專利名稱：O型口蹄疫病毒多基因復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用基因克隆技術(shù)制備一種畜用口蹄疫病毒活載體免疫疫苗及其制備方法，更為確切講是一種O型口蹄疫病毒免疫制劑及制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，以下簡(jiǎn)稱為FMDV)是引起偶蹄動(dòng)物口蹄疫的病原，該病是一種高度接觸性傳染病，可引起世界性大流行。對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)及其產(chǎn)品國際貿(mào)易帶來嚴(yán)重影響，因而世界各國都很重視對(duì)該病的預(yù)防和控制。
口蹄疫的危害巨大，影響深遠(yuǎn)，家畜及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易也因口蹄疫而分為兩大陣營，有疫國家和無疫國家。有疫國家繼續(xù)蒙受出口限制所帶來的巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國每年要為口蹄疫的防制耗費(fèi)數(shù)十億元，所造成的直接和間接損失更是不可估量，有必要加大防治技術(shù)的研究力度。
在疫苗研究方面，無疫國家積極研究新型疫苗，以降低應(yīng)用傳統(tǒng)疫苗和疫病傳入的風(fēng)險(xiǎn)。有疫國家也在積極開展口蹄疫新型疫苗的研究，以便在未來口蹄疫逐步控制和消滅之后，作為一種替代的、安全可靠的疫苗，用于口蹄疫的預(yù)防。
傳統(tǒng)的滅活疫苗以細(xì)胞培養(yǎng)的全病毒經(jīng)提純滅活后作抗原，因而具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物后產(chǎn)生良好的體液免疫，并伴隨有細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有良好的保護(hù)作用。缺點(diǎn)是，滅活疫苗的熱穩(wěn)定性差，要求低溫保存，免疫持續(xù)期短，抗病毒譜有限，有造成持續(xù)感染的危險(xiǎn)性，不能區(qū)分注苗動(dòng)物和自然感染動(dòng)物，同時(shí)存在病毒滅活不徹底而散毒的可能性。鑒于滅活疫苗存在的問題，口蹄疫新型疫苗便成了研究焦點(diǎn)。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)01111121.6公開了用病毒RNA反轉(zhuǎn)錄形成VP1蛋白的全DNA系列，再將VP1基因插入植物反應(yīng)器中，最終形成疫苗。這種通過植物反應(yīng)器來表達(dá)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的主要免疫區(qū)段，對(duì)宿主動(dòng)物具有一定的免疫作用，但這種亞單位疫苗所能展示的抗原表位很有限，而且與自然病毒衣殼的抗原結(jié)構(gòu)差異較大，不足以刺激動(dòng)物體產(chǎn)生完全的攻毒保護(hù)作用。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)0210370109公開了一種采用口蹄疫病毒中具有抗原性肽段的DNA與β-半乳糖苷酶基因連接，構(gòu)成融合基因，表達(dá)融合乳糖蛋白，純化融合蛋白，用其制備多肽疫苗?？谔阋叩亩嚯囊呙缗c病毒亞單位疫苗均具有一個(gè)缺點(diǎn)是所能展示的抗原表位有限，而且均為線性的抗原表位，缺少構(gòu)象表位。而且這類疫苗所刺激產(chǎn)生免疫的反應(yīng)機(jī)制與活病毒載體疫苗有差異?；钶d體疫苗通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病毒抗原，作為一種內(nèi)源性抗原來刺激機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可以產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)作用。
在基因克隆技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)至今尚無O型口蹄疫病毒重組腺病毒活載體疫苗研制的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種用O型口蹄疫病毒為目的基因來源，構(gòu)建成表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白的新型活載體疫苗，以及提供該疫苗的制備方法。
本發(fā)明的疫苗是攜帶有可以表達(dá)口蹄疫病毒全衣殼蛋白的O型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因P1和2A、3C蛋白酶基因，以及真核表達(dá)元件形成的目的基因表達(dá)盒。
在本發(fā)明的實(shí)施例中其真核表達(dá)元件為CMV啟動(dòng)子和SV40的poly(A)序列。
在本發(fā)明的實(shí)施例中所用O型口蹄疫病毒的目的基因來自于China99毒株，該毒株屬O型口蹄疫病毒中的泛亞病毒群，1999～2001世界口蹄疫大流行就是由該群病毒的傳播引起的，該毒株的致病性和免疫原性都很強(qiáng)，是傳統(tǒng)滅活疫苗的制苗毒株，采用該群病毒的基因序列來構(gòu)建活載體疫苗，在抗原性方面具有較廣泛的代表性。
本發(fā)明的制備方法是(1)采用引物序列為

(2)以O(shè)型口蹄疫病毒基因組重組陽性質(zhì)粒為目的模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增得到P1-2A和3C蛋白酶基因，
(3)將得到的P1-2A和3C蛋白酶基因克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成目的基因表達(dá)盒；將此重組穿梭質(zhì)粒線化后，轉(zhuǎn)化帶有腺病毒骨架載體的感受態(tài)菌(BJ5183)，得到帶有目的基因表達(dá)盒的重組腺病毒質(zhì)粒。
(4)將重組腺病毒質(zhì)粒酶切線化后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)，得到初代重組腺病毒，(5)初代重組腺病毒在人胚胎腎細(xì)胞上傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，制備并純化得產(chǎn)物。
在實(shí)際的工業(yè)化制備過程中，初代重組腺病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)可以采用轉(zhuǎn)瓶和微載體懸浮培養(yǎng)法來生產(chǎn)病毒，并采用超濾濃縮純化病毒。
本發(fā)明采用腺病毒作為外源基因的載體。腺病毒種類很多，是一種無囊膜的雙股DNA病毒，基因組大小約為30-40kb。由于腺病毒比較安全，經(jīng)腺病毒感染后的臨床癥狀也比較輕微。以腺病毒為基因治療載體已經(jīng)有多年歷史，實(shí)踐證明是無致病、致畸和致癌作用的。另一方面，腺病毒載體疫苗重組病毒載體構(gòu)建相對(duì)容易，且腺病毒的宿主細(xì)胞范圍較廣，可以感染很多類型的分裂或靜止期細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞的效率很高，在細(xì)胞培養(yǎng)中可以達(dá)到很高的滴度，因此提供了多種給藥的途徑，如通過肌肉、鼻腔或口服進(jìn)行免疫。
本發(fā)明的疫苗，采用口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白P1和非結(jié)構(gòu)蛋白2A和3C編碼區(qū)的重組復(fù)制缺陷型重組腺病毒，這種重組腺病毒免疫豬后可以有效的表達(dá)和遞呈口蹄疫病毒的全部衣殼抗原成份，刺激豬體產(chǎn)生很好的保護(hù)性免疫反應(yīng)。其次，由于這種免疫制劑不帶有口蹄疫病毒基因組的3D和3AB區(qū)段，因而有利于鑒別口蹄疫疫苗免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物。
發(fā)明詳述與具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到China/99株O型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因，再應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)將其克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒(pShuttle-CMV)中，該穿梭質(zhì)粒帶有巨細(xì)胞瘤病毒(CMV)極早期啟動(dòng)子和猿猴病毒40(SV40)的POLY(A)尾巴，由此而形成目的基因表達(dá)盒。將重組穿梭質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Pme I酶切，然后轉(zhuǎn)化帶有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的重組大腸桿菌BJ5183感受態(tài)菌，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法，得到帶有目的基因表達(dá)盒的重組腺病毒質(zhì)粒。
將重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pac I酶切線化后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)，在HEK293細(xì)胞內(nèi)包裝產(chǎn)生高滴度的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，經(jīng)過熒光抗體、RT-PCR、PCR等試驗(yàn)證明，這種重組腺病毒可以穩(wěn)定的攜帶和表達(dá)目的基因。
在HEK293細(xì)胞上擴(kuò)大培養(yǎng)初代病毒，通過分別收集細(xì)胞和上清液的方法，大量制備和純化得到重組腺病毒。用磷酸鹽緩沖液溶解細(xì)胞沉淀，通過37℃/-70℃反復(fù)凍融3次，離心得到含病毒上清液；培養(yǎng)上清液中的病毒通過超濾膜純化濃縮，用這種方法得到的病毒滴度可達(dá)到1～5×109TCID50/ml。
其具體的做法是1.引物設(shè)計(jì)分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物用于擴(kuò)增P1-2A和3C基因，在引物的兩端分別設(shè)計(jì)了特定的酶切位點(diǎn)，用于片段的連接。引物序列如下

2.PCR擴(kuò)增以發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存的O型口蹄疫病毒China/99株基因組重組質(zhì)粒為擴(kuò)增目的基因的模板。用P1K(+)和P1B(-)為引物擴(kuò)增P1-2A片段。用3CB(+)和3CH(-)為引物擴(kuò)增3C片段。
反應(yīng)體系為100μL，即10×緩沖液10μL，dNTP(2.5mmol/L)8μL，MgCl2(25mmol/L)6μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL，滅菌水71.5μL，加Biolabs公司高保真Taq酶(10U/μL)0.5μL進(jìn)行擴(kuò)增。
離心混勻后置PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀中，94℃預(yù)變性4min，進(jìn)行如下循環(huán)94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物上樣5～8μL，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(80～100V)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小若與預(yù)期的目的片段大小一致，即可用于后續(xù)試驗(yàn)，P1-2A片段大小為2200bp，3C長(zhǎng)為750bp。
3.目的DNA片段的純化回收先將PCR產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(80V)40min左右。在長(zhǎng)波紫外光下觀察電泳情況，當(dāng)目的DNA片段與雜帶完全分開后，用清潔手術(shù)刀(經(jīng)火焰消毒)切下含有目的片段的凝膠塊(小于300μL)置于1.5mL離心管中。
后續(xù)步驟按寶生物公司DNA片段回收試劑盒說明書進(jìn)行。具體步驟為①每100mg瓊脂糖凝膠中加入300μL溶膠液，65℃充分溶膠后，加入結(jié)合緩沖液150μL，混勻。
②將融化的膠加入離心吸附柱上，3600r/min，離心30s。
③用洗滌液反復(fù)洗柱2次，最后一次離心1min。
④將吸附柱放入新的收集管中，加入30μL的洗脫緩沖液，室溫作用5min，12000r/min離心1min。
4.目的DNA片段與pGEM-T Easy載體的連接由于所使用的Taq酶在聚合過程的最后給產(chǎn)物末端加上一個(gè)腺嘌呤(A)，而pGEM-T Easy載體的兩個(gè)末端各有一個(gè)突出的胸腺嘧啶(T)，因此既可防止質(zhì)粒的自身環(huán)化，又可形成粘端連接，使得連接效率大為提高。連接體系為10μL，即2×Buffer 5μL，T4 DNA Ligase 1μL，pGEM-T Easy載體(Promega公司產(chǎn)品)(10U/μL)1μL，目的DNA 3μL，4℃連接過夜或16℃溫育4h以上。
5.感受態(tài)細(xì)胞的制備(在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行)①吸取大腸桿菌DH5α菌液(保存于-70℃冰箱)5μL至3mL的LB培養(yǎng)基中，37℃ 220r/min搖振培養(yǎng)16h左右。
②吸取500μL上述菌液至盛有50mL LB(預(yù)熱)的三角瓶中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(大約2.5～3h)。
③培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰浴10～15min。
④4℃ 4000r/min離心8min。
⑤棄上清，將離心管倒置于吸水紙上，盡量使培養(yǎng)基控干。
⑥先加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液(過濾除菌)重懸沉淀，再加入15mL預(yù)冷的CaCl2溶液，冰浴45min。
⑦4℃ 4000r/min離心8min；棄上清，倒置離心管控干殘液(2min)，用2mL預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重懸沉淀，以每管200μL分裝于1.5mLEppendorf管中，4℃過夜。
6.感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化①每管感受態(tài)細(xì)胞中加入5μL或10μL連接反應(yīng)物，用槍頭輕輕混勻，冰浴45min。
②將離心管小心的轉(zhuǎn)移至42℃水浴中熱激90s。
③迅速置于冰浴中冷卻3min，然后每管加入預(yù)熱至37℃的LB培養(yǎng)基800μL，37℃ 220r/min震蕩培養(yǎng)1h使細(xì)胞復(fù)蘇。
④4℃ 4000r/min離心2min，棄部分上清，留200μL左右重懸沉淀。
⑤在細(xì)胞懸液中加入16μL X-gal(50mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)，用槍頭輕輕混勻，涂布于預(yù)至37℃的LB瓊脂平板(含氨芐青霉素60μg/mL)上，37℃過夜培養(yǎng)。
7.挑斑在超凈工作臺(tái)里用滅菌牙簽從平板上挑取單個(gè)白色菌落，接種于含3mLLB培養(yǎng)基(含60μg/mL氨芐青霉素)的鏈瓶中，同時(shí)挑一個(gè)藍(lán)斑作陰性對(duì)照，37℃ 220r/min搖振培養(yǎng)12～16min。
8.質(zhì)粒的提取與鑒定堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA。操作步驟如下①用無菌牙簽從LB平板挑取白色單菌落，接種于3mL LB培養(yǎng)液(氨芐青霉素100μg/mL)中，37℃振搖(230r/min)12～16h。
②無菌移取1.5mL菌液置離心管中，12000r/min離心3min，棄上清，倒置控干殘留液體。
③每管加入120μL預(yù)冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0))，用渦旋器振蕩懸浮。
④加入240μL新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L NaOH稀釋)；1％SDS(用10％SDS稀釋))，溫和倒置離心管3～4次混勻，然后冰浴放置5min。
⑤加入180μL預(yù)冷的溶液III(5mol/L乙酸鉀60mL；冰乙酸11.5mL；無離子水28.5mL)，顛倒混和幾次，冰浴放置5min。
⑥12000r/min離心8min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入500μL Tris飽和酚振蕩抽提。
⑦12000r/min離心1min，轉(zhuǎn)移上層水相至一新管中，用Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)振蕩抽提。
⑧12000r/min離心1min，上層水相加入2倍體積的無水乙醇，置-20℃沉淀0.5h以上，12000r/min，離心10min。
⑨沉淀用冰冷的70％乙醇洗滌，離心除去殘余乙醇，置室溫自然干燥。
⑩用30μL含胰RNA酶(20μg/mL)的TE(pH8.0)溶解，室溫放置0.5h，電泳觀察。
陽性克隆的鑒定①電泳鑒定將所提取的質(zhì)粒進(jìn)行電泳，與陰性質(zhì)粒(藍(lán)斑)進(jìn)行比較，選出可能為陽性質(zhì)粒。
②酶切鑒定用EcoR I進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系為20μL體系，即重組質(zhì)粒15μL，10×Buffer 2μL，EcoR I 1μL，無菌水2μL，置37℃溫箱中，2h后取出，將酶切產(chǎn)物、分子量Marker進(jìn)行電泳比較。
③PCR鑒定以酶切和電泳為陽性的質(zhì)粒10倍稀釋后取1μL為模板，加入2μL 10×PCR緩沖液，2μL dNTP(2.5mmol/L)混合物，0.5μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，0.2μL上游引物(201)、0.2μL下游引物(203)，1.2μLMgCl2(25mmol/L)，補(bǔ)水至20μL，進(jìn)行PCR鑒定，用100bp DNA ladder Marker作為參照。
大量增殖鑒定正確的陽性質(zhì)粒用于以下實(shí)驗(yàn)。
9.目的片段與pShuttle-CMV穿梭質(zhì)粒的連接分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Hind III雙酶切pShuttle-CMV穿梭質(zhì)粒(Stratagene公司產(chǎn)品)，回收大片段；用Kpn I和BamH I雙酶切鑒定正確的帶P1-2A片段的重組pGEM-T質(zhì)粒，回收2200bp片段；用BamH I和Hind III雙酶切帶3C片段的重組pGEM-T質(zhì)粒，回收750bp片段。用T4 DNA連接酶(Biolabs公司產(chǎn)品)體外連接回收的三個(gè)片段，連接體系如下10×Buffer2μL，T4DNA連接酶(400U/μL)1μL，回收片段按由大到小分別為3、5、9μL，4℃連接過夜。
10.帶口蹄疫病毒P1-2AX3C目的基因的重組穿梭質(zhì)粒的鑒定取上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(方法同前)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在卡那霉素抗性的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)，篩選出卡那抗性的菌落。通過挑斑、提取質(zhì)粒、PCR和酶切鑒定(方法同前)，鑒定出陽性重組菌。由此構(gòu)建成功帶目的基因表達(dá)盒的重組穿梭質(zhì)粒，提取質(zhì)粒供以下使用。
11、細(xì)菌內(nèi)同源重組法產(chǎn)生攜帶目的基因表達(dá)盒的重組腺病毒質(zhì)粒重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pme I(Biolabs公司產(chǎn)品)線性化和堿性磷酸酶處理后與腺病毒骨架載體adenoeasy vector(Stratagene公司產(chǎn)品)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)菌(Stratagene公司產(chǎn)品)。或者先將adenoeasy vector轉(zhuǎn)化BJ5183，制備攜帶腺病毒骨架載體的Adeno-BJ5183感受態(tài)菌，再將Pme I線化的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Adeno-BJ5183感受態(tài)菌?？强剐院Y選，質(zhì)粒電泳和Pac I酶切鑒定出重組腺病毒質(zhì)粒，將鑒定陽性的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL-10感受態(tài)菌(Stratagene公司產(chǎn)品)，以大量增殖重組質(zhì)粒，采用β-ME試劑(Stratagene產(chǎn)品)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，按說明書進(jìn)行。陽性重組腺病毒質(zhì)粒命名為pAdcmv-p12×3c，并送寶生物(大連)公司進(jìn)行測(cè)序確證。
測(cè)定的序列如下ATGGGCAACACTGGAAGCATTATCAACAATTCCTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAACTTGGTGATAACGCTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCCACCCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCTGGCCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTCGCCGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCACTACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTGGAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGACCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAGGGTTGTGCAGGCAGAGCGGTTCTTCAAAACCCACTTGTTCGACTGGGTCACCGGTGACCCGTTCGGACGGTGCTACCTGCTGGAACTCCCAACTGACCACAAAGGTGTCTACGGCAGCCTGACTGACTCTTATGCTTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACTGCAGTGGGAAATCAGTTCAACGGAGGATGTCTGTTGGTGGCCATGGTGCCAGAACTTTGCTCTATTGACAAGAGAGAGCTGTACCAGCTCACGCTCTTTCCCCACCAGTTCATCAACCCCCGGACGAACATGACGGCGCACATCACTGTGCCCTTTGTTGGTGTCAACCGCTACGACCAGTACAAGGTACACAAACCTTGGACCCTCGTGGTTATGGTTGTGGCCCCGCTGACTGTCAACACCGAAGGTGCCCCACAGATCAAGGTCTATGCCAACATCGCCCCTACCAACGTGCACGTTGCGGGTGAGTTCCCTTCTAAGGAAGGGATCTTCCCCGTGGCATGTAGCGACGGTTACGGTGGTCTGGTGACCACTGACCCAAAGACGGCTGACCCCGCCTACGGGAAAGTGTTCAATCCACCTCGCAACATGTTGCCGGGGCGGTTCACCAACTTCCTTGATGTGGCTGAGGCGTGCCCTACGTTTCTGCACTTTGAGGGTGACGTGCCGTACGTGACCACAAAGACGGACTCAGACAGGGTGCTCGCCCAGTTTGACTTGTCTCTGGCAGCAAAGCACATGTCAAACACCTTCCTGGCAGGTCTCGCCCAGT
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AAAGCCGCCACCAAGGCGGGTTACTGTGGAGGAGCCGTTCTTGCAAAGGACGGAGCCGAGACTTTCATCGTCGGCACTCACTCCGCAGGCGGCAATGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTTTCCAGGTCTATGCTGCTTAAAATGAAGGCGCACATCGATCCCGAACCACACCACGAGTAG12、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞產(chǎn)生重組腺病毒用小量質(zhì)粒提取試劑盒(寶生物產(chǎn)品)提取重組腺病毒質(zhì)粒，取20μg用PacI酶切線化，用70％乙醇過夜沉淀酶切產(chǎn)物，12000r/min，離心10min，無菌操作，去上清，吹干DNA，再用20μL滅菌超純水溶解沉淀，備用。用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 2000，Invitrogen產(chǎn)品)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參考轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。
具體如下轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將HEK293細(xì)胞分到60mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)到約80％滿時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用無血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen產(chǎn)品)稀釋DNA和脂質(zhì)體，將2μg的DNA和10μL的脂質(zhì)體分別稀釋到50μL的OPTI-MEM中，將二者混勻后，室溫作用20min，然后緩慢滴加到生長(zhǎng)24小時(shí)的細(xì)胞單層上，置37℃含5％二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8小時(shí)。之后，加等量含20％胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況。轉(zhuǎn)染后7～10d，離心收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用PBS重懸，37℃/-70℃反復(fù)凍融4次，離心，取上清再感染長(zhǎng)成單層的293細(xì)胞。感染后3～5d收集細(xì)胞再傳，直到出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定和表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。
重組病毒的鑒定(1)間接熒光抗體試驗(yàn)檢測(cè)目的基因的表達(dá)取轉(zhuǎn)染后24h長(zhǎng)滿細(xì)胞的蓋玻片，用丙酮4℃固定30min，置室溫干燥后用PBS洗；加兔抗FMDV陽性血清，置濕盒內(nèi)37℃作用1h；用含0.05％吐溫-20的PBST洗4次，然后用PBS洗1次，每次10min；加熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG，置濕盒內(nèi)37℃作用1h；同上洗滌后，甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果，轉(zhuǎn)染后24h取細(xì)胞飛片進(jìn)行間接熒光抗體染色，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可見有抗原表達(dá)。
(2)RT-PCR檢測(cè)重組病毒的產(chǎn)生取第4代病毒感染后24h細(xì)胞，用QIAGEN RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果RT-PCR擴(kuò)出了預(yù)期大小的片段。說明目的基因在細(xì)胞內(nèi)有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
(3)重組病毒穩(wěn)定性和毒價(jià)測(cè)定收取4、6、8和10代病毒上清20μL，加蛋白酶K于56℃作用1h后取2μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)重組病毒的穩(wěn)定性。取第8代病毒液10倍稀釋至10-8，取10-4～10-8稀釋病毒液各1mL至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行病毒含量進(jìn)行測(cè)定，按常規(guī)方法進(jìn)行。結(jié)果取4、6、8和10代病毒DNA為模板PCR擴(kuò)增目的基因均擴(kuò)出預(yù)期大小的片段。說明重組病毒在10代以內(nèi)是穩(wěn)定的。取第8代病毒進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定，病毒滴度為109PFU/mL。
(4)重組腺病毒的電鏡觀察第8代病毒感染后24h，細(xì)胞病變完全，離心收集細(xì)胞，加PBS重懸細(xì)胞，-70℃/37℃反復(fù)凍融3次，離心取上清20μL，磷鎢酸負(fù)染色，置電子顯微鏡下觀察病毒形態(tài)。結(jié)果電鏡觀察重組病毒直徑約為80nm，呈正六邊形，大小形狀與腺病毒相似。說明所產(chǎn)生的細(xì)胞病變是由重組腺病毒所引起。
13、重組腺病毒的大量培養(yǎng)和純化工藝將前述得所病毒通過逐級(jí)放大，得到產(chǎn)物。可以將HEK293細(xì)胞適應(yīng)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，以每分鐘8-9轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速，細(xì)胞貼壁性能良好，細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)較快。一般在分后2天內(nèi)長(zhǎng)滿，以20MOI(感染指數(shù)，即感染每個(gè)細(xì)胞的病毒單位)的病毒量接毒，待病變完全(細(xì)胞脫落)后收毒。5000r/min離心20min收集病變細(xì)胞和上清，細(xì)胞沉淀用PBS緩沖液重懸，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心10min，收集上清即為病毒液，作進(jìn)一步純化；細(xì)胞沉淀用初次離心的上清重懸，置4℃過夜浸毒，再離心，棄細(xì)胞沉淀，病毒上清留作進(jìn)一步純化。將收集的病毒上清液通過300K的PELLICON超濾膜(Millipore公司產(chǎn)品)進(jìn)一步濃縮和純化病毒，去除一些小分子蛋白和更換緩沖液。通過濃縮和純化的病毒可以用于疫苗制備。純化病毒分裝后用于動(dòng)物免疫。
工業(yè)化生產(chǎn)本疫苗時(shí)，需要使用轉(zhuǎn)瓶和微載體懸浮培養(yǎng)法來生產(chǎn)病毒。病毒的純化可采用超濾濃縮純化。
免疫保護(hù)試驗(yàn)(1)豚鼠免疫實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物為體重300～400g的豚鼠，共24只，平均分為7組。一組為293細(xì)胞對(duì)照，每只注射0.5mL 293細(xì)胞懸液；二組為Ad5野生型腺病毒免疫組，每只注射0.5mL Ad5野生型腺病毒(約為1～5×108個(gè)TCID50)；三組和四組分別為adeno-p12a×3c 1×108和2×108個(gè)TCID50病毒量免疫組；免疫途徑均為后肢肌肉注射。
于免疫后第25天，用同型豚鼠適應(yīng)毒攻擊，每只10,000豚鼠半數(shù)感染劑量(GID50)，后肢腳掌部皮下和皮內(nèi)分別注射0.1mL，只注射一只腳掌。攻毒后每日兩次，觀察豚鼠發(fā)病情況，并記錄。判定標(biāo)準(zhǔn)原注射部位出現(xiàn)水泡，而其余三足末出現(xiàn)繼發(fā)性水泡，判為100％保護(hù)。
結(jié)果如下攻毒48小時(shí)后，1和2組豚鼠開始發(fā)病，開始主要為原發(fā)部位出現(xiàn)紅腫，發(fā)熱癥狀，繼而出現(xiàn)水泡，72小時(shí)后除第3和第4組外，其它兩組均出現(xiàn)原發(fā)和繼發(fā)性水泡，3組和4組均有一只豚鼠四個(gè)足掌部均末出現(xiàn)水泡，僅略為腫大；除3組有一只豚鼠出現(xiàn)輕微的繼發(fā)性水泡外(僅一只后足掌部出現(xiàn)，兩前足至第10天時(shí)仍正常)其余均末出現(xiàn)繼發(fā)性水泡，且原發(fā)部位的水泡面積也明顯小于其余各組，到第10天時(shí)已基本康復(fù)(無紅腫和發(fā)熱癥狀，水泡結(jié)痂，潰瘍面基本消退)。結(jié)果免疫組豚鼠的免疫保護(hù)率分別為83.3％和100％，而對(duì)照組全部不保護(hù)。由此說明，重組腺病毒對(duì)豚鼠具有很好的免疫保護(hù)作用。見表1。
表1豚鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

(2)重組腺病毒對(duì)豬的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)用豬為肅白品種豬，約4～5月齡，體重30～40kg，共8只，購于甘肅省武威地區(qū)，均為健康非口蹄疫疫苗免疫豬，試驗(yàn)前用液相阻斷ELISA方法檢測(cè)口蹄疫病毒抗體效價(jià)均小于4。試驗(yàn)豬隨機(jī)分為兩組，每組4頭A組為攻毒對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)不免疫；B組為重組腺病毒免疫組，每頭豬耳根肌肉接種1×109個(gè)TCID50病毒量。
分別于免疫前和免疫后第7、14、21、28天采血5ml，分離血清，用液相阻斷ELISA檢測(cè)特異性抗體。用蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫病毒抗體液相阻斷ELISA試劑盒檢測(cè)所有豬血清抗體，按照試劑盒操作說明進(jìn)行。
用O用型制苗毒強(qiáng)毒株每頭豬經(jīng)頸部肌肉注射20個(gè)豬感染劑量，進(jìn)行攻毒，逐天觀察病變情況并記錄。
結(jié)果(1)液相阻斷ELISA抗體水平見表2。
表2試驗(yàn)豬液相阻斷ELISA抗體水平

根據(jù)試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)，抗體水平＜4為陰性，抗體水平≥8判為陽性，抗體水平≥32時(shí)具有95％以上的保護(hù)力。B組3號(hào)和4號(hào)豬的抗體水平在第二周時(shí)升高，在第三周時(shí)抗體水平達(dá)到最高，1號(hào)豬抗體水平在免疫后第四周方為陽性，說明該豬產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較遲。
(2)豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

注++++表現(xiàn)出全部的臨床癥狀；+++蹄部不完全發(fā)??；++有1個(gè)蹄部發(fā)病；-表示未發(fā)病A組對(duì)照豬在攻毒后第二天全部開始發(fā)病，豬體溫升高、精神萎靡、食欲不振，蹄痛跛行，在蹄冠和蹄叉部有水泡出現(xiàn)。到第4天發(fā)病嚴(yán)重，豬臥地不起蹄殼邊緣潰裂，水泡糜爛。該組結(jié)果說明攻毒制苗苗種毒是一種強(qiáng)毒株，具有很強(qiáng)的致病作用，達(dá)到試驗(yàn)對(duì)照的目的。免疫組1號(hào)豬在攻毒后第8天，右后蹄出現(xiàn)跛行，蹄緣有水泡出現(xiàn)，在第9天左后蹄也發(fā)病，但該豬的癥狀沒有A組的嚴(yán)重，而且病程延遲。免疫組的其余3頭豬至11天時(shí)仍未出現(xiàn)臨床癥狀。實(shí)驗(yàn)說明重組腺病毒對(duì)豬具有很好的免疫保護(hù)作用，試驗(yàn)保護(hù)率可達(dá)75％，證明本發(fā)明可以成為一種替代口蹄疫滅活疫苗的新型基因工程重組病毒活載體疫苗。
權(quán)利要求
1.O型口蹄疫病毒多基因復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗，其特征在于該重組病毒攜帶有可以表達(dá)口蹄疫病毒全衣殼蛋白的O型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因P1和2A、3C蛋白酶基因，以及真核表達(dá)元件形成目的基因表達(dá)盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的O型口蹄疫病毒多基因復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗，其特征在于其真核表達(dá)元件為CMV啟動(dòng)子和SV40的poly(A)序列。
3.根據(jù)要求1或2所述的O型口蹄疫病毒多基因復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗，其特征在于采用O型口蹄疫病毒毒株China99為目的基因來源。
4.權(quán)利要求1至3所述的一種O型口蹄疫病毒多基因復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗的制備方法，其特征在于(1)采用引物序列為
(2)以O(shè)型口蹄疫病毒陽性質(zhì)粒為目的模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到P1-2A和3C蛋白酶基因，(3)將得到的P1-2A和3C蛋白酶基因克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成目的基因表達(dá)盒；將此重組穿梭質(zhì)粒線化后，轉(zhuǎn)化帶有腺病毒骨架載體的感受態(tài)菌(BJ5183)，得到帶目的基因表達(dá)盒的重組腺病毒質(zhì)粒，(4)將重組腺病毒質(zhì)粒酶切線化后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)，得到初代重組腺病毒，(5)初代重組腺病毒在人胚胎腎細(xì)胞上傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，制備并純化得產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的O型口蹄疫病毒多基因復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗的制備方法，其特征在于初代重組腺病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)采用轉(zhuǎn)瓶和微載體懸浮培養(yǎng)法來生產(chǎn)病毒，并采用超濾濃縮純化病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用基因克隆技術(shù)制備一種畜用口蹄疫病毒活載體免疫疫苗及其制備方法。本發(fā)明的疫苗及其制備方法是攜帶有可以表達(dá)O型口蹄疫病毒全衣殼蛋白的O型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因P1和2A、3C蛋白酶基因，以及真核表達(dá)元件形成的目的基因表達(dá)盒的疫苗和這種疫苗的制備方法。
文檔編號(hào)A61K39/135GK1730101SQ20051004194
公開日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日
發(fā)明者謝慶閣, 劉在新, 盧曾軍 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所