專利名稱：靶向納米遞釋系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種DR5mAb (monoclonal antibody against DR5，抗DR5單克隆抗體)介導(dǎo)的靶向納米遞釋系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，全世界每年約600萬人死于惡性腫瘤。中國現(xiàn)有癌癥患者約450萬人，死亡率逾30%，造成了嚴(yán)重的社會問題。臨床上治療惡性腫瘤的主要手段仍然是在術(shù)后予以全身輔助的化學(xué)治療，但因傳統(tǒng)化療藥物普通劑型缺乏靶向性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，常使患者不能耐受。以治療難度大、死亡率高的惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)為例，達(dá)卡巴嗪 (DTIC)是一種治療惡性黑色素瘤最有效的藥物，化學(xué)名稱為5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-4-酰胺基咪唑枸櫞酸鹽，在體內(nèi)分解能放出甲基正離子(CH3) +，為嘌呤生物合成的前體，能干擾嘌呤的生物合成，具有直接細(xì)胞毒作用，但是劑型單一，只有普通注射粉針劑，存在毒副作用大、靶向性差、用藥順應(yīng)性差、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，臨床用于惡性黑色素瘤的有效率也僅為20%。死亡受體DR5與目前已知的其他死亡受體⑶95、TNFRl、DR3、DR4 一樣，都屬于腫瘤壞死因子受體(TNRF)超家族，都是I型跨膜蛋白，然而死亡受體DR5的獨(dú)特之處就在于當(dāng)外來的配體與之結(jié)合時，它僅選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞或者轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而對機(jī)體的正常細(xì)胞不具有明顯的毒性，極大地降低了其副作用。研究表明，DR5受體高水平地廣泛表達(dá)于許多腫瘤組織，如肝癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、宮頸癌、子宮癌、惡性黑素瘤、甲狀腺癌、咽喉癌、前列腺癌等；而不表達(dá)或較少表達(dá)于正常的組織細(xì)胞中。DR5的激動型抗體(比如DR5mAb)，能特異性地結(jié)合DR5，通過細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡， 而對正常組織細(xì)胞毒性很小。因此，可以利用抗DR5單克隆抗體(DR5mAb)對腫瘤進(jìn)行免疫治療。目前，這些抗體在臨床前期研究已顯示出較TRAIL更有效的誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系和原代腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，并能使部分小鼠移植瘤模型的腫瘤消退，部分臨床試驗(yàn)研究已取得了可喜的成果。但是，單獨(dú)使用DR5mAb，容易在體內(nèi)被清除，影響治療效果。經(jīng)檢索國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫和專利數(shù)據(jù)庫，以與DR5具有高親和性、高特異性、可高效誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡且對正常細(xì)胞無毒副作用的DR5單抗為靶頭，偶聯(lián)載藥納米粒制備具有主動靶向性且可將化療和免疫治療有效結(jié)合的多功能靶向納米給藥系統(tǒng)尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種以本身具有促腫瘤細(xì)胞凋亡活性的單抗為靶頭的靶向納米遞釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)是將靶頭DR5mAb與載藥納米粒連接而制成的靶向納米遞釋系統(tǒng)，是一種有效的藥物緩釋及靶向治療系統(tǒng)，其將化療和免疫治療有效結(jié)合，既提高了藥效和特異性，又降低了藥物的毒副作用。此外，還需要提供一種靶向納米遞釋系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種靶向納米遞釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由靶頭DR5mAb 和載藥納米粒連接組成。優(yōu)選的，所述載藥納米粒的載體材料為聚乙二醇修飾的聚乳酸。聚乳酸是具有優(yōu)良生物相容性和生物降解性的聚合物，在人體內(nèi)代謝的最終產(chǎn)物是水和二氧化碳，中間產(chǎn)物乳酸是體內(nèi)糖代謝的產(chǎn)物，所以不會在體內(nèi)積聚，無毒副作用。本發(fā)明采用聚乙二醇修飾的聚乳酸，不僅具有前述聚乳酸的優(yōu)點(diǎn)，還具有長循環(huán)的特性，能更有效地將藥物輸送至腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選的，所述載藥納米粒裝載的藥物為治療腫瘤的藥物。所述腫瘤包括惡性黑素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、咽喉癌、或前列腺癌。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，載藥納米粒以治療惡性黑素瘤的達(dá)卡巴嗪 (DTIC)為模型藥物。所述靶向納米遞釋系統(tǒng)的粒徑為100-200納米。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種上述靶向納米遞釋系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟將適量藥物溶于水，制成內(nèi)水相；將適量聚乙二醇修飾的聚乳酸溶于有機(jī)溶劑，制成油相；將適量人血清白蛋白溶于水，制成外水相；把內(nèi)水相加入到油相經(jīng)超聲形成初乳，并將該初乳加入到外水相中超聲形成復(fù)乳，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，得到載藥納米粒；將靶頭DR5mAb以化學(xué)鍵偶聯(lián)的方式連接到載藥納米粒表面，得到靶向納米遞釋系統(tǒng)。優(yōu)選的，所述內(nèi)水相與油相的體積比為1 10，初乳與外水相的體積比為1 4。優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑是二氯甲烷和丙酮組成的二元混合溶劑，二氯甲烷和丙酮的體積比為3 2，可使載藥納米粒平均粒徑控制在100-200納米之間。在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述靶向納米遞釋系統(tǒng)在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明靶向納米遞釋系統(tǒng)，其靶頭抗DR5單克隆抗體(DR5mAb)本身具有抗腫瘤活性，該DR5mAb與納米遞釋系統(tǒng)中的藥物可分別從外源性和內(nèi)源性兩條途徑促使腫瘤細(xì)胞凋亡，使藥物在體內(nèi)具有主動靶向性的同時，還可將化療和免疫治療有效結(jié)合，起到協(xié)同和增敏作用，從而大大提高藥效，又可降低藥物毒副作用。本發(fā)明靶向納米遞釋系統(tǒng)，既將藥物靶向輸送至腫瘤細(xì)胞，延長藥物在體內(nèi)的作用時間，又增加DR5mAb的穩(wěn)定性，使其不易被清除。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明靶向納米遞釋系統(tǒng)，能明顯抑制腫瘤生長，效果顯著優(yōu)于原藥和DR5mAb聯(lián)合用藥組。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例3的DTIC-NPs及DTIC-NPs_DR5mAb體外釋藥曲線圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例4雙熒光標(biāo)記的DTIC-NPs-DR5mAb對表面高表達(dá)DR5的A375 細(xì)胞的特異性識別和結(jié)合功能的流式細(xì)胞儀檢測圖3是本發(fā)明實(shí)施例5雙熒光標(biāo)記的PE-NPs-DR5mAb-FITC與靶細(xì)胞A375結(jié)合和內(nèi)吞過程的激光共聚焦顯微鏡圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例6各治療組荷瘤裸鼠最終腫瘤平均體積的柱狀圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例6的DTIC-NPs_DR5mAb體內(nèi)靶抗腫瘤曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明靶向納米遞釋系統(tǒng)，以具有長循環(huán)特性的聚乙二醇修飾的聚乳酸 (MPEG-PLA)為載體材料，以治療腫瘤的藥物為模型藥物，以自身具有抗腫瘤活性并具有高特異性的DR5mAb為靶頭，先采用超聲復(fù)乳法制備載藥納米粒，然后將DR5mAb以化學(xué)鍵偶聯(lián)的方式連接到載藥納米粒表面，得到具有多重功能的靶向納米遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明采用的靶頭DR5mAb具有雙重功能，一方面，可選擇性地與表面高表達(dá)DR5的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，將載藥納米粒裝載的藥物特異性地導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞，使該緩釋藥物以內(nèi)源性途徑促使腫瘤細(xì)胞凋亡； 另一方面，DR5mAb本身具有抗腫瘤活性，以主動免疫治療的方式從外源性途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明的靶向納米遞釋系統(tǒng)，將化療和免疫治療有效結(jié)合，起到協(xié)同和增敏作用，大大提高藥效，又降低了藥物毒副作用。在下面優(yōu)選實(shí)施例中，以治療惡性黑色素瘤的有效藥物達(dá)卡巴嗪(DTIC)為模型藥物制備靶向納米遞釋系統(tǒng)。實(shí)施例lDR5mAb介導(dǎo)的靶向納米遞釋系統(tǒng)的制備以具有長循環(huán)特性的聚乙二醇修飾的聚乳酸(MPEG-PLA)為載體材料，DTIC為模型藥物，以自身具有抗腫瘤活性并具有高特異性的DR5mAb為靶頭，先采用超聲復(fù)乳法制備 DTIC-NPs緩釋遞藥系統(tǒng)，然后將DR5mAb以化學(xué)鍵偶聯(lián)的方式連接到DTlC-NPs表面，得到具有多重功能的靶向納米遞釋系統(tǒng)DTIC-NPs-DR5mAb，具體步驟如下。(1)載達(dá)卡巴嗪的DTlC-NPs遞釋系統(tǒng)的制備①電子天平精密稱取適量DTIC，以去離子水作溶劑，配制成濃度為:3mg/ml的水溶液，所得溶液作為內(nèi)水相備用。②用電子天平精密稱取MPEG-PLA適量溶于有機(jī)溶劑 Vra= 3 2) 中，配制成濃度為10mg/ml的溶液，所得溶液作為油相備用，精密稱取適量人血清白蛋白 (HSA)，以去離子水作溶劑，配制成濃度為(W/V)的水溶液，所得溶液作為外水相兼乳化劑備用，該外水相兼乳化劑使下面步驟③制得的載藥納米粒表面包裹著生物相容性良好的可降解材料HSA。③將100 μ 1去離子水或藥物溶液(內(nèi)水相)加入Iml濃度為10mg/ml的MPEG-PLA 溶液(油相)，100W、60s連續(xù)超聲制備w/o初乳。然后，將初乳滴加入細(xì)1的1 % HSA水溶液(外水相)中，100W、30s間斷超聲2次制備w/o/w復(fù)乳，再加入30ml去離子水使復(fù)乳分散。磁力攪拌4h，揮去有機(jī)溶劑，納米粒固化。14000r/min離心30min后棄去上清液即得， 洗滌3次，冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?靶向納米遞釋系統(tǒng)DTIC-NPs_DR5mAb的制備采用碳二亞胺法制備靶向納米遞釋系統(tǒng)，即將抗DR5單克隆抗體與DTlC-NPs表面包裹的HSA以化學(xué)鍵偶聯(lián)的方式連接，得到具有靶向功能的DTIC-NPs-DR5mAb。簡易反應(yīng)式如下
權(quán)利要求
1.一種靶向納米遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述靶向納米遞釋系統(tǒng)主要由靶頭DR5mAb和載藥納米粒連接組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向納米遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述載藥納米粒的載體材料為聚乙二醇修飾的聚乳酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向納米遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述載藥納米粒裝載的藥物為治療腫瘤的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向納米遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述腫瘤包括惡性黑素瘤、 肝癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、咽喉癌、或前列腺癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向納米遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述治療惡性黑素瘤的藥物為達(dá)卡巴嗪。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向納米遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述靶向納米遞釋系統(tǒng)的粒徑為100-200納米。
7.權(quán)利要求1所述靶向納米遞釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟將適量藥物溶于水，制成內(nèi)水相；將適量聚乙二醇修飾的聚乳酸溶于有機(jī)溶劑，制成油相；將適量人血清白蛋白溶于水，制成外水相；把內(nèi)水相加入到油相經(jīng)超聲形成初乳，并將該初乳加入到外水相中超聲形成復(fù)乳，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，得到載藥納米粒；將靶頭DR5mAb以化學(xué)鍵偶聯(lián)的方式連接到載藥納米粒表面，得到靶向納米遞釋系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述內(nèi)水相與油相的體積比為 1 10，初乳與外水相的體積比為1 4。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是二氯甲烷和丙酮組成的二元混合溶劑，二氯甲烷和丙酮的體積比為3 2。
10.權(quán)利要求1所述靶向納米遞釋系統(tǒng)在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向納米遞釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由靶頭DR5mAb和載藥納米粒連接組成。本發(fā)明還公開了靶向納米遞釋系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明靶向納米遞釋系統(tǒng)，是一種有效的藥物緩釋及靶向治療系統(tǒng)，靶頭DR5mAb與納米遞釋系統(tǒng)中的藥物可分別從外源性和內(nèi)源性兩條途徑促使腫瘤細(xì)胞凋亡，使藥物在體內(nèi)具有主動靶向性的同時，還可將化療和免疫治療有效結(jié)合，起到協(xié)同和增敏作用，大大提高藥效，又降低了藥物毒副作用。
文檔編號A61K47/48GK102335428SQ20111029661
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者丁寶月, 丁雪鷹, 劉繼勇, 吳兆勇, 寇有利, 張瑋, 朱全剛, 武鑫, 王學(xué)賢, 王翔, 范偉, 馬露露, 高申, 高靜 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)