專利名稱：利用大豆屬發(fā)酵提取物抑制15－脂肪氧合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明將大豆屬發(fā)酵提取物用于抑制15-脂肪氧合酶，預(yù)防和/或治療由15-脂肪氧合酶而引發(fā)的疾病，如心血管疾病、免疫功能紊亂(如，哮喘和/或炎癥)并有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。本發(fā)明還包括采用大豆屬發(fā)酵提取物預(yù)防和/或治療微生物感染。
背景技術(shù)：
脂肪氧合酶(LOX)為含非血基質(zhì)鐵的酶，可以對某些多不飽和脂肪酸，如脂蛋白，的氧化起催化作用。已知的幾種不同的脂肪氧合酶，例如LOX-5，LOX-12和LOX-15都具有其特有的氧化作用。LOX-15能催化花生四烯酸和亞油酸的氧化反應(yīng)并參與低密度脂蛋白(LDL)的氧化變性(oxidative modification)。許多研究報道LOX-15與冠狀動脈病變和動脈硬化癥(Shen等人，J.Clin.Invest.1996，Vol.98，No.10，pp.2201-2208；Timo等人，1995，Vol.92(11)，pp.3297-3303；Ravalli等人，1995，Arteriosclerosis，Thrombosis andVascular Biology，Vol.15，No.3，pp.340-348；及Kuhn等人，1997，J.Clin.Invest.，Vol.99，No.5，pp.888-893)，癌癥和炎癥疾病(USP6,001,866；Mogul等人，2001，Biochemistry，40，4391-4397；Walther等人，1999，Molecular Pharmacology，56196-203；及Kamitani等人，1998，the Journal of Biological Chemistry，Vol.273，No.34，pp.21569-21577)以及免疫響應(yīng)(Kruisselbrink等人，2001，Clin ExpImmunol，1262-8)有關(guān)。因此，可以有效抑制LOX的物質(zhì)將有助于預(yù)防和治療與LOX相關(guān)的疾病。
大豆是人類飲食中異黃酮的高濃度攝取源。大豆中還含有其它化合物，包括皂角苷、植物甾醇、大豆肌醇六磷酸、蛋白酶抑制劑、酚酸、多糖、硼、卵磷脂、Ω-3脂肪酸和葉酸。這些都有益于健康。許多傳統(tǒng)的東方食品，如天貝(tembe)和納豆，都是由大豆發(fā)酵制得的。例如，天貝是將大豆接種根霉寡孢子、米根霉、少根根霉和匍枝根霉發(fā)酵得到的。納豆是由大豆接種納豆桿狀菌發(fā)酵而得到。這些傳統(tǒng)的發(fā)酵食品可以作為絕佳的蛋白質(zhì)攝取源。但是，先前并沒有報道揭示大豆發(fā)酵食品或大豆本身可以用來抑制15-脂肪氧合酶LOX-15。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用大豆屬發(fā)酵提取物抑制15-脂肪氧合酶(LOX-15)，大豆屬發(fā)酵提取物是將大豆屬提取物在水溶液中，與至少一種乳酸菌和至少一種酵母發(fā)酵制得的。具體點說，所用的大豆屬植物為大豆或黑豆。更具體的說，本發(fā)明的大豆屬發(fā)酵提取物包括大豆發(fā)酵提取物和黑豆發(fā)酵提取物。
本發(fā)明的大豆屬發(fā)酵提取物可用來預(yù)防和/或治療由15-脂肪氧合酶的抑制作用而引發(fā)的疾病，如心血管疾病、免疫功能紊亂(如，哮喘和炎癥)，并有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。
本發(fā)明的大豆屬發(fā)酵提取物還可以用于預(yù)防和/或治療微生物感染之類主題的疾病。


圖1給出大豆發(fā)酵提取物對LOX-15的抑制作用。
圖2給出黑豆發(fā)酵提取物濃度與LOX-15抑制率的關(guān)系。
圖3給出五倍子酸的抗氧化效果。在37℃下，加入H2O2作為過氧化劑(X)，五倍子酸作為抗氧化劑(Y)和/或乙醛作為自由基受體(Z)之后，測量化學(xué)熒光強度和CL數(shù)。圖3(a)中，曲線A為同時加入X和Y之后的化學(xué)熒光強度，曲線B為同時加入Y和Z之后的化學(xué)熒光強度，曲線C為同時加入X和Z之后的化學(xué)熒光強度。圖3(b)給出的是在200秒時刻，向X和Z的混合物中加入五倍子酸，化學(xué)熒光強度增加(也就是說，只有在X、Y和Z同時存在的情況下會產(chǎn)生化學(xué)熒光)。
圖4給出茶和維生素C的抗氧化效果。測試溫度37℃，以H2O2作為過氧化劑，在加入乙醛(Z)作自由基受體和不加入的情況下，在200秒時刻分別添加以下幾種抗氧化劑之一，即EGC、茶和維生素C，測量化學(xué)熒光強度和CL數(shù)。圖4(a)給出分別在使用與不使用乙醛的情況下，在200秒時刻加入EGC(表焙兒茶素，一種多酚物質(zhì))作為抗氧化劑時，化學(xué)熒光強度的變化。由圖4(b)可知在200秒時刻加入茶作為抗氧化劑，無乙醛存在下的化學(xué)熒光強度為乙醛(+Z)存在下的5.79％。圖4(c)表明，使用維生素C作為抗氧化劑，無乙醛存在下的化學(xué)熒光強度為乙醛存在下的64.13％。
圖5給出不同濃度大豆發(fā)酵提取物，F(xiàn)SE的抗氧化作用。測量溫度37℃，以H2O2為過氧化劑，分別在使用乙醛作為自由基受體(Z)與不使用的情況下，在200秒時刻加入大豆發(fā)酵提取物，測量不同濃度的提取物對應(yīng)的化學(xué)熒光強度。圖5(a)表明，F(xiàn)SE濃度為1∶1時，無乙醛存在下的化學(xué)熒光強度為乙醛存在下的44.13％。圖5(b)表明，F(xiàn)SE濃度為1∶10時，無乙醛存在下的化學(xué)熒光強度為乙醛存在下的63.64％。圖5(c)和(d)表明，F(xiàn)SE濃度為1∶100和1∶500時，無乙醛存在下的化學(xué)熒光強度至少為乙醛存在下的90％。
圖6給出大豆發(fā)酵提取物對載脂蛋白E缺乏小鼠體內(nèi)總體血漿膽固醇水平的影響。
圖7給出大豆發(fā)酵提取物對載脂蛋白E缺乏小鼠傷口的影響。
圖8為載脂蛋白E缺乏小鼠大動脈傷口著色照片。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及大豆屬發(fā)酵提取物在生產(chǎn)用于抑制15-脂肪氧合酶(LOX-15)以及與15-脂肪氧合酶相關(guān)的疾病之組合物中的新應(yīng)用。所使用的大豆屬發(fā)酵提取物是將大豆屬提取物在水溶液中，與至少一種乳酸菌和至少一種酵母發(fā)酵制得的。意外的發(fā)現(xiàn)大豆屬發(fā)酵提取物能有效地抑制低濃度下的15-脂肪氧合酶。
具體的說，含有本發(fā)明中的大豆屬發(fā)酵提取物的組合物可用于預(yù)防和/或治療與15-脂肪氧合酶相關(guān)的疾病，如心血管疾病、免疫功能紊亂(如，哮喘和炎癥)并有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。此外，該發(fā)明中的大豆屬發(fā)酵提取物還能預(yù)防和/或治療微生物感染。
該發(fā)明中的組合物可以為醫(yī)藥組合物或食品組合物。
大豆發(fā)酵提取物的制備方法大豆屬發(fā)酵提取物是將大豆屬提取物在水溶液中，與至少一種乳酸菌和至少一種酵母發(fā)酵制得，并(例如)通過加熱對發(fā)酵液進行滅菌，過濾和濃縮為可選過程。
根據(jù)本發(fā)明，用于制備大豆屬發(fā)酵提取物的大豆屬植物包括大豆和黑豆。更具體的說，本發(fā)明中的大豆屬發(fā)酵提取物為大豆發(fā)酵提取物或黑豆發(fā)酵提取物。
大豆屬發(fā)酵提取物是將大豆屬提取物與至少一種乳酸菌和至少一種酵母菌發(fā)酵制得的。使用的乳酸菌為一株或多株同類乳酸菌或幾株不同種類的乳酸菌，酵母菌為一株或多株同類酵母菌或幾株不同種類的酵母菌。大豆屬提取物的與一種或多種乳酸菌及可選酵母菌的發(fā)酵過程，可能是按照任一次序進行也可能是同時進行的，不過其更傾向于同時進行。
如果發(fā)酵過程中使用了多于一種微生物，發(fā)酵可能按順序進行也可能同時進行。經(jīng)過篩選的非轉(zhuǎn)基因有機大豆屬提取液更適宜作為起始原料。而且更適宜采用乳酸菌異種培養(yǎng)物，例如5、10、15、20、25或30株乳酸菌的培養(yǎng)物進行發(fā)酵且加入至少一種酵母菌到該乳酸菌異種培養(yǎng)物中?？蛇x用的乳酸菌株包括，(例如)嗜酸乳桿菌CCRC 10695、14026、14064、14065和/或14079，戴耳布呂克保加利亞乳桿菌CCRC 10696、14007、14009、14010、14069、14071、14098和/或16054，乳酸乳桿菌CCRC 10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、14015和/或14117，開菲乳桿菌CCRC 14011和/或kefiranofaciens乳桿菌CCRC 16059?？梢赃x用的酵母菌包括，(例如)啤酒酵母菌CCRC 20577、20578、20581、21494、21550、21797、21805、22138、22234、22337、22731和/或22728，和/或開菲假絲酵母CCRC 21269、21742和/或22057。經(jīng)過發(fā)酵后，對發(fā)酵液進行滅菌(例如通過加熱或輻射，最好是加熱)，以得到無菌液。無菌液最好再經(jīng)過過濾或離心(離心法較優(yōu))，除去大多數(shù)或全部死亡微生物，以得到大豆屬發(fā)酵提取物。對濾出液進行再過濾去除部分水份以達到對發(fā)酵液的濃縮目的，由此得到的大豆發(fā)酵提取物效果更佳。除非另作說明，此應(yīng)用中有關(guān)實驗涉及到的均為經(jīng)過濃縮后的大豆發(fā)酵提取物。視需要也可以(例如)通過干凍法將大豆屬發(fā)酵提取物干燥，以得到粉末狀大豆屬發(fā)酵提取物。
制備方法為，將大豆屬有機物(去脂后)與蒸餾水按照1∶10的比例混合。將混合物加熱到100℃，并保持30分鐘，然后過濾得到大豆屬提取物。將牛肉和海藻在蒸餾水中保持沸騰狀態(tài)30分鐘，以得到肉湯培養(yǎng)基。加入鹽、糖和瓊脂以得到特殊的瓊脂培養(yǎng)基。向特制的瓊脂培養(yǎng)基中加入乳酸菌和酵母菌株。培養(yǎng)基中的乳酸菌和可選的酵母菌轉(zhuǎn)移到大豆屬提取物中，在36-43℃培養(yǎng)45-50小時。由于不同種類的微生物根據(jù)其相似的生長特性而成群生長，因此最好在培養(yǎng)前將這些微生物群分開加入到大豆屬提取物中。這些生長特性為(例如)獨特營養(yǎng)培養(yǎng)基的任何要求，微生物菌株發(fā)酵后是否能產(chǎn)生較好的氣味，該類微生物是否能在此獨特的條件下存活。這樣做的目的是減少不同種菌株間的負面作用。不同的微生物菌株群最好在培養(yǎng)前以等比例加入到大豆屬發(fā)酵提取物中，得到的提取物在40℃下培養(yǎng)45-47小時。該培養(yǎng)過程結(jié)束后，再將異種培養(yǎng)物引入大豆屬提取物中，在36-43℃下培養(yǎng)100-150小時。將最終的發(fā)酵提取物加熱滅菌過濾。在濃縮器中去除95％的水份，得到濃縮或凝聚狀態(tài)的大豆屬發(fā)酵提取物。最上層經(jīng)過瓷器過濾，分放在容器中密封保存。
本發(fā)明涉及到的是一種中草藥的發(fā)酵提取物，以中草藥代替大豆，制備方法與上述方法相似。中草藥的發(fā)酵提取物可為甘草、枸杞、薏苡(Coix lacryma-jobi Lvar.)、川谷(ma-yune Stapf)、越南槐、桂皮、黃芩、茵陳蒿、黃連、龍膽、紅碗蓮、菊花、水梔子、大麥、肉桂、食用蘿卜(Raph)、anus sativus L.、山藥、當歸、川芎、羌活、芍藥、蒜、五味子素、地黃葉粉、細柱五加、馬科動物驢、女貞、綠豆、小麥、扁豆、白術(shù)、防風(fēng)、金銀花、肉桂、姜、天麻、天門冬、環(huán)草石斛和芝麻。
抑制15-脂肪氧合酶的功用15-脂肪氧合酶是含非血基質(zhì)鐵的酶，可以催化某些多不飽和脂肪酸(如脂蛋白)的氧化。已知這種化合物可以抑制15-脂肪氧合酶的作用，有益于治療、緩和哺乳動物(包括人類)的炎癥、過敏癥狀、心血管疾病合免疫功能紊亂。
本發(fā)明的研究表明，本發(fā)明的大豆屬發(fā)酵提取物比已知的大豆發(fā)酵食品和未發(fā)酵大豆具有更強的15-脂肪氧合酶抑制能力。
用作抗氧化劑大豆屬發(fā)酵提取物具有顯著的抗氧化性能和自由基清除活性。大豆屬發(fā)酵提取物能夠清除過氧化自由基，如O2、H2O2與ROO，可作為不飽和脂肪酸與脂肪的抗氧化劑。大豆屬發(fā)酵提取物具有顯著的消除超氧(hyper oxygen)陰離子的能力，以使細胞免于氧化損害，并可將自由基的能量降低使其成為無害物質(zhì)。
用作治療心血管疾病的藥物許多研究給出了LOX-15抑制劑用于治療和預(yù)防炎癥和動脈硬化癥的例子(Cornicelli等人，USP 6,001,866；Bocan等人，Atherosclerosis，136，203-216，1998及Timo等人，Circulation，col.92(1)，1995年12月1日，pp.3297-3303)。認為大豆屬發(fā)酵提取物可用于預(yù)防和/或治療心血管疾病，如動脈硬化。
用于提高免疫機能體外研究表明，本發(fā)明中的大豆屬發(fā)酵提取物可以提高免疫機能。分別在添加和不添加分裂素(包括脂多糖、雙環(huán)醇對刀豆蛋白A和植物血球凝集素)的情況下，考察大豆屬發(fā)酵提取物調(diào)節(jié)動物體(Bala/c小鼠)免疫機能的作用。脾細胞增生化驗表明大豆屬發(fā)酵提取物與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中的T&B細胞交互作用有關(guān)。大豆屬發(fā)酵提取物還與消炎作用有關(guān)。大豆屬發(fā)酵提取物能夠提高巨噬細胞71％的噬菌能力。小鼠的體外實驗也得到類似的結(jié)果。實驗還證明，大豆屬發(fā)酵提取物的抗腫瘤作用是通過調(diào)控細胞分裂素而實現(xiàn)的。受到大豆屬發(fā)酵提取物調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基刺激了45-56％的周邊血液單核細胞，白介素-1b，白介素-b和腫瘤壞死因子-a的水平比未處理的對照實驗高很多。由于未處理的巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生少量或不產(chǎn)生細胞分裂素，而且正常的單核細胞不能抑制白細胞的成長，抗腫瘤的作用可能是因為細胞分裂素的增加而實現(xiàn)的。
大豆屬發(fā)酵提取物可用于哮喘病兒童的治療。例如，研究結(jié)果顯示，一群患哮喘病的兒童每天服用3ml大豆發(fā)酵提取物，持續(xù)4個月，體重會有明顯上升。血液實驗表明，服用大豆屬發(fā)酵提取物可以增加這些哮喘兒童的RBC和Hb水平。
用作抗炎藥本發(fā)明還可用于治療和/或預(yù)防炎癥，患者需要時可服用有效劑量的大豆屬發(fā)酵提取物。服用的大豆屬發(fā)酵提取物是大豆屬提取溶液接種至少一種乳酸菌和至少一種酵母菌發(fā)酵制備得到的。
已證明，用藥量為10ml/kg時，大豆屬發(fā)酵提取物可減緩由角叉菜膠引起的老鼠后爪瘤病患；輔助關(guān)節(jié)炎實驗表明，其對急性和慢性關(guān)節(jié)炎具有消炎作用。
用于預(yù)防或治療感染實驗證明，大豆屬發(fā)酵提取物在體內(nèi)和體外都具有抗菌能力。它可以抑制幽門螺桿菌、耐氨卡青霉素和甲氧西林金黃色葡萄球菌、沙門氏菌屬、枯草桿菌，大腸桿菌，變形桿菌以及耐萬古霉素腸球菌的成長。耐萬古霉素腸球菌由鳥腸球菌、酪黃腸球、堅忍腸球菌、糞腸球菌和屎腸球菌中選擇效果較好。耐萬古霉素腸球菌由鳥腸球菌、酪黃腸球菌、堅忍腸球菌和糞腸球菌中選擇效果更好。耐萬古霉素腸球菌由堅忍腸球菌、糞腸球菌和屎腸球菌中選擇效果會更好。耐萬古霉素腸球菌由糞腸球菌和屎腸球菌中選擇效果會更好。耐萬古霉素腸球菌為糞腸球菌時效果最好。
大豆屬發(fā)酵提取物的有效濃度通常為1-10％。一些病人因并發(fā)的腫瘤化療而極有可能染上嗜中性白血球減少癥，大豆屬發(fā)酵提取物的有選擇的抗菌凈化作用可預(yù)防這些病人發(fā)生細菌感染，這一點已經(jīng)在100個病人中得到驗證。耐萬古霉素腸球菌由鳥腸球菌、酪黃腸球、堅忍腸球菌、糞腸球菌和屎腸球菌中選擇效果較好。耐萬古霉素腸球菌由鳥腸球菌、酪黃腸球菌、堅忍腸球菌和糞腸球菌中選擇效果更好。耐萬古霉素腸球菌由堅忍腸球菌、糞腸球菌和屎腸球菌中選擇效果會更好。耐萬古霉素腸球菌由糞腸球菌和屎腸球菌中選擇效果會更好。耐萬古霉素腸球菌為糞腸球菌效果最好。
大豆屬發(fā)酵提取物的給藥本發(fā)明中，大豆屬發(fā)酵提取物可以單獨給藥，也可以用包含大豆屬發(fā)酵提取物與醫(yī)藥可接受載體、稀釋劑和/或賦形劑的組合物的形式給藥。大豆屬發(fā)酵提取物最好為大豆發(fā)酵提取物或黑豆發(fā)酵提取物。大豆屬發(fā)酵提取物的用藥劑量可為0.001-40ml/Kg體重，每次用藥劑量不要超過2000ml每人。大豆屬發(fā)酵提取物的適宜用量為0.01-20ml/Kg體重，更佳用量為0.1-5ml/Kg體重。這些劑量是以濃縮后的發(fā)酵提取物為準?？梢該?jù)此計算未經(jīng)濃縮的或干燥粉末狀大豆屬發(fā)酵提取物的適當用量。具體劑量可根據(jù)患者的健康狀況和預(yù)防治療的疾病類型調(diào)整。
對嚙齒動物進行六個月長期的慢性毒性研究表明，每天服用1-10ml大豆屬發(fā)酵提取物是絕對安全的。對服用劑量分別為10ml/Kg和1ml/Kg的小鼠進行28天亞急性口服毒性試驗，并沒有顯示出任何明顯差異和異常癥狀。在對嚙齒動物急性口服毒性試驗中，兩組實驗動物用藥劑量分別為20ml/Kg和1ml/Kg，沒有觀察到總體中毒或致命現(xiàn)象。艾姆斯氏試驗表明，大豆屬發(fā)酵提取物為非誘導(dǎo)物質(zhì)，體外不會造成哺乳動物染色體損害，ICR小鼠試驗中也沒有造成骨髓細胞產(chǎn)生微核。
懷孕婦女服用大豆屬發(fā)酵提取物，大豆屬發(fā)酵提取物的用量在懷孕期間可以增加，直到每日用量達到12ml。可以在懷孕早期和中期服用，也可以在分娩時期服用。結(jié)果表明，服用大豆屬發(fā)酵提取物能夠改善懷孕期間通常出現(xiàn)的癥狀，如便秘、惡心、嘔吐和腸胃不適。此外，服用大豆屬發(fā)酵提取物還能減少懷孕和分娩期間異常情況的發(fā)生。大豆屬發(fā)酵提取物不僅有利于改善懷孕期間的健康狀況，而且作為長期日常飲食的補充服用也不會產(chǎn)生負面作用。讓新生兒和嬰兒每日服用大豆屬發(fā)酵提取物會有助于其增加體重。同樣，如果長期服用大豆屬發(fā)酵提取物的哺乳母親，其嬰兒的體重也會增長較快。
做手術(shù)的婦女從入院開始到手術(shù)當天和術(shù)后幾天，堅持每天服用1ml大豆屬發(fā)酵提取物和其他種類的治療產(chǎn)品，結(jié)果表明大豆屬發(fā)酵提取物能夠提高術(shù)后的造血組織和肝的功能。
參考如下實例以描述本發(fā)明。
實施例1LOX-15是花生四烯酸(AA)代謝的主要代謝產(chǎn)物。AA的一個代謝途徑涉及到15-脂肪氧合酶，即LOX-15，生成了HETE(氫過氧化物)。據(jù)報道，HETE對癌細胞轉(zhuǎn)移起重要作用。HEPE能誘發(fā)蛋白質(zhì)激酶C活性，導(dǎo)致癌細胞轉(zhuǎn)移。HEPE還是造成有絲分裂的一個因素，能引發(fā)血管產(chǎn)生癌變。從兔子紅血球中分離出LOX-15。分別在大豆發(fā)酵提取物存在和不存在的情況下，采用亞油酸作為LOX-15的基質(zhì)。產(chǎn)生的HETE量用分光光度法分析。數(shù)據(jù)表明，大豆發(fā)酵提取物對LOX-15具有抑制作用(見圖1)。結(jié)果顯示，大豆發(fā)酵提取物能抑制血管癌變和癌細胞轉(zhuǎn)移，并能誘發(fā)癌細胞死亡。
有關(guān)LOX-15的進一步抑制實驗是根據(jù)上述的方法完成的?？疾炝宋窗l(fā)酵大豆和發(fā)酵大豆對LOX-15的抑制效果的差異。結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵的大豆的抑制效果是未發(fā)酵大豆的四倍。
實施例2在兔子紅血球中測試黑豆發(fā)酵提取物對LOX-15的抑制作用。測試方法采用Analytical Biochemistry 1992，201，375-380中描述的方法。在4℃下使用1％、0.5％、0.1％、0.05％與0.01％(v/v)的黑豆提取物培養(yǎng)兔子紅血球10分鐘。培養(yǎng)用的緩沖溶液為0.05M磷酸鉀緩沖液(pH5.9)。用分光光度計測量得到的13-HPODE的量。
圖2中給出了黑豆的濃度和其對LOX-15的抑制率之間的關(guān)系。
有關(guān)LOX-15的進一步抑制實驗是根據(jù)上述的方法完成的。考察了未發(fā)酵黑豆和發(fā)酵黑豆對LOX-15的抑制效果的差異。未發(fā)酵黑豆的LOX-15抑制率列于表1表1

經(jīng)過發(fā)酵的黑豆提取物對LOX-15的抑制率在表2中列出表2

上表的結(jié)果表明，黑豆發(fā)酵提取物對于抑制LOX-15具有意想不到的出眾效果。
實施例3大豆發(fā)酵提取物可作為抗氧化劑使用并可去除自由基。利用先前發(fā)表的幾個模型來研究大豆發(fā)酵提取物的抗氧化能力，使用維生素C和水溶性維他命E作為正參照。采用以下方法確定抗氧化能力(1)NBT法(2)H2O2還原法(3)DPPH還原法(4)TRAP還原法(5)共軛二烯烴法(6)脂過氧化法(7)在活性氧存在下使用化學(xué)熒光法(見圖3，4和5)。所有結(jié)果顯示，大豆發(fā)酵提取物與維生素C和水溶性維他命E相比對不飽和脂肪酸和過氧化反應(yīng)具有最高的抗氧化能力。
在活性氧的存在下，化學(xué)發(fā)光受體的Okubo試驗系統(tǒng)中的試驗表明，大豆發(fā)酵提取物既具有抗氧化能力又可作為自由基受體。試驗分別在有、無乙醛加入的情況下，測量雙氧水的化學(xué)熒光強度。已知的抗氧化劑，如五倍子酸(見圖3(b))、EGC、茶和維生素C(見圖4(a)-(c))或大豆發(fā)酵提取物(見圖5)，分別在200秒時刻加入。有關(guān)數(shù)據(jù)分別在圖3-5給出。圖3(b)表明，在200秒時刻當五倍子酸加入到雙氧水和乙醛混合液中時，化學(xué)熒光強度增加。圖4表明，在乙醛存在的情況下，在200秒時刻加入EGC，茶或維生素C，化學(xué)熒光強度增加。然而，在無乙醛存在下，當200秒時刻加入維生素C也會增加(見圖4(c))，表明維生素C的抗氧化機理可能與EGC、茶不同。圖5表明，在200秒時刻加入大豆發(fā)酵提取物后，化學(xué)熒光強度增加，證明大豆發(fā)酵提取物是一種強大的抗氧化劑。大豆發(fā)酵提取物的抗氧化能力意味著大豆發(fā)酵提取物可用于去除自由基。大豆發(fā)酵提取物具有抗氧化性和清除自由基的能力使其可以用于改善個人總體健康狀況，或促進急需提高健康水平的一類人的身體素質(zhì)，因為我們已知氧化壓力，如活性氧和脂過氧化物的過量存在對人體有害。
實施例4采用體外實驗方法證明大豆發(fā)酵提取物具有抗微生物能力。第一個試驗中，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、三株幽門螺桿菌(TMU-C74，TMU-D16與TMU-E86)和耐萬古霉素腸球菌，并轉(zhuǎn)移到Mueller Hinton瓊脂板或巧克力瓊脂板上。將大豆發(fā)酵提取物置于瓊脂板上的紙盤中，在37℃下培養(yǎng)，測量抑制區(qū)域的大小。數(shù)據(jù)列于下表3中。
表3微生物大豆發(fā)酵提取物抑制區(qū)域(mm)沙門氏菌 未稀釋11枯草芽孢桿菌 未稀釋14幽門螺桿菌TMU-C74 未稀釋15幽門螺桿菌TMU-D16 未稀釋16幽門螺桿菌TMU-E86 未稀釋15耐萬古霉素腸球菌 未稀釋25耐萬古霉素腸球菌 稀釋50％ 15另一試驗中，分別測定了大豆發(fā)酵提取物對沙門氏菌(ATCC14028)、枯草芽孢桿菌(CRCC 10447)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和耐萬古霉素腸球菌的最小抑制濃度(MIC)。這些菌體的懸浮液濃度調(diào)整到3×105CFU/ml。將調(diào)整后的菌體懸浮液與濃度為10％、5％、2.5％、1.25％、0.65％或0.32％的大豆發(fā)酵提取物(濃度可以相同也可以不同)加入到96孔菌盤中。菌盤在37℃下培養(yǎng)15小時。測定的MIC列在下表4中表4微生物大豆發(fā)酵提取物的MIC沙門氏菌 2.5％枯草芽孢桿菌 2.5％金黃色葡萄球菌 2.5％耐萬古霉素腸球菌 1.25％黑豆發(fā)酵提取物也用來測試抗菌能力。得到的MIC列于下表5
表5微生物黑豆發(fā)酵提取物的MIC綠膿假單胞菌 3.125％KP(克雷白氏肺炎桿菌) 3.125％金黃色葡萄球菌 1.563％實施例5大豆發(fā)酵提取物對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的研究。
(A)體外研究脾細胞增生分析(MTT法)由老鼠體內(nèi)分離出脾細胞置于培養(yǎng)瓶中，細胞濃度為2×106細胞/ml，培養(yǎng)培養(yǎng)基為RPMI，使用或不使用以下幾種分裂素中的一種，即脂多糖(LPS)，Concavalin A(Con A)和植物血球凝集素(PHA)。脾細胞培養(yǎng)物經(jīng)過一夜的培養(yǎng)后被用于MTT測試。
次優(yōu)濃度為5ug/ml的LPS與濃度為1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的大豆發(fā)酵提取物，對脾細胞(尤其是B細胞)的增生沒有影響。5ug/ml的PHA加上0.05％的大豆發(fā)酵提取物可以使脾細胞數(shù)增加，尤其是T細胞，是單獨使用PHA所獲得的細胞數(shù)的2.32倍。由此可知，在對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中，大豆發(fā)酵提取物影響T和B細胞的交互作用。5ug/ml的Con A與0.05％的大豆發(fā)酵提取物得到的脾細胞數(shù)比僅用Con A的細胞數(shù)量少20％?？梢姡蠖拱l(fā)酵提取物能起到消炎作用。
巨噬細胞活性分析給Balb/c小鼠注射thiogllate。注射后3-4天，從小鼠的腹膜腔分離出巨噬細胞，然后在添加和不添加大豆發(fā)酵提取物的情況下培養(yǎng)30分鐘，保持溫度37℃。大腸桿菌與熒光探針配合加入到巨噬細胞懸浮液中，在37℃下培養(yǎng)2小時。通過測量流動血細胞數(shù)量對噬菌作用進行檢測。數(shù)據(jù)表明，加入0.05％的大豆發(fā)酵提取物比未經(jīng)大豆發(fā)酵提取物處理的巨噬細胞的噬菌能力高71％。
(B)體內(nèi)研究分別給每只ICR白化公鼠進行腹膜內(nèi)注射賦形劑、0.8毫升1％的大豆發(fā)酵提取物、0.8毫升0.1％的大豆發(fā)酵提取物、30mg/kg的左咪唑或100mg/kg的azimexone。在腹膜注射1小時后，給每只小鼠靜脈注射1.5-2×107CFU的白色念珠菌(ATCC 10231)。每天確定一次(連續(xù)10天)小鼠的死亡率(見表6)。
如表6所示，大豆發(fā)酵提取物降低了白色念珠菌對小鼠的致死率。大豆發(fā)酵提取物降低死亡率的效果要優(yōu)于左旋咪唑。
在其靜脈注射白色念珠菌5、3及1天前用環(huán)磷酰胺，按照30mg/kg的用量對ICR白化公鼠進行預(yù)處理。在靜脈注射白色念珠菌6、4及2天前，分別用賦形劑、0.1％的大豆發(fā)酵提取物、1％的大豆發(fā)酵提取物或100mg/kg的用量的azimexone進行處理。連續(xù)10天確定小鼠的死亡率(見表7)。如表7所示，經(jīng)過環(huán)磷酰胺預(yù)處理后，大豆發(fā)酵提取物能減小白色念珠菌對小鼠的致死率。大豆發(fā)酵提取物對死亡率的降低程度與azimexone的相當。
表6

每只小鼠在腹膜注射試驗樣品1小時后靜脈注射1.5～2×107CFU的白色念珠菌(ATCC 10231)。利用Fisher的準確性試驗確定統(tǒng)計顯著性*P＜0.05，**P＜0.01注意每只小鼠0.8ml濃度為1％的大豆發(fā)酵提取物相當于0.4ml/kg原始大豆發(fā)酵提取物(100％)每只小鼠0.8ml濃度為0.1％的大豆發(fā)酵提取物相當于0.04ml/kg原始大豆發(fā)酵提取物(100％)表7


a賦形劑PBS(pH＝7.4)未經(jīng)環(huán)磷酰胺預(yù)處理bCY在感染前5、3、1天，按照30mg/kg，的劑量，用環(huán)磷酰胺預(yù)處理。感染前6、4、2天，注射0.8ml大豆發(fā)酵提取物或azimexoue。
每只小鼠在第零天靜脈注射6～8×106CFU的白色念珠菌(ATCC 10231)。
利用Fisher的準確性試驗確定統(tǒng)計顯著性*P＜0.05，**P＜0.01
實施例6測試了大豆發(fā)酵提取物對載脂蛋白E缺乏小鼠(具有與人類相似的高血膽固醇，動脈硬化損傷)的影響，以考察其治療心血管疾病的功效。給載脂蛋白E缺乏小鼠服用10μl/g大豆發(fā)酵提取產(chǎn)品(濃度為15％)3個月，然后測量血漿膽固醇水平和動脈硬化程度。試驗發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的大豆發(fā)酵提取產(chǎn)品治療后，血漿膽固醇水平?jīng)]有明顯變化，但服用本發(fā)明的大豆發(fā)酵提取產(chǎn)品的小鼠的動脈硬化損傷與對照試驗相比有了明顯改善(見圖6、7和8)。由試驗結(jié)果可知，本發(fā)明的大豆發(fā)酵提取物對心血管疾病，如動脈硬化有治療效果，是因為其對15-脂肪氧合酶的抑制作用，而不是降低血漿膽固醇。
參考文獻Adlercreuz，H.et al.，Evaluation nutrition，intestinal microfloraand prevention of cancera hypothesis，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，217241-246(1998).
Breimer LH.Ionizing radiation-induced mutagenesis，Br JCancer，576-18(1998).
Briehl，M.M.et al.，Modulation of the antioxidant defense as afactor in apoptosis，Cell Death Differ.，363-70(1996)Chemoprevention Working Group to the American Association forCancer Research，Cancer Res.594743-4758(1999).
Cohen，L.A.et al.，Effect of intact and isoflavone-depletedsoybean protein on NMU-induced rat mammary tumorigenesis，Carcinogenesis，2929-935(2000).
Dwyer，J.T.et al.，Tofu and soybean drinks containsphytoestrogenes，J.Am.Diet Assoc.，94739-743(1994).
Ghibelli，L.et al.，Rescue of cells from apoptosis by inhibition ofactive GSH extrusion，F(xiàn)ASEB J.，12479-486(1998).
Greenwald，P.et al.，Chemoprevention，CA-Cancer J.Clin.，4531-49(1995).
Hong，W.K.et al.，Recent advances in chemoprevention ofcancers，Science，2781073-1077(1993).
Hutchins，A.M.et al.，Urinary isoflavoneoid phytoestrogen andlignan excretion after consumption of fermented and unfermentedsoybean products，J.Am.Diet Assoc.，95545-551(1995).
Ikeda，Y.et al.，The molecular basis of brain injury and brainedemathe role of oxygen free radicals，Neurosurgery，271-11(1990).
Keisari，Y.et al.，A simple colorimetric method for themeasurement of hydrogen peroxide produced by cells in culture，J.Immunol Methods.，38161-170(1980).
Kelloff，G.J.，Approaches to the development and marketingapproval of drugs that prevent cancer，Cancer Epidermiol.BiomarkersPre.，41-10(1995).
Kontos HA et al.，Oxygen radicals in brain injury，CNS Trauma，3257-63(1986).
Messina，M.et al.，Soybean intake and cancer riska review of thein vitro and in vivo data，Nutr.Cancer，21113-131(1994).
Nout，M.J.R.et al.，Recent development in temphe research，J.Appl.Bacteriol.，69609-633(1990).
Plamer，H.J.et al.，Reactive oxygen species and antioxidants insignal transduction and gene expression，Nutr.Rev，55353-361(1997).
Robak J.et al.，F(xiàn)lavonoids are scavengers of superoxide anions，Biochemical Pharmacology，37(5)837-41(1988).
Shao，Z.M.et al.，Genistein exerts mutiple suppressive effects onhuman breast carcinoma cells，Cancer Res.，584851-4857(1998).
Steinberg D.et al，Beyond cholesterolmodifications oflow-density lipoprotein that increase its atherogenicity，N Engl J Med，320915-24(1989).
Toshiki，Y.et al.，Mechanism of catechin chemiluminescence inthe presence of active oxygen，J.Biolumin.Chemilumin.，11131-136(1996).
Wang，H.et al.，Isoflavone content of commercial soys foods，J.Agric.Food Chem.，421666-1673(1994).
權(quán)利要求
1.一種關(guān)于大豆屬發(fā)酵提取物在生產(chǎn)一種用于抑制15-脂肪氧合酶的組合物中的應(yīng)用，其中大豆屬發(fā)酵提取物是大豆屬提取物在水溶液中，與至少一種乳酸菌和至少一種酵母發(fā)酵制得的，其對15-脂肪氧合酶的抑制作用可用來治療或減少心血管疾病帶來的危險性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該大豆屬植物為黑豆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該乳酸菌為乳酸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該酵母菌為酵母桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該心血管疾病為動脈粥樣硬化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該組合物為醫(yī)藥組合物或食品組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及大豆屬發(fā)酵提取物在抑制15－脂肪氧合酶中的應(yīng)用，此處的大豆屬發(fā)酵提取物是大豆屬提取物在水溶液中，與至少一種乳酸菌和至少一種酵母發(fā)酵制得的。具體的說，大豆屬發(fā)酵提取物可用于預(yù)防和/或治療由15－脂肪氧合酶而引發(fā)的心血管疾病，免疫功能紊亂(如，哮喘和炎癥)并有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。本發(fā)明還涉及大豆屬發(fā)酵提取物在預(yù)防和/或治療微生物感染中的應(yīng)用。
文檔編號A61K35/66GK1589869SQ0315799
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月4日
發(fā)明者路孔明 申請人:中天生物科技股份有限公司