專利名稱：降低血液中l(wèi)dl－膽固醇濃度和增加hdl－膽固醇濃度以減少粥樣硬化和血管疾病危險(xiǎn)的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及大豆黃素和它的代謝物(O-去甲基安哥拉紫檀素和二氫大豆黃素)，這種物質(zhì)在通過增加高密度脂蛋白膽固醇的濃度和降低低密度脂蛋白膽固醇的濃度來改變?nèi)搜褐械哪懝檀汲煞譂舛壬鲜怯杏玫?。血液中高密度和低密度的脂蛋白膽固醇濃度的變化減少了粥樣硬化和血管疾病的危險(xiǎn)。
心血管疾病是導(dǎo)致發(fā)病和死亡的主要原因(尤其是在美國(guó)和西歐國(guó)家)。和心血管疾病成因有關(guān)的因素包括遺傳因素、性、生活方式因素(例如吸煙和飲食)、年齡、高血壓和高脂血(包括高膽甾醇血)。其中一些因素，特別是高脂血和高膽甾醇血容易引起粥樣硬化(心血管疾病的主要原因)的發(fā)生。
高血膽固醇濃度是人類血管疾病和冠狀心臟病的主要危險(xiǎn)因素之一。升高的低密度脂蛋白膽固醇(此后稱為“LDL-膽固醇”)和總膽固醇與冠狀心臟病增加的危險(xiǎn)直接相關(guān)。(膽固醇和死亡率Framingham的30年不斷的研究，Anderson,Castelli，和Levy,JAMA,Vo1.257,pp.2176-80(1987))。
雖然高水平的總膽固醇和LDL-膽固醇是發(fā)生粥樣硬化和血管疾病的危險(xiǎn)因素，但是最近認(rèn)為缺乏高密度脂蛋白膽固醇(此后稱為“HDL-膽固醇”)是發(fā)生這些狀況的危險(xiǎn)因素。幾例臨床試驗(yàn)提供了HDL-膽固醇抗粥樣硬化的保護(hù)性作用。一項(xiàng)研究表明在婦女血液中每增加1-mg/dl的HDL-膽固醇，冠狀血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)減少3％(高密度脂蛋白膽固醇和心血管疾病四個(gè)有前景的美國(guó)研究，Gordon,Probstfield,和Garrison等，循環(huán)，Vol.79,pp.8-15(1989))。
在飲食中用攝取植物蛋白質(zhì)取代動(dòng)物蛋白質(zhì)，這和低的冠狀心臟病發(fā)生相關(guān)，這可以使血清膽固醇水平降低。已知植物蛋白質(zhì)物質(zhì)，特別是大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)能降低動(dòng)物血液中的總膽固醇和LDL-膽固醇水平。最近對(duì)人類血清脂類的大豆蛋白質(zhì)吸收效應(yīng)的meta-分析表明飲食中的大豆蛋白質(zhì)與人總膽固醇及LDL-膽固醇的血清濃度降低顯著相關(guān)，而沒有明顯地影響HDL-膽固醇濃度(對(duì)血清脂類的大豆蛋白質(zhì)吸收效應(yīng)的meta-分析Anderson,Johnstone，和Cook-Newell,N.Eng1.J.Med.,Vol.333,No.5,pp.276-82(1995))。認(rèn)為大豆蛋白質(zhì)中的植物雌激素(Phytoestrogens)是作為大豆蛋白質(zhì)的血膽固醇減少效應(yīng)的潛在重要因子。
植物雌激素(如在大豆中發(fā)現(xiàn)的)是一種在結(jié)構(gòu)上類似于來源于植物的雌激素的化合物。已經(jīng)確定了雌激素本身是一種重要的心臟保護(hù)性因子。絕經(jīng)后的婦女采取雌激素替代治療結(jié)果能減少冠狀心臟病和心肌梗塞的發(fā)生。認(rèn)為雌激素能減少冠狀心臟病發(fā)生的危險(xiǎn)的一種機(jī)理是通過血液中致動(dòng)脈粥樣化的化合物(如LDL膽固醇)濃度的雌激素減少來抑制粥樣硬化的發(fā)展。然而，對(duì)雌激素缺乏的婦女施用雌激素與乳房和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生增加有關(guān)，從而限制了使用雌激素作為血管和心臟的保護(hù)藥劑。
植物雌激素，特別是來源于大豆和苜蓿的異黃酮(例如染料木黃酮、大豆黃素、黃豆黃素、它們的糖苷衍生物、鷹嘴豆素和芒柄花黃素)在一些哺乳動(dòng)物和人組織中表現(xiàn)出雌激素的性質(zhì)，并且在其它的組織中通過在雌激素的受體位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制雌激素表現(xiàn)出抗雌激素的性質(zhì)。和雌激素不同，這些異黃酮植物雌激素和癌的發(fā)生增加無關(guān)，并且實(shí)際上能抑制乳房和子宮癌的發(fā)展。
最近的研究已經(jīng)確定了這些異黃酮能降低動(dòng)物血液中的總膽固醇和LDL-膽固醇的濃度，并因此能抑制或者減緩粥樣硬化的發(fā)展。這些異黃酮對(duì)人血液中膽固醇水平的影響還不太清楚(如在meta-分析所示)，然而異黃酮降低血液中總膽固醇與LDL-膽固醇濃度是一定的。
盡管在開發(fā)用于降低人血液中總膽固醇和LDL-膽固醇的化合物和方法上取得了進(jìn)步，但仍然需要能夠安全地提供對(duì)血液中的膽固醇水平的這些作用以降低粥樣硬化和血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)的其它化合物。還需要開發(fā)用于增加人血液中HDL-膽固醇水平以提供這種膽固醇保護(hù)心臟的作用的化合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了改變?nèi)搜褐心懝檀汲煞譂舛纫詼p少粥樣硬化和血管疾病發(fā)生危險(xiǎn)的方法。將含有大豆黃素的物質(zhì)以有效的量施用到人體以增加人血液中HDL-膽固醇的濃度并減少LDL-膽固醇的濃度。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將大豆黃素以大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)飲食添加物的形式施用到人體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將大豆黃素以藥物組合物的形式施用到人體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用含有大豆黃素的物質(zhì)以引起人血液中的O-去甲基安哥拉紫檀素的濃度增加。
在另一方面，本發(fā)明是一種改變?nèi)搜褐心懝檀汲煞譂舛纫詼p少粥樣硬化和血管疾病發(fā)生危險(xiǎn)的方法，其中將大豆黃素物質(zhì)以一有效的量施用到人體以增加人血液中的HDL-膽固醇的濃度。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明是關(guān)于大豆黃素(下面的式1)的濃度和大豆黃素的代謝物，特別是O-去甲基安哥拉紫檀素(式2)的發(fā)明，在人血液中，大豆黃素的消耗量與血液中HDL-膽固醇濃度增加以及非HDL膽固醇濃度的減少有明顯的關(guān)系，大豆黃素的消耗量和在血液中膽固醇濃度的這些變化比和其它存在于大豆中的異黃酮的關(guān)系更顯著。本發(fā)明包括大豆黃素在人體中的治療應(yīng)用，通過增加血液中HDL-膽固醇濃度和減少LDL-膽固醇濃度來抑制粥樣硬化和血管疾病的發(fā)展。
大豆黃素是天然存在的物質(zhì)，其主要存在于植物(如豆科植物、苜蓿、kudzu vine(葛根)的根中。大豆黃素的一般豆科植物來源包括大豆、鷹嘴豆和各種類型的大豆和豌豆。大豆黃素的苜蓿來源包括紅苜蓿和地下苜蓿。大豆是特別優(yōu)選的大豆黃素來源。
可以從天然存在或者合成制備的植物來源分離大豆黃素?？梢匀鏦ong(食品農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志，Vol.13,P.304(1962))公開的從紅苜蓿分離大豆黃素或者如Ganguly和Sarre(Chem & Ind.(London),p.201(1970))提供的從霉菌鹽生植小單孢菌中分離大豆黃素，以上的兩篇參考文獻(xiàn)本文一并參考?？梢酝ㄟ^Baker等(化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，p.274(1933))、Wesley等(Ber.Vol.66,p.685(1933))、Mahal等(化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，p.1769(1934))、Baker等(化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，p.1852(1953))或者Farkas(Ber.Vo1.90,p.2940(1957)(每一篇參考文獻(xiàn)本文一并參考))提供的方法通過合成來制備大豆黃素。大豆黃素是市售的，并且能夠買到，例如從Indofine化學(xué)公司(P.0.BOX473,Somerville，新澤西，08876)可以買到。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從大豆物質(zhì)中分離大豆黃素。可以從其中分離出來大豆黃素的大豆物質(zhì)包括大豆、去莢的大豆、大豆粗粉、大豆粉、大豆石細(xì)胞團(tuán)、大豆片(全脂和脫脂)、大豆糖漿、大豆蛋白濃縮物、大豆乳清、大豆乳清蛋白和大豆蛋白質(zhì)分離物。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有大豆黃素的異黃酮是利用低分子量的有機(jī)萃取劑(優(yōu)選的是醇、乙酸乙酯、丙酮或醚，最優(yōu)選的是乙醇或甲醇水溶液)從大豆、去莢的大豆、大豆粗粉、大豆粉、大豆石細(xì)胞團(tuán)、大豆片、大豆蛋白濃縮物、大豆乳清蛋白或大豆蛋白分離物中分離出來的，最優(yōu)選的是從大豆粗粉、大豆粉、大豆石細(xì)胞團(tuán)、大豆片中分離出來的。最優(yōu)選的萃取劑具有同大豆蛋白等電點(diǎn)大約相同的pH(大約pH4或pH5)以使通過大豆萃取劑提取的大豆蛋白的量減到最少。
從不溶的大豆物質(zhì)中分離含有異黃酮的萃取劑以形成富含異黃酮的提取物，通過將提取物與能吸附提取物中異黃酮的物質(zhì)相接觸，用從吸附劑物質(zhì)中特異洗脫異黃酮的溶劑把吸附的異黃酮從吸附劑物質(zhì)中洗脫出來，將大豆黃素與提取物中的其它異黃酮和雜質(zhì)分離。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過常規(guī)的反相高效液相色譜(“HPLC”)分離法將大豆黃素與提取物中的異黃酮和雜質(zhì)分離。在從大豆物質(zhì)中提取出異黃酮和從不溶的大豆物質(zhì)中分離出提取物后，將提取物過濾以便除去可能堵塞HPLC柱的不溶性物質(zhì)。用能夠與大豆黃素及提取物中其它的異黃酮和雜質(zhì)以一種化合物特異性方式可釋放性地結(jié)合的顆粒吸附劑物質(zhì)包裝常規(guī)市售的HPLC柱來制備HPLC柱。吸附劑可以是任何的反相HPLC填柱物質(zhì)，然而，可以通過載荷量、分離效能和成本等標(biāo)準(zhǔn)來選擇優(yōu)選的填柱物質(zhì)，這樣一種優(yōu)選的填柱物質(zhì)是從Eka Nobel,Nobel工業(yè)公司(瑞典)得到的Kromasil C18 16μm 100A珠。
將過濾的提取物通過填好的HPLC柱，直到柱的所有結(jié)合位點(diǎn)全都和異黃酮結(jié)合為止，這可以通過柱的流出物中出現(xiàn)異黃酮來檢測(cè)。然后可以用溶劑洗脫HPLC柱以進(jìn)行分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗脫液是極性溶劑，例如乙醇、甲醇、乙酸乙酯或者乙腈，優(yōu)選的是含水的醇，醇的含量在大約30％至大約90％之間，最優(yōu)選的是大約50％，最優(yōu)選的醇是乙醇。
從柱流出物中分別收集大豆黃素物質(zhì)、其它異黃酮物質(zhì)和雜質(zhì)。可以根據(jù)常規(guī)HPLC和分析化學(xué)技術(shù)將洗脫液中的大豆黃素組分與其它的洗脫液組分區(qū)分開來。含有大豆黃素的洗脫液組分中的配基異黃酮物質(zhì)先從柱中洗脫出來，接下來是黃豆黃素組分，然后是更極性的染料木黃酮。
可以從柱中收集洗脫液的大豆黃素組分，可以通過蒸發(fā)除去易揮發(fā)的溶劑(例如醇)。如果所有的溶劑都能通過蒸發(fā)除去，那么可以直接回收大豆黃素物質(zhì)，或者可以通過冷卻剩下的溶劑(如水)和離心或過濾剩下的溶劑來回收大豆黃素物質(zhì)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在將與其它的異黃酮分離前，大豆黃素的異黃酮葡糖苷--黃豆甙和大豆黃素的異黃酮綴合物--6’-0-丙二酰黃豆甙(6’-0-Mal黃豆甙)以及6’-0-乙酰黃豆甙(“6’-0-Ac黃豆甙”)轉(zhuǎn)化成大豆黃素，因此增加了回收的大豆黃素物質(zhì)的量。異黃酮綴合物和大豆黃素的葡糖苷轉(zhuǎn)化為大豆黃素可以發(fā)生在大豆底物中(在提取前要從大豆底物中提取大豆黃素)，或者可以發(fā)生在富含異黃酮的提取物中(在從不溶的大豆物質(zhì)分離提取物之后)。
優(yōu)選地，通過形成大約為pH8-13(優(yōu)選的pH大約為9-11)的大豆底物的含水堿性溶液(從此溶液中提取異黃酮)，在大約25℃至大約75℃將含水的堿性溶液處理一段時(shí)間(優(yōu)選的大約為30分鐘至5小時(shí))以使至少大部分的大豆黃素異黃酮綴合物轉(zhuǎn)化為大豆黃素，使大豆黃素的異黃酮綴合物轉(zhuǎn)化為異黃酮葡糖苷黃豆甙。最優(yōu)選地，在大約pH11、溫度為大約35℃、處理大約45分鐘將大豆黃素異黃酮綴合物轉(zhuǎn)化為大豆黃素。
基本上所有的異黃酮葡糖苷黃豆甙都可以轉(zhuǎn)化為大豆黃素，優(yōu)選的是在大豆黃素的異黃酮綴合物轉(zhuǎn)化為黃豆甙之后。通過將黃豆甙與能夠切割α1,4-β糖苷鍵的酶(優(yōu)選的是市售的β-葡糖苷酶、α或β-半乳糖苷酶、果膠酶、乳糖酶或葡萄糖淀粉酶)接觸將黃豆甙轉(zhuǎn)化為大豆黃素，此轉(zhuǎn)化發(fā)生在使酶活化的pH下(一般從大約pH3到大約pH9)、大約25℃至75℃的溫度下和能夠發(fā)生轉(zhuǎn)變的一段時(shí)間(一般大約1小時(shí)至24小時(shí)，更優(yōu)選的為大約1小時(shí)至3小時(shí))。
在大豆黃素的異黃酮綴合物和黃豆甙轉(zhuǎn)化為大豆黃素后，可以按照以上所述的方法將大豆黃素從大豆底物中提取出來并從提取物中分離出來。大豆黃素的異黃酮綴合物和黃豆甙轉(zhuǎn)化為大豆黃素明顯地增加了通過分離方法可回收的大豆黃素的量，因?yàn)榇罅看蠖裹S素的異黃酮綴合物和黃豆甙存在于大豆物質(zhì)中。
可以將大豆黃素以藥物制劑的形式施用到人體內(nèi)，以降低血液中的LDL-膽固醇濃度和增加HDL-膽固醇濃度來減少粥樣硬化和血管疾病的危險(xiǎn)。可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備由任何以上所述的方法得到的或從商業(yè)途徑買到的摻加大豆黃素的藥物制劑。例如可以將大豆黃素配制成片劑、膠囊、粉劑、懸浮液、非腸道使用(包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下使用)的溶液和與常規(guī)載體、粘合劑、稀釋劑、賦形劑一起經(jīng)皮定點(diǎn)使用的溶液。
按照本發(fā)明的用于形成藥物制劑的藥學(xué)上可接受的惰性載體包括淀粉、甘露糖醇、硫酸鈣、磷酸二鈣、硬脂酸鎂、硅的衍生物和/或糖類(如蔗糖、乳糖、葡萄糖)等。粘合劑包括羧甲基纖維素和其它纖維素衍生物、明膠、天然及合成的樹膠(包括藻酸鹽如藻酸鈉、聚乙二醇、蠟等)。用于本發(fā)明的稀釋劑包括合適的油、鹽水、糖溶液(如含水的右旋糖或含水的葡萄糖)和二醇(如聚乙二醇或聚丙二醇)。其它的賦形劑包括潤(rùn)滑劑如油酸鈉、乙酸鈉、硬脂酸鈉、氯化鈉、苯甲酸鈉、滑石和硬脂酸鎂等；崩解劑包括瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈉、淀粉、黃原膠等；吸附性載體如皂土和陶土等。也可以將著色劑和調(diào)味劑加入到藥物制劑中。
也可以將大豆黃素以飲食添加物的形式施用到人體內(nèi)，以降低血液中的LDL-膽固醇濃度和增加HDL-膽固醇濃度來減少粥樣硬化和血管疾病的危險(xiǎn)。在制備食品的過程中，可以將各種來源的大豆黃素加入到食物中來制備摻加大豆黃素的飲食添加物?？梢约尤氪蠖裹S素的食品包括幾乎所有的食品。例如，可以加入大豆黃素的食品包括(但不限于)肉(如切碎的肉、乳化肉、腌肉和注射大豆黃素的肉)、飲料(如有營(yíng)養(yǎng)的飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、加入了蛋白質(zhì)的飲料、果汁、牛奶、牛奶替代品和減重飲料)、乳酪(如硬乳酪和軟乳酪、奶油乳酪和白(cottage)乳酪)、冷凍的甜食(如冰激凌、冷凍牛奶、低脂肪冷凍甜食、和不含奶制品的冷凍甜食)、酸乳、湯、布丁、烘烤產(chǎn)品、色拉調(diào)味劑、醬(dip)和涂抹食品(如蛋黃醬和chip dips)。加入到食品中的大豆黃素可選的量大小以能夠向食物消費(fèi)者中提供所需劑量的大豆黃素為依據(jù)。
也可以將大豆黃素以富含大豆黃素的大豆蛋白物的形式加入到飲食添加物制劑施用，以降低血液中的LDL-膽固醇濃度和增加HDL-膽固醇濃度來減少粥樣硬化和血管疾病的危險(xiǎn)。由市售的脫脂大豆片制備富含大豆黃素的大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)的一種方法是用含水的堿性溶液提取大豆片，含水的堿性溶液一般為大約pH8-10(優(yōu)選的是大約pH9-10)的氫氧化鈣或氫氧化鈉溶液；從不溶的大豆物質(zhì)分離提取物以便形成含有大豆黃素、蛋白質(zhì)以及大豆片中其它的含水堿性可溶性組分的含水提取物。然后將提取物用酸(優(yōu)選的是無機(jī)酸)處理以使提取物的pH降至大約為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，優(yōu)選的是大約pH4-5，最優(yōu)選的是大約pH4.4-4.6，由此從提取物中沉淀出含有大量大豆黃素的蛋白質(zhì)凝乳。優(yōu)選地，如上所述將大豆黃素的異黃酮綴合物和黃豆甙轉(zhuǎn)化成大豆黃素以增加沉淀的蛋白質(zhì)凝乳中捕集的大豆黃素的量。然后，優(yōu)選地通過離心從提取物中分離出蛋白質(zhì)凝乳，并干燥以形成蛋白質(zhì)分離物。優(yōu)選地，與產(chǎn)生蛋白質(zhì)分離物的常規(guī)方法不同，可不用水洗滌凝乳或者用最小量的水洗滌凝乳，以使從蛋白質(zhì)分離物中損失的大豆黃素的量降至最小。
產(chǎn)生富含大豆黃素的大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)的其它方法包括如上所述在大豆蛋白濃縮物和大豆乳清蛋白質(zhì)物質(zhì)中將黃豆甙和大豆黃素的異黃酮綴合物轉(zhuǎn)化成大豆黃素。
要施用的大豆黃素的具體的劑量應(yīng)該能有效地降低血液中的LDL-膽固醇濃度和增加HDL-膽固醇濃度，并且將取決于施用途徑和其它的產(chǎn)生粥樣硬化或者血管疾病的危險(xiǎn)因素，例如遺傳因素、血漿膽固醇和脂質(zhì)濃度。一般可接受的有效的每日劑量可以為大約10-1000mg/天，更典型的大約30-500mg/天，最優(yōu)選的大約50-300mg/天。
應(yīng)以有效的量施用大豆黃素來增加被施用大豆黃素的人的血液中的O-去甲基安哥拉紫檀素的濃度。優(yōu)選地，也應(yīng)該以能有效增加施用大豆黃素的人的血液中二氫大豆黃素濃度的量施用大豆黃素。O-去甲基安哥拉紫檀素和二氫大豆黃素是通過人體在大豆黃素分解代謝中產(chǎn)生的兩種代謝物。參見“飲食中植物雌激素在尿中的分布研究”，新型異黃酮的鑒定和代謝方式，Joannou等，類固醇生物化學(xué)和分子生物學(xué)雜志，Vol.54,No.3/4,pp.167-84(1995)，本文一并參考。在本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在施用大豆黃素后，血液中O-去甲基安哥拉紫檀素和二氫大豆黃素的濃度，特別是O-去甲基安哥拉紫檀素的濃度與血液中HDL-膽固醇水平的增加和LDL-膽固醇水平的減少明顯相關(guān)。
下列非限制性的制劑說明了可以按照本發(fā)明的方法使用的含有大豆黃素的藥物和飲食制劑。
制劑下面的制劑1-4說明了含有大豆黃素的藥物制劑。在制劑中，“活性成分”是指大豆黃素。制劑1明膠膠囊使用下列組分制備了硬明膠膠囊活性成分10-1000mg/膠囊；淀粉，NF 0-600mg/膠囊；淀粉流動(dòng)粉0-600mg/膠囊；聚硅氧烷液體350厘沲0-20mg/膠囊。將成分混合、過篩，并裝入膠囊。制劑2片劑使用下列組分制備了片劑活性成分10-1000mg/片；微晶纖維素20-300mg/片；淀粉0-50mg/片；硬脂酸鎂或硬脂酸0-15mg/片；二氧化硅(發(fā)煙的)0-400mg/片；二氧化硅(膠體)0-1mg/片和乳糖0-100mg/片。將組分混合并壓制成片劑。制劑3懸浮液使用下列組分制備了懸浮液活性成分10-1000mg/5ml；羧甲基纖維素鈉50-700mg/5ml；苯甲酸鈉0-10mg/5ml；純水5ml；如需要，可使用調(diào)味劑和生色劑。制劑4非腸道施用的溶液通過在10％(體積)丙二醇和水中攪拌1.5％(重量)的活性成分來制備腸道外組合物。用氯化鈉將溶液配制成等滲溶液并滅菌。
下面的制劑5-8說明了可以使用分離的富含大豆黃素的大豆蛋白制備的飲食添加物。在下面的例子中分離的富含大豆黃素的大豆蛋白一般每克含有大約1至3毫克的大豆黃素。制劑5備飲飲料用下面的成分制備備飲飲料
成分 組分的百分比(重量)水 80-85富含大豆黃素的分離的大豆蛋白10-15蔗糖 5-8可可0.1-1維生素/礦物質(zhì) 0.1-1調(diào)味劑 0.1-1纖維素凝膠 0.1-0.5這種飲料可以分裝成每份8盎司，其中含有大約20克分離的大豆蛋白(其中包括大約20至60毫克大豆黃素)。制劑6粉末飲料用下面的成分制備粉末飲料成分 組分的百分比(重量)富含大豆黃素的分離的大豆蛋白 85-90蔗糖 8-15麥芽糖糊精1-5維生素/礦物質(zhì)0.5-2天冬甜素 0-0.5調(diào)味劑 0-0.5可以將30克的粉末飲料加入水中制備含有大約20克分離的大豆蛋白(其中包括大約20至60毫克大豆黃素)的一份制劑。制劑7食物條使用下列組分制備食物條成分 組分的百分比(重量)富含大豆黃素的分離的大豆蛋白20-30玉米糖漿35-45稻米糖漿固體7-14甘油1-5可可 2-7化合物包衣15-25食物條每份70克，含有大約15克分離的大豆蛋白(其中包括大約15至45毫克大豆黃素)。制劑8大豆酸乳使用下列組分配制大豆酸乳成分 組分的百分比(重量)水 65-75富含大豆黃素的分離的大豆蛋白5-15蔗糖3-8玉米淀粉1-5糊精 0.3-1纖維素凝膠 1-3培養(yǎng)物(酸乳) 0.01-0.1水果10-20維生素/礦物質(zhì) 0.05-0.3大豆酸乳每份170克，含有大約8克的大豆蛋白質(zhì)(其中含有大約18-大約24毫克的大豆黃素)。
下列的非限制性試驗(yàn)實(shí)施例說明了本發(fā)明的方法。
實(shí)施例1對(duì)于異黃酮染料木黃酮、大豆黃素和黃豆黃素對(duì)絕經(jīng)后的婦女血液中HDL-膽固醇、非HDL膽固醇、總膽固醇濃度的影響，進(jìn)行了時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的研究。如果在二者之間存在明顯的關(guān)系，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上異黃酮和它們代謝物的濃度與測(cè)定到的產(chǎn)生的膽固醇水平相關(guān)。
選擇了六十六個(gè)血膽甾醇過多的絕經(jīng)后婦女進(jìn)行統(tǒng)計(jì)研究，這些婦女自從最后一個(gè)月經(jīng)期至少有整整一年的絕經(jīng)期，并且血漿膽固醇的含量在6.2和7.8mmol/L之間。在開始研究的前兩周，對(duì)每一個(gè)婦女進(jìn)行兩天攝取飲食記錄，并且和注冊(cè)的飲食學(xué)家面談以計(jì)算在國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃第Ⅰ步的基本低脂肪、低膽固醇飲食情況下每一個(gè)人每天的能量需求。給每一個(gè)受治療者一本由美國(guó)心臟協(xié)會(huì)出版的具有長(zhǎng)的食物目錄的小冊(cè)子，這個(gè)小冊(cè)子還列出了已計(jì)算好的符合基本日常飲食標(biāo)準(zhǔn)的＂限定的脂肪克數(shù)＂。
對(duì)于所有受治療者給予至少十四天的基本飲食。此后，分別在兩天抽出基線血液樣品，并將受治療者隨機(jī)地分成飲食治療小組。所有三個(gè)小組繼續(xù)給予基本飲食，并在他們的飲食中加入四十克的試驗(yàn)蛋白質(zhì)。試驗(yàn)蛋白質(zhì)分別為如下含有中等水平異黃酮的分離的大豆蛋白質(zhì)(St.Louis(Missouri)國(guó)際蛋白質(zhì)技術(shù)公司的Supro675，其含有1.39mg異黃酮/g蛋白質(zhì)，其中的異黃酮是染料木黃酮、大豆黃素、黃豆黃素、和它們各自的葡萄糖苷和丙二酰以及乙酰綴合物)，這里被命名為＂ISP＂組；含有較高水平異黃酮的分離的大豆蛋白質(zhì)(2.25mg異黃酮/g蛋白質(zhì)，其中的異黃酮是染料木黃酮、大豆黃素、黃豆黃素、和他們各自的葡萄糖苷和丙二酰以及乙酰綴合物)，這里被命名為＂ISP+＂組；或者酪蛋白/無脂肪干牛奶(0mg總異黃酮/g蛋白質(zhì)，新西蘭牛奶產(chǎn)品公司，Wellington，新西蘭)，在這里被命名為＂酪蛋白＂組。在ISP和ISP+蛋白質(zhì)中添加鈣以提供每天800至900mg磷酸鈣的形式的鈣，鈣的量與酪蛋白組通過奶制品成分提供的鈣的量一致。
ISP、ISP+和酪蛋白組蛋白質(zhì)中的異黃酮含量如下面的表1所示。
表1
受治療者每天消耗的組合物提供40g的試驗(yàn)蛋白質(zhì)。研究出了加入酪蛋白和大豆蛋白質(zhì)分離物的面包產(chǎn)品的各種食譜，并制成了產(chǎn)品，施用于受治療者。也使用含有分離的大豆蛋白質(zhì)和酪蛋白的備混飲料和湯。
在本項(xiàng)研究的整個(gè)過程中，由注冊(cè)的飲食學(xué)家指導(dǎo)所有受治療者保持體重、日?；顒?dòng)、飲食需要和可用的食品以及攝入的飲料。每隔4周，隨機(jī)地選擇3天(包括2個(gè)平日和1天周末)，要求受治療者記錄3天攝入的飲食。使用營(yíng)養(yǎng)分析軟件程序(營(yíng)養(yǎng)學(xué)家IV,3.0版；N-平方計(jì)算，Salem Park,OR)分析每天實(shí)際攝入的營(yíng)養(yǎng)。每周利用天平稱量體重，以予以每周校準(zhǔn)。利用受治療者的3天食物攝取記錄的活動(dòng)報(bào)告評(píng)價(jià)每天的日?；顒?dòng)。
在不連續(xù)的2天中(在兩周適應(yīng)時(shí)期(基線)和每6周(整個(gè)研究共24周)結(jié)束時(shí))，在禁食12小時(shí)后，將受治療者的血液樣品收集到含有肝素、EDTA和沒有抗凝劑的管中。4℃下在1190xg下離心15分鐘分離血漿和血清。
按照如下的方法測(cè)量收集的樣品中HDL、HDL2、HDL3(總“HDL-膽固醇”)、總血漿膽固醇(“TC”)和非HDL膽固醇(LDL-膽固醇+極低密度脂蛋白膽固醇(“VLDL-膽固醇”)、大多數(shù)非HDL膽固醇是LDL-膽固醇)、脫輔基脂蛋白A-I和B的水平。立即通過肝素-Mn2+沉淀分離HDL和HDL3脂蛋白組分，將血漿血清樣品分別以等分試樣存儲(chǔ)用于以后的分析。使用自動(dòng)技術(shù)(Boehringer Mannheim Hitachi 704自動(dòng)分析儀，Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN；Sigma Diagnostics,St.Louis,MO；Raichem,San Diego,CA)定量總血漿膽固醇(“TC”)HDL、HDL3、脫輔基脂蛋白A-I和B的水平。通過使用CDC或國(guó)際谷物化學(xué)家聯(lián)盟(IFCC)已知濃度的質(zhì)量對(duì)照血漿樣品(西北脂質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)室，Seattle,WA)檢驗(yàn)血漿測(cè)量方法的準(zhǔn)確度。通過從TC中減去HDL計(jì)算非HDL膽固醇。從HDL和HDL3組分之間的差得到HDL2值。
使用多元線型回歸分析評(píng)價(jià)飲食添加物對(duì)總膽固醇、HDL膽固醇、非HDL膽固醇以及飲食攝入、身體質(zhì)量指數(shù)、日?；顒?dòng)的影響。使用兩個(gè)虛假編碼(dummy-coded)的變量(一個(gè)將ISP+飲食與酪蛋白飲食對(duì)比，另一個(gè)將ISP飲食與酪蛋白飲食對(duì)比)表明了處理效果。在每一個(gè)分析中，結(jié)果變量的基線值包含在模型中作為協(xié)變量。通過Weigel和Narvaez(對(duì)照的臨床試驗(yàn)，Vol.12,pp.378-94(1991))概述的方法檢驗(yàn)通過協(xié)變量交互作用的處理。如果不存在顯著的交互作用，將交互作用一詞從模型中刪除。通過對(duì)剩余值對(duì)預(yù)測(cè)值標(biāo)繪圖的檢查來評(píng)價(jià)剩余方差的正常性和均一性的回歸模型假定。通過檢驗(yàn)18周、12周和6周的顯著性處理效應(yīng)的存在和按順序進(jìn)入早期時(shí)間(只有在后期已經(jīng)確定了顯著效應(yīng)時(shí))來連續(xù)檢測(cè)效應(yīng)的短暫開始。此外，通過單向方差分析對(duì)每組之間每一時(shí)刻在營(yíng)養(yǎng)攝入、日?；顒?dòng)、身體質(zhì)量指數(shù)(ht/wt2)的差異進(jìn)行比較。使用成對(duì)的T-測(cè)驗(yàn)評(píng)價(jià)每組內(nèi)基線的變化。此外，對(duì)所有基線量度和可測(cè)量的能夠評(píng)價(jià)組間均一性的受治療者特征進(jìn)行了方差分析。所有統(tǒng)計(jì)方法是利用統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)(SAS研究所公司，Cary,N.C.)來進(jìn)行的。在所有的統(tǒng)計(jì)測(cè)驗(yàn)中使用了α0.05水平。
單向方差分析表明，在飲食攝入中除了蛋白質(zhì)外，任何選擇的營(yíng)養(yǎng)物沒有顯著性差異。和所有三組(ISP、ISP+和酪蛋白)的基線相比，在24周攝入的蛋白質(zhì)明顯地增加。在身體質(zhì)量指數(shù)和日?；顒?dòng)方面，三個(gè)組中都沒有顯著的變化。
ISP飲食、ISP+飲食和酪蛋白飲食對(duì)總膽固醇、非HDL膽固醇、HDL-膽固醇、HDL2-膽固醇、HDL3-膽固醇影響的評(píng)價(jià)測(cè)量值列于下面的表2，也列出了統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差值。同時(shí)此表也包含每種飲食值的調(diào)整平均偏差(“AMD”)和可能值(“p-值”)。
表2
表2(含量
研究結(jié)果表明，和含有對(duì)照酪蛋白而不含有異黃酮的蛋白質(zhì)飲食相比，含有異黃酮的蛋白質(zhì)飲食組能顯著地增加HDL膽固醇濃度和顯著地減少非HDL膽固醇濃度。在食用ISP飲食的受治療者中HDL-膽固醇濃度增加了5.2％，食用ISP+飲食者增加了3.6％。和那些食用不含異黃酮的酪蛋白對(duì)照飲食的受治療者相比，在處理時(shí)期內(nèi)的食用異黃酮飲食的受治療者的HDL-膽固醇濃度增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到顯著(p＜0.05)。和那些食用酪蛋白對(duì)照飲食的受治療者相比，在處理時(shí)期內(nèi)的食用異黃酮飲食的受治療者的非HDL-膽固醇濃度降低在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到顯著(p＜0.05)。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)本研究的結(jié)果，把受治療者的血液中每種異黃酮化合物和它的代謝物的濃度與HDL-膽固醇的增加及非HDL(LDL)-膽固醇的減少相比較，以確定在某種特異性的異黃酮和它的代謝物與血液中膽固醇濃度之間的變化是否存在相關(guān)。大豆黃素代謝物包括0-去甲基安哥拉紫檀素(“DMA”)、二氫大豆黃素(“DHD”)和雌馬酚。對(duì)從受治療者中收集的樣品進(jìn)行血漿異黃酮值和血漿脂蛋白值進(jìn)行線型相關(guān)分析。為了排除假定正常性的需要和減少邊遠(yuǎn)數(shù)據(jù)點(diǎn)的影響進(jìn)行了Spearman排列順序相關(guān)分析。從0至6月的數(shù)值的變化產(chǎn)生了相關(guān)(如下面的表3所示)。在表中統(tǒng)計(jì)上顯著的結(jié)果標(biāo)記如下*代表p＜0.10；**代表p＜0.05；***代表p＜0.01。
表3
如表3所示，在本研究的基礎(chǔ)上，大豆黃素和其代謝物(作為一組)與受治療者的血液中HDL-膽固醇的增加和非HDL膽固醇(包括LDL-膽固醇)的減少明顯相關(guān)。O-DMA--大豆黃素最終代謝產(chǎn)物與受治療者血液中膽固醇水平的變化特別相關(guān)。
通過以上實(shí)施例表明可以通過增加血液中HDL-膽固醇的濃度和減少LDL-膽固醇的濃度，使用大豆黃素來改變?nèi)搜褐心懝檀汲煞值臐舛龋貏e是用來改變絕經(jīng)后婦女血液中膽固醇成分的濃度。
應(yīng)該理解，以上所述只是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，在不背離本發(fā)明的宗旨及所附的權(quán)利要求中闡述的更廣的方面可以進(jìn)行各種改變，這些改變應(yīng)被理解為符合專利法的原理，包括等同原則。
權(quán)利要求
1．一種藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，所說的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑用于改變?nèi)搜褐心懝檀贾鞍壮煞值臐舛纫詼p少粥樣硬化和血管疾病危險(xiǎn)的方法，目的在于增加所說的人血液中的高密度脂蛋白膽固醇的濃度，其特征在于所說的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑含有大豆黃素物質(zhì)。
2．按照權(quán)利要求1的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其目的是降低低密度脂蛋白膽固醇的濃度。
3．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中所說的人是指經(jīng)絕后的婦女。
4．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中所說的人患有血膽甾醇過多。
5．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中所說的人患有粥樣硬化。
6．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中施用所說的大豆黃素引起所說的人血液中的O-去甲基安哥拉紫檀素濃度的增加。
7．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中施用所說的大豆黃素引起所說的人血液中的二氫大豆黃素濃度的增加。
8．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中每天給所說的人施用大約10mg至1000mg所說的大豆黃素物質(zhì)。
9．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中每天給所說的人施用大約30mg至500mg所說的大豆黃素物質(zhì)。
10．按照權(quán)利要求1或2的用于所說的方法中的藥物或者營(yíng)養(yǎng)制劑，其中每天給所說的人施用大約50mg至300mg所說的大豆黃素物質(zhì)。
11．按照權(quán)利要求1或2的制劑，這種制劑是大豆蛋白物質(zhì)的飲食添加物。
12．按照權(quán)利要求11的制劑，其中所說的大豆蛋白物質(zhì)是富含大豆黃素的物質(zhì)。
13．按照權(quán)利要求11的制劑，這種制劑是含有所說的大豆蛋白物質(zhì)的飲料。
14．按照權(quán)利要求11的制劑，這種制劑是含有所說的大豆蛋白物質(zhì)的食物條。
15．按照權(quán)利要求11的制劑，這種制劑是含有所說的大豆蛋白物質(zhì)的酸乳。
16．按照權(quán)利要求1或2的制劑，這種制劑是含有所說的大豆蛋白物質(zhì)的酸乳。
17．按照權(quán)利要求1或2的制劑，這種制劑是含有所說的大豆蛋白物質(zhì)的藥物組合物。
18．按照權(quán)利要求17的制劑，這種制劑是藥丸或者膠囊。
全文摘要
本發(fā)明提供了改變?nèi)梭w血液中膽固醇成分濃度的方法。將大豆黃素物質(zhì)施用到人體以增加HDL－膽固醇的濃度,并降低血液中LDL－膽固醇的濃度?？梢詫⒋蠖裹S素物質(zhì)以藥物組合物的形式施用,或者以飲食添加物(包括以大豆蛋白為基礎(chǔ)的飲食添加物)的形式施用。使用大豆黃素物質(zhì)增加血液中的HDL－膽固醇濃度和降低LDL－膽固醇濃度是通過提供更多對(duì)健康有益的HDL－膽固醇和降低引起粥樣硬化的LDL－膽固醇濃度而減少粥樣硬化和血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/352GK1212150SQ9810895
公開日1999年3月31日 申請(qǐng)日期1998年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月19日
發(fā)明者S·M·波特, E·C·亨利, D·H·韋格爾 申請(qǐng)人:蛋白質(zhì)技術(shù)國(guó)際公司