)液A2培養(yǎng)后的第6天，植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞的產(chǎn)量可達Ι-hlO12，純度達到10-40%。4、誘導(dǎo)性造血干細胞的保存冰凍長期保存植物和蛋白誘導(dǎo)性人自體造血干細胞的方法吸打懸浮貼壁生長的植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞并收集到50ml毫升的離心管內(nèi)，在離心機內(nèi)以1500rpm，4°C 離心10分鐘，棄上清。制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞以IxIOltVml和二甲基亞砜 (DMSO)混合，以10% DMSO和低分子右旋糖酐濃度降溫至-80°C，然后轉(zhuǎn)移到液氮(_186°C ) 液相中深低溫保存，建立植物和蛋白誘導(dǎo)性自體造血干細胞庫。實施例3本實施例對實施例2中制備的植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞進行裸鼠移植的安全性研究，具體如下。
在兩組裸鼠移植試驗中，裸鼠皮下移植注射IX IO8個植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞或1 X IO8個人自然胚胎干細胞，觀察接種部位有否腫瘤形成。連續(xù)觀察90天。結(jié)果顯示，植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞試驗組10只裸鼠無一例產(chǎn)生腫瘤，具有較高的安全性；而人自然胚胎干細胞試驗組10只裸鼠全部產(chǎn)生腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種用于逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液為在 RPMI 1640培養(yǎng)基中添加以下成分當(dāng)歸提取物10 100mg/ml、人參提取物10 IOOmg/ ml、Rho激酶抑制劑Y-27632 5 30 μ M、干細胞因子5 30ng/ml、白細胞介素-3 5 30ng/ml、白細胞介素-6 5 30ng/ml、白細胞介素-11 5 30ng/ml ；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中還包括水蛭提取物80 120mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液為在RPMI1640培養(yǎng)基中添加以下成分當(dāng)歸提取物50mg/ml、人參提取物50mg/ml、Iih0激酶抑制劑Υ-2763210 μ Μ、 干細胞因子10ng/ml、白細胞介素-3 lOng/ml、白細胞介素-6 lOng/ml、白細胞介素-11 10ng/ml ；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中還包括水蛭提取物100mg/ml。
3.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)液在逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞中的用途。
4.一種逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的方法，其特征在于，所述方法包括采用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)液培養(yǎng)體細胞，使其逆向分化產(chǎn)生造血干細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)用添加以下成分的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)體細胞48-72小時當(dāng)歸提取物10 100mg/ml、人參提取物10 100mg/ml、Rho激酶抑制劑Y-276325 30 μ Μ、干細胞因子5 30ng/ml、白細胞介素-3 5 30ng/ml、白細胞介素-65 30ng/ml、白細胞介素-11 5 30ng/ml ；2)換用添加以下成分的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6-9天當(dāng)歸提取物10 100mg/ml、人參提取物10 100mg/ml、水蛭提取物80 120mg/ml、Rho激酶抑制劑Y-27632 5 30 μ M、 干細胞因子5 30ng/ml、白細胞介素-3 5 30ng/ml、白細胞介素-6 5 30ng/ml、白細胞介素-11 5 30ng/ml ；優(yōu)選地，所述步驟1)和2、的培養(yǎng)條件如下5% CO2和37°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括用DMEM培養(yǎng)液在逆向分化體細胞之前培養(yǎng)體細胞的步驟；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)條件為細胞密度2-^d06/ml，5% C02，37°C，培養(yǎng) 24-48 小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括檢測逆向分化體細胞產(chǎn)生的造血干細胞的步驟；優(yōu)選地，所述檢測方法為以⑶34、ABCG2和/或⑶133 作為特異細胞表型檢測指標，采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術(shù)和/或蛋白印跡技術(shù)進行檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括冷凍保存逆向分化體細胞產(chǎn)生的造血干細胞的步驟；優(yōu)選地，所述冷凍保存方法為將造血干細胞以IxIOltVml的細胞密度與二甲基亞砜混合，以10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度降溫至_80°C，然后轉(zhuǎn)移到-186°C液氮中深低溫保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一項所述的方法，其特征在于，所述體細胞選自血液單個核細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、成纖維細胞等。
10.權(quán)利要求3至9中任一項所述方法制備的造血干細胞或造血干細胞庫。
11.權(quán)利要求10所述的造血干細胞作為種子細胞和再生修復(fù)細胞，在制備用于再生醫(yī)學(xué)/修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病和損傷；惡性血液?。豢顾ダ媳＝〉乃幬镏械挠猛?；優(yōu)選地，所述再生醫(yī)學(xué)/修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病和損傷選自缺血性心臟病、糖尿病、腦出血、腦梗死、股骨頭壞死、卵巢早衰、腦震蕩、腦挫裂傷、大腦損傷、開放性顱腦損傷、肝硬化、纖維肝、脂肪肝、 出血性壞死性胰腺炎、胰腺損傷、胰腺纖維化、各種腫瘤化療后免疫功能減退綜合癥、放療后免疫功能減退綜合癥的免疫功能重建、慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、腺垂體功能減退癥、 垂體前葉機能減退癥、中樞性尿崩癥，甲狀腺切除術(shù)后甲狀腺損傷、甲狀腺功能減退癥、甲狀旁腺機能減退癥和腎功能衰竭；所述惡性血液病選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，先天性溶血性貧血、再生障礙性貧血和放射性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的培養(yǎng)液、方法及用途。本發(fā)明提供的逆向分化體細胞產(chǎn)生造血干細胞的培養(yǎng)液是由多種植物提取物與蛋白混合組成的皮膚，可以將人的體細胞逆向誘導(dǎo)分化，在2周內(nèi)產(chǎn)生幾百億數(shù)量級別的造血干細胞，并且這種植物和蛋白誘導(dǎo)性造血干細胞具有與人自然造血干細胞類似的細胞特異表型，不僅具有多種疾病治療和抗衰老保健的應(yīng)用潛力，而且適用于建立新型的造血干細胞庫，長期永久保存自體造血干細胞。與現(xiàn)有的臍帶血/骨髓/周圍血干細胞庫相比較，這種新型的自體造血干細胞具有生產(chǎn)/保存干細胞數(shù)量大，干細胞質(zhì)量可監(jiān)測性好，應(yīng)用領(lǐng)域廣等優(yōu)勢。
文檔編號A61P5/18GK102399741SQ201010289088
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者林雄斌 申請人:林雄斌