專利名稱：西尼羅病毒ns1蛋白單克隆抗體及其識(shí)別的b細(xì)胞表位和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體，尤其涉及一株分泌抗西 尼羅病毒NSl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其所分泌的單克隆抗體；本發(fā)明還涉及 一個(gè)B細(xì)胞表位，尤其涉及由上述單克隆抗體所識(shí)別的西尼羅病毒NSl蛋白B細(xì)胞表 位；本發(fā)明還涉及上述雜交瘤細(xì)胞株、單克隆抗體以及B細(xì)胞表位在制備診斷、預(yù)防或 治療西尼羅病毒藥物中的應(yīng)用，屬于西尼羅病毒病的防制領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
西尼羅熱(WestNile Fever, WNF)是一種由西尼羅病毒(West Nile virus， WNV)引起的并通過蚊子傳播的急性人畜共患傳染病。WNV為單股正鏈RNA病毒， 屬黃病毒科黃病毒屬，并且WNV與日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、 圣路易腦炎病毒(Saint-Louis encephalitis virus，SLEV)和墨累河谷腦炎病毒(Murray Valley encephalitis virus, MVEV)同屬日本腦炎病毒血清群(Japanese Encephalitis Viras Serocomplex)，它們之間存在嚴(yán)重的血清學(xué)交叉反應(yīng)。1937年12月科學(xué)家從非洲烏干 達(dá)的西尼羅地區(qū)一位發(fā)熱婦女的血液中首次分離到了該病毒，故將其命名為“西尼羅病 毒”。鳥類是其重要宿主，蚊子(主要是庫蚊)叮咬是其最主要傳播方式。人、動(dòng)物和 鳥類均為易感動(dòng)物。自從科學(xué)家在非洲首次發(fā)現(xiàn)WNV之后，20世紀(jì)50年代的埃及和 以色列、60年代的法國(guó)以及70年代的南非也都有過該病的報(bào)道，但直到1996年羅馬尼 亞的WNF爆發(fā)，該病毒才真正引起人們的關(guān)注。1996-1997年羅馬尼亞發(fā)病500多人， 死亡率接近100%。1999年WNV首次出現(xiàn)于西半球，美國(guó)發(fā)生WNF的大爆發(fā)，該病毒 迅速蔓延美國(guó)全境，并傳播到加拿大和中美洲國(guó)家。據(jù)報(bào)道，人和動(dòng)物感染W(wǎng)NV后大 約20%的感染者會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，而大約1/150的感染者會(huì)發(fā)展為腦炎、腦膜炎或腦膜 腦炎，但在最近幾次WNF的爆發(fā)中，發(fā)病率、出現(xiàn)腦炎癥狀的比率以及死亡率均有所增 長(zhǎng)，1999年美國(guó)爆發(fā)的WNF截止到2005年已經(jīng)引起20000人和25000匹馬發(fā)病，其中 有800人和5000匹馬死亡。
到目前為止，中國(guó)還沒有WNV感染病例的報(bào)道。近年來中國(guó)國(guó)內(nèi)研究者對(duì)一些 地區(qū)的蚊子和鳥類進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果也均為WNV陰性。但是1987年和2006年所進(jìn) 行的流行病學(xué)調(diào)查中均出現(xiàn)了 WNV抗體陽性者，加之中國(guó)周邊國(guó)家與地區(qū)已經(jīng)有WNF 爆發(fā)，所以中國(guó)急需加強(qiáng)對(duì)該病毒的研究，做好可對(duì)其進(jìn)行防控和監(jiān)測(cè)的技術(shù)儲(chǔ)備。同 時(shí)由于人和動(dòng)物感染W(wǎng)NV后往往處于亞臨床癥狀或無癥狀，所以建立WNV的實(shí)驗(yàn)室診 斷方法尤為必要。另外，WNV與其它黃病毒屬病毒間存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，而中國(guó)又是 JEV的流行區(qū)，所以應(yīng)建立起可對(duì)WNV和JEV的感染進(jìn)行鑒別診斷的方法。
NSl蛋白是WNV的一個(gè)保守非結(jié)構(gòu)糖蛋白，含有352個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為 42kDa。NSl蛋白在疫病診斷方面有重要利用價(jià)值。NSl蛋白在機(jī)體感染后3_8天就可以 被檢測(cè)到，在感染后第5天達(dá)到最大量，這一時(shí)間要早于臨床癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，所以NSl蛋白可以被用于病毒感染的早期診斷。該病毒的病毒血癥時(shí)間短，血液中病毒粒子水平 低，不易直接檢測(cè)病原，而且對(duì)該病毒的操作要求在生物安全3級(jí)的水平中進(jìn)行，這都 給疫病的診斷帶來了不便，而若對(duì)待檢血清中針對(duì)NSl蛋白的抗體進(jìn)行檢測(cè)，則可以在 對(duì)疫病進(jìn)行診斷的同時(shí)區(qū)分自然感染動(dòng)物和弱毒苗免疫動(dòng)物，并且診斷工作在普通實(shí)驗(yàn) 室即可完成。另外，由于黃病毒屬病毒之間存在嚴(yán)重的血清學(xué)交叉反應(yīng)，所以一般的檢 測(cè)血清中抗體的診斷方法不能有效的對(duì)該屬各病毒進(jìn)行鑒別診斷，而已有研究顯示NSl 蛋白中攜帶有較多的特異性位點(diǎn)，可以誘導(dǎo)出多個(gè)在黃病毒屬病毒中無交叉反應(yīng)的特異 性抗體，而若篩選出一株可以分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并鑒定出其所分泌的單 克隆抗體所識(shí)別的WNV-NSl蛋白特異性B細(xì)胞表位，那么就可以建立一個(gè)可對(duì)WNV和 其它黃病毒屬病毒進(jìn)行鑒別診斷的ELISA檢測(cè)方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一株分泌西尼羅病毒NSl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株；
本發(fā)明目的之二是提供一種由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，該單克 隆抗體可與WNV-NSl蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與JEV-NSl蛋白不反應(yīng)；
本發(fā)明目的之三是鑒定一個(gè)WNV-NSl蛋白的WNV特異性B細(xì)胞表位。
本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明利用pMAL_c&原核表達(dá)載體對(duì)WNV-NS1基因進(jìn)行原核表達(dá)，將所 表達(dá)出的可溶性WNV-NSl蛋白純化后作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。此外，本發(fā)明還利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)WNV-NSl基因 進(jìn)行真核表達(dá)，對(duì)所表達(dá)的包涵體形式的WNV-NSl蛋白進(jìn)行變性、純化和復(fù)性后作為 檢測(cè)用抗原，建立間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終篩選獲得一株 穩(wěn)定分泌抗WNV-NSl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.4242 ；分類命名是小鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；保藏時(shí)間2010年10月13 日；保藏單位是中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
本發(fā)明還提供了 一種由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，其命名為 WN-3D10, Western blot檢測(cè)結(jié)果表明WN-3D10可與WNV-NS1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)， 而與JEV-NSl蛋白不發(fā)生反應(yīng)。
本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)和肽掃描技術(shù)對(duì)WN-3D10所識(shí)別的WNV-NSl蛋 白的β細(xì)胞表位進(jìn)行了鑒定，最終將該表位精確定位為27Awmdrykyyp36(seq id Νο.ι)。同時(shí)，序列比對(duì)結(jié)果顯示27Awmdrykyypk5 Swnv所特有并保守的β細(xì)胞表位。
綜上所述，本發(fā)明制備并鑒定出了一種特異性針對(duì)WNV-NSl蛋白的單克隆抗 體，本發(fā)明的單克隆抗體以及該單克隆抗體所識(shí)別的WNV-NSl蛋白病毒特異性保守B 細(xì)胞表位可用于制備成鑒別或診斷西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)或日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis viras, JEV)的試劑，為建立WNV與黃病毒屬病毒的血清學(xué)鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。


圖1應(yīng)用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體WN-3D10與WNV-NS1蛋白和 JEV-NSl蛋白的反應(yīng)性結(jié)果。1，3，5 WNV-NSl蛋白；2，4，6 JEV-NSl蛋白； M 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker。
圖2噬菌體克隆測(cè)序結(jié)果及與WNV-NSl蛋白相似性比較。
圖3原核表達(dá)的15氨基酸短肽SDS-PAGE分析；1.MBP-15VP ； M 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker。
圖4原核表達(dá)的15氨基酸短肽與WN-3D10反應(yīng)性的Western blot分析M 標(biāo)準(zhǔn) 蛋白 Marker ； 1 MBP-15VP 和 WN-3D10 的反應(yīng)；2 MBP 和 WN-3D10 的反應(yīng)。
圖5原核表達(dá)的15氨基酸短肽與WN-3D10反應(yīng)性的間接ELISA分析。
圖6表1中所合成短肽與WN-3D10反應(yīng)性的間接ELISA分析1 NS1-15VP和 WN-3D10 的反應(yīng)；2 NS1-13ET 和 WN-3D10 的反應(yīng)；3 NSl-IlAE 和 WN-3D10 的 反應(yīng)；4 NS1-9WP 和 WN-3D10 的反應(yīng)；5 NS1-7MY 和 WN-3D10 的反應(yīng)。
圖7表2中所合成短肽與WN-3D10反應(yīng)性的間接ELISA分析1 NS1-10AP和 WN-3D10 的反應(yīng)；2 NS1-10WE 和 WN-3D10 的反應(yīng)；3 NS1-8WY 和 WN-3D10 的 反應(yīng)；4 NS1-8MP和WN-3D10的反應(yīng)。
圖8所鑒定B細(xì)胞表位的病毒特異性分析。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述 而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
主要實(shí)驗(yàn)材料和來源
1.蛋白、細(xì)胞、毒種和抗體
原核表達(dá)并純化的WNV-NSl蛋白、真核表達(dá)并純化的WNV-NSl蛋白、SP2/0 細(xì)胞、Sffi細(xì)胞和攜帶WNV-NSl基因的重組桿狀病毒BACV-NSl均由本實(shí)驗(yàn)室保 存；原核表達(dá)的JEV-NSl蛋白和抗JEV-NSl蛋白單克隆抗體JE_1H6(已驗(yàn)證其只能與 JEV-NSl蛋白發(fā)生反應(yīng))由哈爾濱獸醫(yī)研究所華榮虹副研究員惠贈(zèng)(上述蛋白和抗體也可 按照有關(guān)文獻(xiàn)記載的方法制備得到)；黃病毒屬病毒NSl蛋白單克隆抗體Flavi_4G4(已 驗(yàn)證其與黃病毒屬病毒NSl蛋白均能發(fā)生反應(yīng))由澳大利亞動(dòng)物衛(wèi)生研究所Ros s教授惠 贈(zèng)(上述抗體也可按照有關(guān)文獻(xiàn)記載的方法制備得到)。
2.主要試劑和藥品
胎牛血清(FBS)、DMEM干粉和L-谷氨酰胺購自GIBCOL公司；弗氏佐劑、 50% PEG、50 X HAT、50 X HT和8-氮鳥嘌呤(8-AG)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山 羊抗小鼠垣0均購自Sgma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠垣0為金橋生 物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品；SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒購 于Southern Biotechnology公司；庫容量為2.7 X IO9的M13噬菌體隨機(jī)肽庫Ph.D._12TM、四環(huán)素(Tet)抗性的宿主菌ER2738以及原核表達(dá)載體pMAL_c2X均購自NEB公司；Ex T^aqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I購自寶生物工程(大連)公司。
3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
6周齡BALB/c小鼠由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
實(shí)施例1單克隆抗體的制備
1.小鼠免疫
以純化后的原核表達(dá)重組NSl蛋白免疫5只6周齡雌性BALB/c小鼠，共免疫 3次，每次免疫間隔兩周，一免將重組NSl蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，二免 和三免將重組NSl蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化，免疫劑量為50yg/只，免 疫途徑為腹腔免疫。
分別在二免和三免后一周對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾采血，分離血清G°C，IOOOOrpm, 20min),用間接ELISA檢測(cè)抗體水平。在細(xì)胞融合前3天，對(duì)免疫效果好的BALB/c小 鼠再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔注射50 μ g免疫抗原(不加佐劑)。
2.細(xì)胞融合
融合前1天準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞，按照常規(guī)方法去BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞鋪于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中待用。斷頸處死待取脾的小鼠，無菌取脾并分離脾細(xì)胞，按脾細(xì)胞與 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞4 1的比例用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞鋪于準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì) 胞之上。
3.陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆
利用純化后的真核表達(dá)WNV-NSl蛋白建立間接ELISA檢測(cè)方法篩選陽性雜交 瘤細(xì)胞株，對(duì)反應(yīng)陽性的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用有限稀釋法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞 的克隆，克隆3輪，將克隆好的陽性雜交瘤細(xì)胞及時(shí)凍存。最終獲得一株可以穩(wěn)定分泌 抗WNV-NSl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.4242， 將其分泌的單克隆抗體命名為WN-3D10。
4.單克隆抗體的大量制備
給10周齡左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑，0.5mL/只，1周后腹腔注射IX IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7-10d后當(dāng)小鼠腹部極度膨脹時(shí)抽取腹水，隔2d 抽一次，將抽取的腹水lOOOOr/η ι離心ΙΟη ι，去除上層油脂和沉淀，上清分裝保存 于-20"C。
實(shí)施例2單克隆抗體的鑒定
1.單克隆抗體的亞類鑒定
按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒操作說明書對(duì)實(shí)施例1所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。
結(jié)果顯示本發(fā)明單克隆抗體WN-3D10的重鏈為IgG1,輕鏈為κ鏈。
2.Western blot 試驗(yàn)
將WNV-NS1蛋白和JEV-NS1蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳然后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，電轉(zhuǎn) 條件為18V電壓30η ι。轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素膜放入含50g/L脫脂奶粉的PBS封閉液中 4°C封閉過夜；將封閉好的硝酸纖維素膜放入陽性雜交瘤培養(yǎng)液上清中室溫作用lh，用PBST (含0.5mL/L吐溫-20的pH7.4的PBS緩沖液)洗滌3次，再與經(jīng)PBS 5000倍稀釋 的山羊抗小鼠IgG HRP標(biāo)記抗體室溫作用lh，PBST洗滌3次，DAB顯色試劑盒顯色，掃描記錄。
為了印證本發(fā)明所制備的單克隆抗體與WNV-NSl蛋白反應(yīng)的特異性，本實(shí)驗(yàn) 還設(shè)定了 JE-1H6和Flavi_4G4兩種單克隆抗體作為對(duì)照，已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明JE-1H6只與 JEV-NSl蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與WNV-NSl蛋白不發(fā)生反應(yīng)，F(xiàn)lavi_4G4則與兩種蛋 白都發(fā)生反應(yīng)。
試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明所制備的單克隆抗體WN-3D10能夠與WNV-NS1蛋白 發(fā)生特異性反應(yīng)，而與JEV-NSl蛋白不反應(yīng)，同時(shí)所設(shè)對(duì)照J(rèn)E-1H6和Flavi_4G4均成立 (圖1)，同時(shí)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)WN-3D10所識(shí)別的WNV-NSl蛋白B細(xì)胞表位是一個(gè) 線性表位。
實(shí)施例3 B細(xì)胞表位的鑒定
1.噬菌體展示隨機(jī)肽庫的生物淘選與噬菌體基因組序列測(cè)定
參照NEB公司噬菌體展示隨機(jī)12肽庫操作手冊(cè)，用所制備純化出的單克隆抗體 WN-3D10對(duì)隨機(jī)肽庫進(jìn)行3輪淘選，從而淘選出所展示肽段可與單克隆抗體特異性結(jié)合 的噬菌體。3輪淘選單克隆抗體包被量均為100 μ g/mL，150 μ L/孔，而3輪淘選所用的 PBST緩沖液中吐溫-20濃度分別為0.1%、0.3%和0.5%。
從第3輪洗脫下來的噬菌體中取2 μ L做10倍系列稀釋，每一稀釋度取10 μ L接 種200 μ L對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ER2738宿主菌，作用5min后將全部菌液與3mL瓊脂培養(yǎng)基混合 傾注于含有IPTG和X-gal的固體培養(yǎng)基之上，37°C培養(yǎng)過夜。
從總量不到100個(gè)噬菌斑的平板上，隨機(jī)挑取10個(gè)噬斑，分別接種8管ImL對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期ER2738宿主菌，37°C搖床培養(yǎng)4.Κι。之后將培養(yǎng)物lOOOOrpm，離心30s，上清 移入新管中再次lOOOOrpm，離心30s，取600 μ L上清即為擴(kuò)增噬菌體貯液。之后根據(jù)操 作手冊(cè)中介紹的方法即可從上述噬菌體貯液中提取出噬菌體基因組DNA，并交由上海英 駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
噬菌體測(cè)序結(jié)果顯示W(wǎng)NV-3D10所淘選出的10個(gè)噬菌體克隆中有8個(gè)擁有一些 共同序列(圖2)，通過比較整合最終確定出一條一致序列DRYKYY，而且WNV-NSl蛋 白上存在該序列，故認(rèn)為DRYKYY應(yīng)該是WN-1C10所識(shí)別的一個(gè)線性表位，或者是該 表位的核心序列。
2.B細(xì)胞表位的初步鑒定
以上述NSl蛋白上的相似區(qū)段為核心，分別向蛋白N端和C端各延伸4-5個(gè)氨 基酸，最終選取長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的短肽(VEAWMDRYKYYPETP)為研究對(duì)象，進(jìn)行 WNV-NSl蛋白B細(xì)胞表位的初步鑒定。具體方法如下
(1)人工合成一對(duì)互補(bǔ)寡核苷酸鏈，分別編碼上述15個(gè)氨基酸短肽。
編碼VEAWMDRYKYYPETPWNVNS1-15VP-EcoR I
F 5 ‘ -aattcgaggcttggatggaccggtacaagtattaccctgaaacgccacaataag-3 ‘ (SEQ ID No.2)，劃線部分為引入的EcoRI粘性延伸末端。
WNVNS1-15VP-Sal I
R 5 ‘ -tcgacttattgtggcgtttcagggtaatacttgtaccggtceatccaagcctcG-3 ‘ (SEQ IDNo.3),劃線部分為引入的Sal I粘性延伸末端。
以上引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成
(2)將兩對(duì)互補(bǔ)鏈直接退火IOmin形成帶有粘性末端的雙鏈DNA，同時(shí)用 EcoR I和Sal I對(duì)pMAL_c&進(jìn)行雙酶切。
(3)將兩條退火形成的雙鏈DNA與酶切后的pMAL_c&相連接
(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化bl21感受態(tài)細(xì)胞，用兩對(duì)互補(bǔ)鏈中的上游鏈和載體下游引物 M13-47對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行pcr鑒定，將重組質(zhì)粒分別命名為pmal-NSl_15VP。
( 挑取單個(gè)陽性菌落過夜培養(yǎng)，之后以1 100接種于40mL LB液體培養(yǎng)基 中，37°C培養(yǎng)至菌液OD600約為0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mM，37°C誘導(dǎo) 表達(dá)5h，收集菌體用4mL PBS緩沖液重懸，超聲波破碎菌體，lOOOOrpm，4°C,離心 20η ι。收集上清和沉淀，并分別對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以確定短肽的表達(dá)情 況(圖3)。
結(jié)果顯示短肽成功表達(dá)，并且其與pmal-c&載體所攜帶的麥芽糖結(jié)合蛋白 (mbp)形成融合蛋白，將該融合蛋白命名為mbp-15vp。
(6)確認(rèn)短肽成功表達(dá)后，利用WN-3D10對(duì)短肽進(jìn)行Western blot分析，并將短 肽IOOng/孔包被ELISA反應(yīng)板進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。
結(jié)果顯示所表達(dá)的15氨基酸短肽可以與WN-3D10發(fā)生特異性反應(yīng)(圖 4，圖5)。 進(jìn)而將WN-3D10所識(shí)別的WNV-NSl蛋白B細(xì)胞表位初步定位于25Veawmdrykyypetp39。
3.B細(xì)胞表位的精確定位
利用肽掃描技術(shù)合成如下短肽(表1)，并對(duì)其進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，包被量為 孔，進(jìn)而精確定位b細(xì)胞表位。
表1針對(duì)WN-3D10所合成的短肽
權(quán)利要求
1.一株分泌抗西尼羅病毒(West Nile virus)NSl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其 微生物保藏號(hào)為CGMCC No.4242。
2.權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。
3.由權(quán)利要求2所述單克隆抗體識(shí)別的西尼羅病毒NSl蛋白線性B細(xì)胞表位，其特 征為其氨基酸為27AWMDRYKYYP36。
4.權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株在制備診斷、預(yù)防或治療西尼羅病毒藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在制備診斷、預(yù)防或治療西尼羅病毒藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述西尼羅病毒NSl蛋白線性B細(xì)胞表位在制備診斷、預(yù)防或治療西 尼羅病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種西尼羅病毒NS1蛋白單克隆抗體及其識(shí)別的B細(xì)胞表位和應(yīng)用。本發(fā)明篩選得到一株穩(wěn)定分泌抗WNV-NS1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.4242。該雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體WN-3D10與WNV-NS1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與JEV-NS1蛋白不發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明的單克隆抗體以及該單克隆抗體所識(shí)別的WNV-NS1蛋白病毒特異性保守B細(xì)胞表位可用于制備成鑒別或診斷西尼羅病毒和日本腦炎病毒的試劑，為建立WNV與黃病毒屬病毒的血清學(xué)鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102021146SQ20101054163
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者劉霓紅, 吳東來, 孫恩, 成林燕, 楊濤, 王群, 田野 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所