專利名稱：基于丙酸菌的免疫刺激劑的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于丙酸菌(Propionibakteria)的免疫刺激劑的制備。
從DE-A3011461得知基于丙酸菌菌株DSM1773,1772和ATCC6919的腫瘤化療制劑。為準備細菌材料，使細菌在1升容器的液體培養(yǎng)基中無氧條件下增殖。然后離心分離細菌細胞，研磨，煮沸滅活，經(jīng)胰蛋白酶處理后，再次離心分離并凍干。
然后可再懸浮所得的制備物并通過例如靜脈注射施用。
上述制備方法是復(fù)雜的并且不適合用于動物保健領(lǐng)域中的試劑，例如免疫刺激劑。因此，對簡化該制備方法而不減少所述制劑的活性和相容性的可能性進行了研究。
本發(fā)明提供一種基于丙酸菌的免疫刺激劑制劑，其特征在于所述細菌在液體培養(yǎng)基中無氧增殖并，一旦發(fā)酵完成，以常規(guī)方式滅活和分離，清洗并干燥所得的細胞物質(zhì)。
意外的是以此簡單方式可得到的制劑是高效同時又是耐受良好的。
優(yōu)選使用德國微生物保藏所DSM1772號保藏的丙酸菌的avidum KP40制備免疫刺激劑?；诒峋鶮P40(DSM1772)的全細胞制劑在發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中用簡化的方法獲得。所使用的接種材料來自一只主要的原種。通過使用該種源，可保證數(shù)次傳代后的出發(fā)菌株保持與德國微生物保藏所保藏的菌株特性一致。
所述細菌通過在營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中，無氧條件下，30-39℃(優(yōu)選35-37℃)通過預(yù)培養(yǎng)和主要培養(yǎng)(Hauptkultur)進行增殖，所述營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基含酵母提取物(可用胰蛋白酶(tryptin)處理而被消化)，蛋白質(zhì)水解物，葡萄糖和有機酸，如丙酮酸，乳酸或α酮戊二酸。還可使用復(fù)合培養(yǎng)基如腦/心培養(yǎng)基。預(yù)培養(yǎng)在0.1-50升體積的深層立式培養(yǎng)中進行18-30小時。用預(yù)培養(yǎng)物接種主要培養(yǎng)。發(fā)酵在10-5000升體積的控制發(fā)酵罐中持續(xù)振蕩培養(yǎng)基，進行24-72小時，優(yōu)選40-56小時，特別優(yōu)選48小時。
發(fā)酵完成后，以常規(guī)方式通過物理方法，例如通過加熱，紫外或γ照射，或通過化學(xué)方法，例如通過乙醇，甲醛或β內(nèi)酯的反應(yīng)滅活所述細菌。
加熱滅活在60-120℃(優(yōu)選在75-85)發(fā)酵罐中進行15-60分鐘(優(yōu)選30-45分鐘)?；瘜W(xué)滅活以本來為已知的方式在適當容器，例如發(fā)酵罐中進行。所給出的優(yōu)選方案是使用濃度為0.01-0.5％的甲醛，特別優(yōu)選0.05-0.2％的甲醛。所述滅活在30-39℃進行，優(yōu)選35-37℃，持續(xù)12-48小時，優(yōu)選18-30小時，并使該材料在不斷運動中滅活。
通過過濾或通過，分批或連續(xù)流動離心的方法從培養(yǎng)肉湯分離滅活的細菌細胞。優(yōu)選使用0.1-1微米孔徑(優(yōu)選0.22-0.45微米)的膜通過對流連續(xù)流動法進行過濾。該方法還可用于細菌細胞的濃縮物，以及培養(yǎng)肉湯的洗滌液和含生理鹽濃度(例如0.9％濃度生理鹽溶液)的緩沖水溶液的甲醛殘余物或磷酸緩沖生理鹽溶液。
通過5000-20,000x g離心力離心分離所述細菌細胞，通過分批法或連續(xù)流動法分批進行。
在含生理鹽濃度的緩沖水溶液(例如0.9％濃度生理鹽溶液或磷酸緩沖鹽溶液)中重懸浮所述沉淀物。為清洗培養(yǎng)肉湯和甲醛殘留物，該操作被重復(fù)數(shù)次。
在沖洗后，使細菌細胞經(jīng)過干燥過程，例如噴霧干燥或冷凍干燥。優(yōu)選使用冷凍干燥，被重懸浮的細菌細胞直接在樣品容器中分份凍干，或以較大的份量被凍干并隨后稱重到樣品容器中。到此最后的操作，若有必要將所述細菌與保護性膠體和/或穩(wěn)定劑，去泡劑和防腐劑混合。
在施用所述制劑前，用一種溶劑，例如蒸餾水，純化水或0.9％濃度的生理鹽水溶液重新配制(reconstituted)所述干燥的產(chǎn)物。
實施例全細胞細菌制劑的制備材料-PBS(SIGMA D8537)-NaOH儲備液10％NaOH 100.00克去離子水補足1000.00毫升-培養(yǎng)基溶液1酪蛋白水解物120.00克酵母提取物 120.00克L-半胱氨酸HCI 10.00克淀粉15.00克丙酮酸鈉15.00克硫酸鎂 10.00克去離子水補足7500.00毫升溶液2葡萄糖 40.00克去離子水補足250.00毫升溶液3磷酸二氫鉀 40.00克NaOH儲備液10％ 120.00毫升去離子水補足2250.00毫升在全部物質(zhì)被溶解后，將溶液1轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中并與發(fā)酵罐一起滅菌。在制備后，立即將溶液2和3分別在+110℃滅菌15分鐘。在無菌條件下，將溶液2和3加入到發(fā)酵罐中的溶液1。為建立起無氧條件并檢查滅菌情況，在+37℃，每分鐘100轉(zhuǎn)(rpm)和每小時1.5升氮氣(N2/h)運轉(zhuǎn)所述發(fā)酵罐過夜。為預(yù)培養(yǎng)，將100毫升培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到100毫升Schott瓶中。取出該培養(yǎng)基1毫升以再懸浮保藏的P.avidumKP40樣品。將全部再懸浮的保藏的樣品轉(zhuǎn)移到Schott瓶中，并旋好瓶蓋，但要松一些。在+37℃無菌條件下(GasPak,BBL)進行培養(yǎng)24小時。將100毫升該培養(yǎng)物在無菌條件下轉(zhuǎn)移到所述發(fā)酵罐中并培養(yǎng)在+37℃,100rpm和1.5升N2/h共48小時。然后終止發(fā)酵，將發(fā)酵罐內(nèi)容物與27毫升36.5％濃度的甲醛溶液(相當于0.1％終濃度的甲醛)混合。在+37℃滅活并減少與氮氣的接觸共24小時。然后卸出發(fā)酵罐中的內(nèi)容物并進行檢測。用一部分所述材料于滅活檢測(每周間隔傳3代)。所述滅活材料在10,000x g分份離心10分鐘。棄上清，并合并沉淀物和在磷酸緩沖生理鹽水(PBS)中洗兩次。隨后將10毫升一份的再懸浮細菌細胞裝入無菌25毫升瓶中并冷凍干燥。得到的產(chǎn)物被儲存在+4℃。
權(quán)利要求
1．制備基于丙酸菌的免疫刺激劑的方法，其特征在于在液體培養(yǎng)基中無氧增殖所述細菌并，一旦發(fā)酵完成，以常規(guī)方式滅活，并且所得細胞物質(zhì)被分離，洗滌，過濾和干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于丙酸菌的免疫刺激劑的制備,其特征在于所述細菌在液體培養(yǎng)基中無氧增殖并,一旦完成發(fā)酵,以常規(guī)方式滅活,并且所得細胞物質(zhì)被分離,洗滌,過濾和干燥。
文檔編號A61P37/04GK1226170SQ97196768
公開日1999年8月18日 申請日期1997年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月26日
發(fā)明者W·布羅克, E·海南, N·施梅爾, G·普爾弗雷爾 申請人:拜爾公司