專利名稱：高純度天然熊去氧膽酸的制備及其在醫(yī)藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，特別是涉及一種高純度天然熊去氧膽酸的制備方 法及其在醫(yī)藥中的應用。
背景技術：
熊去氧膽酸(UDCA)系珍稀藥物熊膽之有效成份，具有清熱、平肝、明目等功效，臨 床用于治療各種膽道疾病、急慢性肝炎、肝硬化及心血管系統(tǒng)疾病，尤其對膽固醇型膽結(jié)石 有獨特療效。國內(nèi)外現(xiàn)有專利或文獻報道UDCA的制備方法主要有三個方面，一是以天然熊 膽或人工引流熊膽所制備的熊膽粉為原料提取精制而得(參見文獻石麗霞等，引流熊膽 粉精制前后有效成分含量比較，中藥材.2000,23(6) 334 ；石麗霞等，熊膽注射液的研制與 臨床應用，中成藥.1989，11 (6) :12)，所得產(chǎn)物主要是UDCA含量較低的熊膽粉提取物，主要 作為一些中藥或天然保健品的原料使用，尚不能滿足中藥和天然藥物高端制劑，如注射液 的原料藥的質(zhì)量標準和要求；第二是以鵝去氧膽酸為原料進行UDCA的半合成制備(參見文 獻EP，88637，1983等)，該法是現(xiàn)在藥用UDCA的主要制備工藝，但反應收率較低，反應副產(chǎn) 物等相關雜質(zhì)不易控制；第三是以其他化學原料為起始材料進行UDCA的全合成制備(參見 文獻李良，中國專利98105020. 4等)，該發(fā)明合成路線不需高溫高壓反應條件，各步反應 收率高，具有較高的工業(yè)化生產(chǎn)價值，在UDCA合成研究中，獲得了一條較為優(yōu)化的合成路 線該路線為一新工藝，但仍在實驗室研究階段。鑒于中藥和天然藥物現(xiàn)代化的迅猛發(fā)展，對于相關中藥和天然藥物的有效活性成 分的質(zhì)量標準和質(zhì)量要求也日益提高。如高純度的天然熊去氧膽酸，已經(jīng)是諸多相關中藥 和天然藥物注射劑所需的重要原料，因此研究一種可制備高純度天然熊去氧膽酸的分離純 化工藝具有非常重要的價值和意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在公開一種以人工引流熊膽粉為原料，經(jīng)兩步柱層析法快速制備高純 度、高收率天然熊去氧膽酸的工藝方法。本發(fā)明是通過以下途徑得以實現(xiàn)人工引流熊膽粉是經(jīng)人工飼養(yǎng)的黑熊膽汁引流干燥制備所得，該熊膽粉的主要物 質(zhì)成分為?；切苋パ跄懰?含量約30%)、?；蛆Z去氧膽酸(含量約25%)、熊去氧膽酸 (含量約3%)、鵝去氧膽酸(含量約2%)、?；撬?含量約8%)和其他膽酸鹽等成分。其 中的?；切苋パ跄懰崾侵饕康某煞?，該成分經(jīng)堿水解可得目的物熊去氧膽酸和雜質(zhì)?；?酸。因熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸在堿性條件下都會水解，為避免鵝去氧 膽酸的干擾，因此首先分離出?；切苋パ跄懰?。鑒于?；切苋パ跄懰嵩谒嵝詶l件下可吸附 于陽離子交換介質(zhì)上，因此選用CM Sepharose Fast Flow作為吸附介質(zhì)，具體吸附和洗脫 條件如下將人工引流制備的熊膽粉用20 70%的甲醇溶液溶解，濃度為3 15% (w/w)，加入乙酸鈉，終濃度為5 20mmol/L，用乙酸調(diào)節(jié)pH值為3 5 ；用與溶解熊膽粉相同的 甲醇溶液浸泡并裝柱CM Sepharose Fast Flow陽離子交換介質(zhì)，平衡后上樣，然后在含 250mmol/L的NaCL的上述甲醇溶液中洗脫?；切苋パ跄懰?。陽離子交換層析所得?；切苋パ跄懰嵩趬A性條件下可徹底水解為熊去氧膽酸鈉 和?；撬?，具體水解條件如下陽離子層析所得?；切苋パ跄懰峒铀♂? 10倍，加入10 40% (w/w )NaOH, 于80 110°C水解20 30小時，得熊去氧膽酸鈉和?；撬?。水解產(chǎn)物用稀鹽酸調(diào)節(jié)酸度至1 2，熊去氧膽酸鈉酸化為熊去氧膽酸析出，牛磺 酸保留溶液中，過濾干燥后得熊去氧膽酸粗品，該粗品溶解于硅膠流動相中經(jīng)硅膠吸附層 析可得純度大于98%的熊去氧膽酸，具體硅膠層析條件如下裝柱200 300目層析用硅膠，以乙酸乙酯-甲醇為流動相，其中流動相中甲醇含 量為0 25% (v/v)。熊去氧膽酸粗品用流動相溶解，上柱，流速為0. 5 3倍柱體積/小 時，薄層色譜檢測收集熊去氧膽酸，濃縮后乙酸乙酯結(jié)晶得高純度熊去氧膽酸。本發(fā)明所制備的熊去氧膽酸可用于原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎 的治療。
具體實施例方式現(xiàn)以一個較佳工藝條件例證舉闡明本發(fā)明所述方法取熊膽粉飲片1公斤，用10公斤50%的甲醇溶液攪拌溶解，加入乙酸鈉至終濃度 25mmol/L，用乙酸調(diào)節(jié)酸度值至5. 8，過濾，得熊膽粉飲片溶液10. 6升。取CM Sephrose Fast Flow陽離子層析介質(zhì)裝填玻璃層析柱，柱規(guī)格lOcmX 80cm， 填料高度60cm。配制平衡緩沖液50%甲醇，25mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖，pH 5.8。用平衡 緩沖液平衡3倍柱體積，上樣熊膽粉飲片樣品溶液，上樣結(jié)束后再平衡3倍柱體積。配制洗 脫緩沖液I :50%甲醇，25mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖，100mmol/L氯化鈉，pH 5. 8。用洗脫緩 沖液I洗脫3 5倍柱體積，至薄層檢測無顯色斑點結(jié)束。配制洗脫緩沖液II :50%甲醇， 25mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖，250mmol/L氯化鈉，pH 5. 8。用洗脫緩沖液II洗脫3 5倍 柱體積，至薄層檢測無?；切苋パ跄懰犸@色斑點結(jié)束。收集洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得 樣品8. 5升。取陽離子交換層析樣品，加入純水40升，氫氧化鈉5公斤，置反應釜110°C攪拌24 小時，冷卻至室溫后用6mmol/L鹽酸調(diào)至pH 1. 5，過濾干燥，得熊去氧膽酸粗品320克。取200 300目層析用硅膠，裝填玻璃層析柱，柱規(guī)格15CmX80Cm，填料高度 120cm。以乙酸乙酯為流動相。熊去氧膽酸粗品320可用1升乙酸乙酯溶解，過濾，上樣，調(diào) 節(jié)流速為350ml/min，分布收集流出液，高效薄層色譜檢測，收集熊去氧膽酸部分，合并。得 收集液54升，減壓濃縮至6. 3升，置室溫放置結(jié)晶24小時，過濾，干燥，得晶體272. 8克。經(jīng)反相高效液相色譜檢測，所得熊去氧膽酸含量為99. 12%，鵝去氧膽酸含量為 0. 33%，?；撬嵛礄z出。
權利要求
一種天然熊去氧膽酸，化學式為C24H40O4；結(jié)構(gòu)式為3a，7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸；其化學結(jié)構(gòu)如下F2009101036989C0000011.tif
2.根據(jù)權利要求1所述的熊去氧膽酸，其特征是反相高效液相色譜純度不低于98%， 主要相關雜質(zhì)鵝去氧膽酸含量不高于0. 5%，?；撬岷坎桓哂?. 5%。
3.一種制備權利要求1和2所述的熊去氧膽酸的方法，其特征是包括以下步驟(1)?；切苋パ跄懰岬闹苽鋵⑷斯ひ髦苽涞男苣懛塾?0 70%的甲醇溶液溶解， 濃度為3 15% (w/w)，加入乙酸鈉，終濃度為5 50mmol/L，用乙酸調(diào)節(jié)pH值為3 5 ； 用與溶解熊膽粉相同的甲醇溶液浸泡并裝柱CM Sepharose Fast Flow陽離子交換介質(zhì)，平 衡后上樣，然后在含250mmol/L的NaCL的上述甲醇溶液中洗脫?；切苋パ跄懰?。(2)牛磺熊去氧膽酸的水解步驟(1)所得?；切苋パ跄懰峒铀♂? 10倍，加入 10 40% (w/w)NaOH,于80 110°C水解20 30小時，得熊去氧膽酸和?；撬帷?3)熊去氧膽酸的分離純化及精制裝柱200 300目層析用硅膠，以乙酸乙酯_甲醇 為流動相，其中流動相中甲醇含量為0 25% (v/v) 0步驟(2)所得水解液用稀鹽酸調(diào)節(jié) 酸度為1 2，過濾取沉淀，干燥后用上述流動相溶解，上柱，流速為0. 5 3倍柱體積/小 時，薄層色譜檢測收集熊去氧膽酸，濃縮后乙酸乙酯結(jié)晶得高純度熊去氧膽酸。
4.一種權利要求1、2和3所述的熊去氧膽酸，其特征是可用于原發(fā)性膽汁性肝硬化和 原發(fā)性硬化性膽管炎的治療。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，特別是涉及一種高純度天然熊去氧膽酸的制備方法。高純度天然熊去氧膽酸由人工引流熊膽制備的熊膽粉分離純化所得，高效液相色譜純度不低于98％。其制備方法是首先應用陽離子交換介質(zhì)分離純化制備純度不低于90％的?；切苋パ跄懰?，然后將牛磺熊去氧膽酸在堿性條件下徹底水解為熊去氧膽酸和?；撬?，再應用硅膠吸附色譜技術分離純化制備純度不低于98％的熊去氧膽酸。本發(fā)明制得的天然熊去氧膽酸具有治療原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎作用。
文檔編號A61K31/575GK101870718SQ200910103698
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月27日 優(yōu)先權日2009年4月27日
發(fā)明者侯世興, 周家蔚, 張金魁, 王建 申請人:重慶寰瑞生物技術有限公司