專利名稱：新型血吸蟲疫苗肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)化合物。
血吸蟲病在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康，控制疾病流行的重要策略之一是研制有效的抗血吸蟲病疫苗。為了解決傳統(tǒng)照射減弱活疫苗制備中蟲體來源困難以及保證疫苗的安全性、避免致病性，目前人們正積極致力于分子疫苗的研究，如基因上程疫苗、合成多肽疫苗的研究。其中，合成多肽疫苗的意義在于用含蛋白質(zhì)抗原表位的多肽片段代替整個(gè)蛋白質(zhì)作疫苗抗原，可以避免使用母體蛋白引起的副作用，且可以用化學(xué)方法大量合成，易于制得化學(xué)純，接種量小，無滅活不完全造成的致病危險(xiǎn)，有實(shí)際應(yīng)用前景。
然而，合成多肽一般是小分子半抗原，在體內(nèi)易被迅速降解、排泄，傳統(tǒng)的解決方法是將多肽與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)形成多肽-載體復(fù)合物。本發(fā)明的目的在于用J.P.Tam新近提出的多抗原肽(multiple antigen peptide,MAP)概念制備含血吸蟲抗原肽的MAP化合物作為血吸蟲病疫苗抗原。其優(yōu)點(diǎn)在于可以將兩種不同的抗原肽結(jié)合在同-疫苗分子中，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，所合成的新型多抗原肽疫苗能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生顯著抵抗血吸蟲感染的保護(hù)性免疫力，同時(shí)避免了使用在體內(nèi)引起毒副作用的蛋白質(zhì)載體，因而能夠用于人類臨床，且具有確定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定，便于貯存、運(yùn)輸和發(fā)放。
本發(fā)明所涉及的有機(jī)化合物-多抗原肽，由多個(gè)血吸蟲抗原肽和作為核心基質(zhì)的寡聚賴氨酸組成，即n級(jí)聚合的核心基質(zhì)由2n-1個(gè)賴氨酸組成，可連接2n個(gè)多肽片段，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示(A-Ag)2n-1(A-Ag′)2n-1(Lys)2n-1-B-X]]>在上式中A為H或RCO-形式的基團(tuán)，在這里，R是H或C1-5烷基。
Ag和Ag′分別是下列兩種不同的多肽H-Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe-Gln-Asp-Trp-Pro-Lys-OH(P1)H-Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-OH(P2)H-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly-OH(P3)H-Pro-Gln-Ile-Asp-Lys-Tyr-Leu-Lys Ser-Ser-Lys-Tyr-Ile-Ala-Trp-Pro-OH(P4)n是一個(gè)從1至10的整數(shù)，最好是2或3。
B可以是天然氨基酸殘基，或D-構(gòu)型的氨基酸殘基，最好是-Gly,-Ala-，或-β-Ala-。
X可以是NHR或OR，在這里，R是H或C1-5烷基。
本發(fā)明涉及的多抗原肽及其與免疫佐劑形成的復(fù)合物，在體外活性檢測和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，表明均有有價(jià)值的生物活性。特別是在抗血吸蟲病方面，能夠誘導(dǎo)昆明小鼠和BALB/C小鼠產(chǎn)生抵抗血吸蟲感染的保護(hù)性免疫力。如用(P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH和(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH免疫昆明小鼠，以血吸蟲正常尾蚴攻擊感染，與對(duì)照組相比，減蟲率分別為40.1％和34.4％；減卵率分別為48.4％和47.4％。用(P1)4(P2)4Lys4Lys2LysGly-OH,(P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH,(P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH和(P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH免疫BALB/C小鼠，減蟲率分別為73.6％,68.4％,47.9％和32.6％；減卵率則分別為75.9％,66.7％,45.4％和38.7％。
本發(fā)明涉及的多抗原肽可以用已知的固相多肽合成法來合成，如下述實(shí)施例。
實(shí)施例1(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH的制備稱150mgt-Boc-Gly-OCH2-Pam樹脂(0.34mol/lg resin)，置多肽合成反應(yīng)器中，加入二氯甲烷充分溶脹。用50％TFA/DCM脫去t-Boc保護(hù)基后，再用10％DIPEA/DCM中和。以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，加入相當(dāng)于樹脂氨基當(dāng)量3倍的Nα,Nε-di-t-Boc-賴氨酸二環(huán)己基胺鹽，以BOP試劑為偶聯(lián)劑，上接第一級(jí)賴氨酸，得到[Boc-Lys(Boc)]-Gly-OCH2-Pam樹脂。用同樣的方法接上第二級(jí)賴氮酸，得到[Boc-Lys(Boc)]2Lys-Gly-OCH2-Pam樹脂。第三級(jí)賴氨酸的α和ε-氨基分別用對(duì)酸穩(wěn)定的Fmoc和對(duì)堿穩(wěn)定的t-Boc選擇性地保護(hù)，得到四個(gè)Boc和四個(gè)Fmoc保護(hù)的末端氨基。TFA脫去t-Boc保護(hù)基后在4個(gè)ε-NH2上用下述的Boc化學(xué)依次接上第一種抗原肽的氨基酸。
Boc-氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基為Glu(OBzl),Lys(2-Cl-Cbz),Ser(Bzl),Thr(Bzl)。重復(fù)如下步驟直至完成全部肽鏈的合成(1)在盛Boc保護(hù)寡聚賴氨酸-樹脂的反應(yīng)器中加入TFA/DCM(1∶l,Vol/Vol)洗滌2分鐘；(2)加入TFA/DCM(1∶l,Vol/Vol)反應(yīng)20分鐘，脫去t-Boc保護(hù)基；(3)DCM洗滌，1min/次×3；(4)MeOH洗滌，1min/次×3；(5)10％DIPEA/DCM中和，2min/次×2；(6)DCM洗滌，1min/次×6，抽干；(7)稱取相當(dāng)于樹脂氨基當(dāng)量3倍的保護(hù)氨基酸、DCC和HOBt加入反應(yīng)器中，以DMF作溶劑，室溫振搖反應(yīng)；(8)DCM洗滌，1min/次×3；(9)MeOH洗滌，1min/次×3；(10)DMF洗滌，1min/次×3；(11)MeOH洗滌，1min/次×3；(12)DCM洗滌，1min/次×3，抽干；(13)茚三酮法檢測偶聯(lián)反應(yīng)完成情況，若陰性，接下一個(gè)氨基酸；若陽性，則重復(fù)7～13步，直至檢測結(jié)果為陰性。
在t-Boc-氨基酸肽鏈合成結(jié)束后，用哌啶脫去賴氨酸α-NH2上的Fmoc保護(hù)基，再用Fmoc保護(hù)氨基酸逐步合成第二種抗原肽。Fmoc-氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基為Arg(Tos),Asp(O-t-Bu),Glu(O-t-Bu),Lys(t-Boc),Ser(t-Bu),Thr(t-Bu)。Fmc-氨基酸肽鏈的合成步驟如下(1)DMF洗滌，1min/次×3；(2)哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)洗滌1min；(3)哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)脫保護(hù)，20分鐘；(4)DOM洗滌，1min/次×3；(5)MeOH洗滌，1min/次×3；(6)DMF洗滌，1min/次×3，抽干；(7)稱取相當(dāng)于樹脂氨基當(dāng)量3倍的Fmoc-氨基酸、DCC和HOBt加入反應(yīng)器中，以DMF作溶劑，室溫振搖反應(yīng)；(8)DMF洗滌，1min/次×3；(9)MeOH洗滌，1min/次×3；(10)DCM洗滌，1min/次×3；(11)DMF洗滌，1min/次×3；(12)DCM洗滌，1min/次×3，抽干；(13)茚三酮法檢測偶聯(lián)反應(yīng)完成情況，若陰性，接下一個(gè)氨基酸；若陽性，則重復(fù)7～13步，直至檢測結(jié)果為陰性。
Fmoc-氨基酸肽鏈合成結(jié)束后，用哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)脫去Nα-Fmoc保護(hù)基，再用TFA/DCM(1∶1,Vol/Vol)脫去Nα-Boc保護(hù)基。low-high HF法脫去側(cè)鏈保護(hù)基并切下樹脂，肽-樹脂混合物用10％醋酸溶液抽提，冷凍干燥得粗品肽，經(jīng)SephadexG-50凝膠滲透色譜法分批純化，凍干得白色粉末狀固體295mg，收率44.2％,[α]D23=-74.2°(C=0.07,H2O)，產(chǎn)品肽的結(jié)構(gòu)由氨基酸組成分析確定。
下列多抗原肽也可以用實(shí)施例1中給出的相似方法來合成實(shí)施例2 (P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH [α]D23=-61.2°(C=0.085,H2O)實(shí)施例3 (P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH [α]D23=-54.5°(C=0.14,H2O)實(shí)施例4 (P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-61.8°(C=0.055,H2O)實(shí)施例5 (P1)4(P2)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-72.7°(C=0.055,H2O)實(shí)施例6 (P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-70.5°(C=0.095,H2O)縮略語表Ag antigen 抗原Alaalanine 丙氨酸Argarginine 精氨酸Ashasparagine 天冬酰胺Aspaspartic acid 天冬氨酸t(yī)-BOC t-butyloxycarbonyl 叔丁氧羰基t-Bu t-butyl 叔丁基BOPbenzotriazolyl-1-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate
Bzlbenzyl 芐基Cbzbenzyloxycarbonyl 芐氧羰基DCCdicyclohexylcarbodiimide 二環(huán)己基碳二亞胺DCMdichloromethane 二氯甲烷DIPEA diisopropylethylamine 二異丙基乙基胺DMFdimethylformamide 二甲基甲酰胺Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 9-芴甲氧羰基Glyglycine 甘氨酸Gluglutamie acid 谷氨酸Glnglutamine 谷氨酰胺HOBt 1-hydroxybenzotriazole 1-羥基苯并三氮唑Ileisoleucine 異亮氨酸Lleleucine 亮氨酸Lyslysine 賴氨酸MAPmultiple antigen peptide 多抗原肽Pam resin phenylacetamidomethyl resin Pam樹脂Phephenylalanine 苯丙氨酸Proproline 脯氨酸Serserine 絲氨酸TFAtrifluoroacetic acid 三氟乙酸Thrthreonine 蘇氨酸Trptryptophan 色氨酸Tostosyl 對(duì)甲苯磺?；鵗yrtyrosinc 酪氨酸Vlavaline 纈氨酸
權(quán)利要求
1．本發(fā)明涉及一種有機(jī)化合物-多抗原肽，由多個(gè)血吸蟲抗原肽和作為核心基質(zhì)的寡聚賴氨酸組成，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示(A-Ag)2n-1(A-Ag′)2n-1(Lys)2n-1-B-X]]>在上式中A為H或RCO-形式的基團(tuán)，在這里，R是H或C1-5烷基。Ag和Ag′可以分別是下列多肽中的兩種不同的多肽H-Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe--Gln-Asp-Trp-Pro-Lys-OH(P1)H-Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-OH(P2)H-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly-OH(P3)H-Pro-Gln-Ile-Asp-Lys-Tyr-Leu-Lys-Ser-Ser-Lys-Tyr-Ile-Ala-Trp-Pro-OH(P4)n是一個(gè)從1至10的整數(shù)，最好是2或3。B可以是天然的氨基酸殘基，也可以是D-構(gòu)型的氨基酸殘基，最好是-Gly,-Ala-,-β-Ala-。X可以是NHR或OR，在這里，R是H或C1-5烷基。
2．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于A是氫。
3．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于n是2或3。
4．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于B是-Gly-。
5．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于X是OR，在這里R是H。
6．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于Ag是多肽P1,Ag′可以是P2，或P3，或P4。
7．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于Ag是多肽P2,Ag′可以是P3。
8．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于見下式(P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH(P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH(P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH(P1)4(p)4Lys4Lys2LysGly-OH(P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH
9．權(quán)利要求1-8中要求保護(hù)的多抗原肽，用作治療血吸蟲病的藥物，或用其制成的抗血吸蟲病的疫苗類藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于有機(jī)化合物。具有下列結(jié)構(gòu)的多抗原肽;(A－Ag)
文檔編號(hào)A61P33/00GK1235164SQ98101840
公開日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1998年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者蔡孟深, 曹勝利, 秦致輝, 石佑恩, 王述恒 申請(qǐng)人:北京醫(yī)科大學(xué)