專利名稱：：一種首烏藤多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種首烏藤多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
：中藥首烏藤(CaulisPolygoniMultiflori)為蓼科植物何首烏的干燥藤莖，又名夜交藤、棋藤，資源豐富，價(jià)廉易得。中醫(yī)用于治療失眠多夢(mèng)、血虛身痛、風(fēng)濕痹痛；外治皮膚瘙癢。具有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)的功能。目前對(duì)首烏藤的研究?jī)H限于蒽醌類化合物(大黃素、大黃素-6-甲醚、大黃素-8-0-i3-D-葡萄糖甙等)。另有報(bào)道，首烏藤醇提物能抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠高脂血癥，對(duì)鵪鵓實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化(AS)有一定的預(yù)防和治療作用，首烏藤有降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血脂的功能；復(fù)方首烏藤合劑能增強(qiáng)自然衰老小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，并對(duì)分別由東莨菪堿、亞硝酸鈉和40%乙醇引起的小鼠記憶獲得、記憶鞏固和記憶再現(xiàn)病理模型有較明顯的改善作用。研究表明，首烏藤中的主要活性成分首烏藤多糖可顯著增強(qiáng)小鼠SOD和GSH-Px活性，有效降低MDA含量，具有很好的抗氧化作用，將成為新一代抗氧化劑，是一種在治療腫瘤及抗衰老方面的潛力藥。那么，如何將首烏藤多糖從首烏藤中提練出來(lái)，提高藥用價(jià)值，目前國(guó)內(nèi)外無(wú)人涉足，因此，如何研制出一種從首烏藤中提取首烏藤多糖，且多糖得率高的制備方法為眾所期待。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種首烏藤多糖的制備方法，可有效解決首烏藤多糖的制備問(wèn)題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，將首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與堿溶液以15-30的重量體積比混合，然后用80-95°C水浴回流提取2_3次，每次l_5h，過(guò)濾，合并濾液，調(diào)PH為7，濃縮至首烏藤粉末重量體積的1-2倍，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至首烏藤粉末重量體積的0.5-1倍，加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入第二次多糖沉淀物重量體積的1-2倍量的無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖；所說(shuō)的堿溶液是摩爾濃度為0.05-lmol/L的NaOH水溶液、0.05-lmol/L的KOH水溶液、0.01-lmol/L的Na2CO3水溶液等中的一種；所說(shuō)的樹(shù)脂柱，是預(yù)處理的樹(shù)脂柱，樹(shù)脂柱的預(yù)處理方法是，取樹(shù)脂用乙醇浸泡24小時(shí)，濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇作流動(dòng)相清洗樹(shù)脂，洗至流出的乙醇與水混合不呈白色混濁為止，再以蒸餾水作流動(dòng)相通過(guò)樹(shù)脂層，洗凈乙醇，樹(shù)脂柱濕態(tài)(即預(yù)處理的樹(shù)脂柱)保存?zhèn)溆?；所說(shuō)的樹(shù)脂為DA-201、D101、HPD-600、AB-8、XDA-6、LSA-20、CAD-45、D860021等中的一種；所說(shuō)的乙醇為質(zhì)量濃度95%的乙醇或無(wú)水乙醇；所說(shuō)重量體積是指固體用g計(jì)，液體用ml計(jì)，以下同。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，多糖得率高，含量亦較高，提取的多糖有明顯的抗氧化活性。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)際情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1將100克首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與摩爾濃度為0.07-0.8mol/L(具體可采用0.2mol/L)的NaOH水溶液800mL混合，85°C水浴回流提取5h，過(guò)濾，得第一次濾液，第一次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.07-0.8mol/L(具體可采用0.2mol/L)的NaOH水溶液550mL，80°C水浴提取4h，過(guò)濾，得第二次濾液，并和第一次濾液合并，用鹽酸調(diào)PH為7，濃縮至120mL，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加IOOmL蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上DA-201樹(shù)脂柱或HPD-600樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與DA-201樹(shù)脂柱或HPD-600樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫DA-201樹(shù)脂柱或HPD-600樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至IOOmL,加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入20mL的無(wú)水乙醇、20mL的丙酮、20mL的乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖干粉10g，用公知的UV檢測(cè)方法測(cè)的多糖含量是41.21%。實(shí)施例2將500克首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與摩爾濃度為0.07-0.8mol/L(具體可采用0.2mol/L)的KOH水溶液7500mL混合，90°C水浴回流提取4h，過(guò)濾，得第一次濾液，第一次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.07-0.8mol/L(具體可采用0.2mol/L)的KOH水溶液5000mL，85°C水浴提取3h，過(guò)濾，得第二次濾液，并和第一次濾液合并，用鹽酸調(diào)PH為7，濃縮至500mL，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加500mL蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上DlOl樹(shù)脂柱或XDA-6樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與DlOl樹(shù)脂柱或XDA-6樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫DlOl樹(shù)脂柱或XDA-6樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至500mL，加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入500mL的無(wú)水乙醇、500mL的丙酮、500mL的乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖干粉48g，用公知的UV檢測(cè)方法測(cè)的多糖含量是40.52%。實(shí)施例3將2000克首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與摩爾濃度為0.03-0.8mol/L(具體可采用0.Imo1/L)的Na2CO3水溶液56000mL混合，95°C水浴回流提取2h,過(guò)濾，得第一次濾液，第一次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.03-0.8mol/L(具體可采用0.lmol/L)的Na2CO3水溶液40000mL，90°C水浴回流提取2h，過(guò)濾，得第二次濾液，第二次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.03-0.8mol/L(具體可采用0.lmol/L)的Na2CO3水溶液30000mL，90°C水浴提取lh，過(guò)濾，得第三次濾液，并和第一、第二次濾液合并，用鹽酸調(diào)PH為7，濃縮至2500mL，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加2000mL蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上AB-8樹(shù)脂柱或LSA-20樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與AB-8樹(shù)脂柱或LSA-20樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫AB-8樹(shù)脂柱或1^八-20樹(shù)脂柱至11101丨吐反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至1500mL，加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入2000mL的無(wú)水乙醇、2000mL的丙酮、2000mL的乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖干粉195g，用公知的UV檢測(cè)方法測(cè)的多糖含量是42.18%。本發(fā)明提取的首烏藤多糖，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，能顯著提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，表現(xiàn)出首烏藤多糖具有良好的抗氧化活性，具體實(shí)驗(yàn)情況如下1首烏藤多糖體內(nèi)抗氧化活性研究方法取體重20_24g的昆明種小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，每組10只。分別為空白組、多糖低劑量組OOOmgAg-SmgAg-1是指Ikg體重的小鼠服用的劑量，劑量以mg計(jì)，以下同)、多糖中劑量組(400mg·kg—1)、多糖高劑量組(800mg·kg-1)，連續(xù)15天口服給藥(空白對(duì)照組給等量自來(lái)水)，每天小鼠給藥體積為0.2ml/10g。末次給藥后24h，處死動(dòng)物，分別取小鼠血清及制備1%肝勻漿液，按照試劑盒規(guī)定的測(cè)定方法測(cè)定首烏藤多糖對(duì)小鼠血清和肝組織中的SOD、GSH-PX及MDA的影響。2首烏藤多糖體內(nèi)抗氧化活性結(jié)果分析2.1首烏藤多糖對(duì)小鼠肝組織中SOD、GSH-Px,MDA的影響見(jiàn)表1表1首烏藤多糖對(duì)小鼠肝組織中SOD、GSH-Px,MDA的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表1可以看出，與空白組比較，大劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性提高極顯著(P<0.01)，MDA水平降低極顯著(P<0.01)；中劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著增高(P<0.05)，MDA水平降低極顯著(P<0.01)；小劑量組肝組織中SOD活性顯著提高(P<0.05)，MDA水平降低極顯著(P<0.01)，但GSH-Px活性與空白組差異不顯著(P>0.05)。2.2首烏藤多糖對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px的影響見(jiàn)表2表2首烏藤多糖對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表2可見(jiàn)，與空白組相比，大、中劑量組的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01)，小劑量組小鼠血清中SOD和GSH-Px活性差異無(wú)顯著性(P>0.05)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，首烏藤多糖大、中劑量組顯著提高正常小鼠血清和肝組織中SOD、GSH-Px的活性，明顯降低正常小鼠肝組織中MDA水平，說(shuō)明首烏藤多糖具有顯著的抗氧化作用。綜上所述，本發(fā)明采用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行粗多糖的純化，具有條件溫和，脫蛋白和脫色徹底的特點(diǎn)，且樹(shù)脂經(jīng)再生可以重復(fù)利用，本發(fā)明的有益效果是工藝簡(jiǎn)單，且提取的首烏藤多糖得率高，能顯著提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，表現(xiàn)出首烏藤多糖具有良好的抗氧化活性。權(quán)利要求一種首烏藤多糖的制備方法，其特征在于，將首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與堿溶液以1∶5-30的重量體積比混合，然后用80-95℃水浴回流提取2-3次，每次1-5h，過(guò)濾，合并濾液，調(diào)pH為7，濃縮至首烏藤粉末重量體積的1-2倍，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80％，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至首烏藤粉末重量體積的0.5-1倍，加入乙醇至含醇量達(dá)到80％，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入第二次多糖沉淀物重量體積的1-2倍量的無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖；所說(shuō)的堿溶液是摩爾濃度為0.05-1mol/L的NaOH水溶液、0.05-1mol/L的KOH水溶液、0.01-1mol/L的Na2CO3水溶液中的一種；所說(shuō)的樹(shù)脂柱，是預(yù)處理的樹(shù)脂柱，樹(shù)脂柱的預(yù)處理方法是，取樹(shù)脂用乙醇浸泡24小時(shí)，濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇作流動(dòng)相清洗樹(shù)脂，洗至流出的乙醇與水混合不呈白色混濁為止，再以蒸餾水作流動(dòng)相通過(guò)樹(shù)脂層，洗凈乙醇，樹(shù)脂柱濕態(tài)保存?zhèn)溆茫凰f(shuō)的樹(shù)脂為DA-201、D101、HPD-600、AB-8、XDA-6、LSA-20、CAD-45、D860021中的一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的首烏藤多糖的制備方法，其特征在于，將100克首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與摩爾濃度為0.07-0.8mol/L的NaOH水溶液SOOmL混合，85°C水浴回流提取5h，過(guò)濾，得第一次濾液，第一次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.07-0.8mol/L的NaOH水溶液550mL，80°C水浴提取4h，過(guò)濾，得第二次濾液，并和第一次濾液合并，用鹽酸調(diào)PH為7，濃縮至120mL，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加IOOmL蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上DA-201樹(shù)脂柱或HPD-600樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與DA-201樹(shù)脂柱或HPD-600樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫DA-201樹(shù)脂柱或HPD-600樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至IOOmL,加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入20mL的無(wú)水乙醇、20mL的丙酮、20mL的乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖干粉10g。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的首烏藤多糖的制備方法，其特征在于，將500克首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與摩爾濃度為0.07-0.8mol/L的KOH水溶液7500mL混合，90°C水浴回流提取4h，過(guò)濾，得第一次濾液，第一次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.07-0.8mol/L的KOH水溶液5000mL，85°C水浴提取3h，過(guò)濾，得第二次濾液，并和第一次濾液合并，用鹽酸調(diào)PH為7，濃縮至500mL，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加500mL蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上DlOl樹(shù)脂柱或XDA-6樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與DlOl樹(shù)脂柱或XDA-6樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫DlOl樹(shù)脂柱或XDA-6樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至500mL，加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入500mL的無(wú)水乙醇、500mL的丙酮、500mL的乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖干粉48g。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的首烏藤多糖的制備方法，其特征在于，將2000克首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與摩爾濃度為0.03-0.8mol/L的Na2CO3水溶液56000mL混合，95°C水浴回流提取2h，過(guò)濾，得第一次濾液，第一次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.03-0.8mol/L的Na2CO3水溶液40000mL，90°C水浴回流提取2h，過(guò)濾，得第二次濾液，第二次回流提取后的藥渣再加入摩爾濃度為0.03-0.8mol/L的Na2CO3水溶液30000mL，90°C水浴提取lh，過(guò)濾，得第三次濾液，并和第一、第二次濾液合并，用鹽酸調(diào)pH為7，濃縮至2500mL，再加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加2000mL蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上AB-8樹(shù)脂柱或LSA-20樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與AB-8樹(shù)脂柱或LSA-20樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫AB-8樹(shù)脂柱或LSA-20樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮至1500mL，加入乙醇至含醇量達(dá)到80%，靜置12小時(shí)，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入2000mL的無(wú)水乙醇、2000mL的丙酮、2000mL的乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖干粉195g。全文摘要本發(fā)明涉及首烏藤多糖的制備方法，有效解決首烏藤多糖的制備問(wèn)題，其方法是，將首烏藤干燥、粉碎，得首烏藤粉末，首烏藤粉末與堿溶液混合，然后水浴回流提取，過(guò)濾，合并濾液，調(diào)pH，濃縮，再加入乙醇，靜置，離心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加蒸餾水溶解，得多糖溶解液，上樹(shù)脂柱，直到流出液在473nm處的吸收度與樹(shù)脂柱上層溶液的吸收度相同，即大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，用蒸餾水洗脫樹(shù)脂柱至molish反應(yīng)無(wú)紫色環(huán)時(shí)停止收集，將洗脫液濃縮，加入乙醇，靜置，離心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，離心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首烏藤多糖；本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，多糖得率高，含量亦較高，提取的多糖有明顯的抗氧化活性。文檔編號(hào)A61P39/06GK101824096SQ201010159778公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年4月29日優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日發(fā)明者馮衛(wèi)生,張寒娟,楊云申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院