專利名稱：應(yīng)用cd40cd154結(jié)合阻斷物預(yù)防反適應(yīng)性免疫應(yīng)答,特別是移植物排斥反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及對意外免疫應(yīng)答，特別是反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制。本發(fā)明尤其涉及對由免疫系統(tǒng)引起的在移植受者體內(nèi)對移植組織或器官的排斥進(jìn)行預(yù)防、治療，抑制或逆轉(zhuǎn)。
背景技術(shù)：
在遺傳上不相同的個體之間進(jìn)行器官移植無一例外地將導(dǎo)致通過T細(xì)胞依賴機制對移植器官產(chǎn)生免疫學(xué)排斥，除非通過施用抑制T細(xì)胞功能的藥物而使排斥過程被阻止。數(shù)例美國專利公布了對抑制移植物排斥反應(yīng)的這類免疫抑制藥物的應(yīng)用，包括美國專利號5,104,858；5,008,246和5,068,323。其它傳統(tǒng)試劑述于Suthanthiran等(1994)，331新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Eng.Med.J.)365-376。鈣調(diào)磷酸酶抑制物和糖皮質(zhì)類固醇均用于臨床，并均可阻止T細(xì)胞介導(dǎo)活化的細(xì)胞因子，特別是IL-2的釋放。但用這兩類傳統(tǒng)試劑進(jìn)行的治療其效果仍不理想。兩類試劑均通過破壞經(jīng)由T細(xì)胞抗原受體(TCR)這種T細(xì)胞抗原特異性的唯一媒介傳遞的信號而發(fā)揮作用，并且不加選擇地作用于所有T細(xì)胞。除此之外，這些藥物的效應(yīng)并不持久，以致于暫停治療常導(dǎo)致失去移植物。故為了維持移植物的有活力、有功能地整合，移植受體必需承受長期、非特異性免疫抑制的后果。這些后果包括感染和惡性化的危險增加，以及費用昂貴并有毒性。
相應(yīng)地便出現(xiàn)了對移植受體進(jìn)行改良的或更有效的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)治療的需求。尤其是需要對無需使全部T細(xì)胞受到免疫抑制的治療方法，即不會使移植受體輕易地發(fā)生惡性化和機會感染的治療方法。更重要的是，需要有對比現(xiàn)有治療用藥物毒性更小的治療。相似地，需要有能促進(jìn)移植物的持久、功能性整合，即堅持至治療過程終止之后的整合的治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的目標(biāo)是提供無需使全部T細(xì)胞受到免疫抑制便可減小逆適應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)劑。另一目標(biāo)是提供能促進(jìn)組織移植物在受體體內(nèi)功能性整合的免疫調(diào)節(jié)劑。另一目標(biāo)是提供能抑制對移植組織的免疫學(xué)排斥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑。又一目標(biāo)是提供能阻斷共同刺激信號向活化T細(xì)胞傳遞的免疫調(diào)節(jié)劑。一個特別目標(biāo)是提供用于治療方法中，尤其用于緩解或推遲對移植組織的免疫學(xué)排斥的治療方法中的CD40CD154結(jié)合阻斷物。又一特別目標(biāo)是提供減小逆適應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的藥物組合物及治療方案，這基本上靠聯(lián)合運用CD40CD154結(jié)合阻斷物及另一種免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑達(dá)到的。故本發(fā)明的一個特殊目標(biāo)是提供以聯(lián)合運用CD40CD154結(jié)合阻斷物及能封鎖經(jīng)由CD28的共同刺激的藥物為基礎(chǔ)的藥物組合物及治療方案。本發(fā)明的一個更通用目標(biāo)是提供抑制、緩解、減弱、推遲或逆轉(zhuǎn)移植組織衰竭或?qū)σ浦步M織的急性排斥的藥物組合物及治療方案。本發(fā)明的另一通用目標(biāo)是通過提供允許同種異體組織或異種組織向受體體內(nèi)功能性整合的免疫調(diào)節(jié)組合物而改進(jìn)組織移植物的可用性。一個更深入的通用目標(biāo)是預(yù)防、緩解、減小或治療由逆適應(yīng)性免疫應(yīng)答，包括T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病(如，胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥之類)及變態(tài)反應(yīng)性疾病引起的疾病狀態(tài)。
本發(fā)明依賴這樣一個發(fā)現(xiàn)，即單獨應(yīng)用CD40CD154結(jié)合阻斷物或與另一種免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用，可在不需要對受體免疫系統(tǒng)進(jìn)行全面抑制的情況下，減小、抑制、預(yù)防、推遲或逆轉(zhuǎn)受體對移植組織的逆適應(yīng)性免疫系統(tǒng)排斥作用。
本發(fā)明相應(yīng)地提供用于對移植組織受體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療的方法和組合物。第一個方法通過用CD40CD154(CD40L)結(jié)合阻斷物治療移植受體而抑制移植受體對組織移植物的排斥。該結(jié)合阻斷物可以是能阻斷共同刺激分子(這里為CD40配體，亦在本文中稱作5c8抗原、CD40L、CD154，領(lǐng)域內(nèi)亦稱gP39)與其相對應(yīng)或相關(guān)受體(此處為CD40)結(jié)合的任何藥物。優(yōu)選地，此結(jié)合阻斷物為抗CD40L化合物，即能結(jié)合CD40L(CD154)并因此能封閉、干擾或破壞CD40L結(jié)合CD40的能力的化合物。抗CD40L化合物的一個實例為單克隆抗體，尤其是具有美國專利5,474,771(其教導(dǎo)已列入本文作為參考)公布的5c8抗體的抗原特異性結(jié)合特點的抗體。
第二個方法通過用CD40CD154結(jié)合阻斷物，優(yōu)選用抗CD40L單克隆抗體，治療移植受體而延長組織移植物在受體體內(nèi)的存活時間。第三個方法通過用CD40CD154結(jié)合阻斷物，優(yōu)選用抗CD40L單克隆抗體治療移植受體而減輕移植組織衰竭的免疫學(xué)并發(fā)癥。即，該方法將抑制、阻礙、緩解或可測性減弱這類免疫學(xué)并發(fā)癥。具體地說，該方法可避免或緩解諸如間質(zhì)纖維樣變性、慢性移植物動脈粥樣硬化、脈管炎之類并發(fā)癥。
故前述的方法均對移植組織之急和/或慢性排斥反應(yīng)的治療有效，可作預(yù)防性使用，用于術(shù)后治療，或在受體有生之年的任何時期逆轉(zhuǎn)或阻止移植物排斥反應(yīng)。一個方法實例涉及在術(shù)后第2、4、6、8、12、16和28天時施用CD40CD154結(jié)合阻斷物。更常見為，本文所述方法涉及在跨越至少兩或三周的時間段內(nèi)以所需間隔(每天一次、一周兩次、一周一次或兩周一次)施用該結(jié)合阻斷物。用藥時間表可根據(jù)需要調(diào)整，以便使逆適應(yīng)性免疫應(yīng)答指標(biāo)(indicia)、尤其是移植物排斥指標(biāo)產(chǎn)生可測性減少。本發(fā)明治療方案可在移植物排斥反應(yīng)的后續(xù)發(fā)作中重復(fù)進(jìn)行。在以抗CD40L單克隆抗體作結(jié)合阻斷物的實施方案中，阻斷物的施藥劑量介于約5mg/kg體重和約20mg/kg體重之間。
為便于治療，CD40CD154結(jié)合阻斷物可配制成藥物組合物，其中有治療有效量的結(jié)合阻斷物分散于藥學(xué)上可接受的載體中。在某些實施方案中，藥物組合物也可包含治療有效量的另一種免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物，它們有但不限于阻斷經(jīng)由CD28的T細(xì)胞共同刺激信號傳導(dǎo)的藥物(如CTLA4Ig)；阻斷鈣調(diào)磷酸酶信號傳遞的藥物(如環(huán)孢菌素，大環(huán)內(nèi)酯如曾名為FK506的藤霉素)；皮質(zhì)類固醇；或抗增殖劑(如硫唑嘌呤)。其它適于與該CD40CD154結(jié)合阻斷物配合使用的治療有效性化合物包括西洛霉素(sirolimus)(曾名為納巴霉素)、霉酚酸莫非替克(mycophenolate mofetil，MMF)、咪唑立賓(mizoribine)、脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)、布瑞喹那鈉(brequinar sodium)、來氟米物(leflunomide)、阿扎斯哌然(azaspirane)等等。
本發(fā)明的方法及組合物適用于所有類型的移植程序。故本發(fā)明適用于移植受體(接受宿主)為哺乳動物，優(yōu)選為靈長類，更優(yōu)選為人類的情況下。移植物供體可以是與移植受體為同一系統(tǒng)發(fā)育物種的非同系成員(即提供同種異體移植組織的同種異體供體)，或是不同系統(tǒng)發(fā)育物種的成員(即提供異種移植組織的異種移植供體)。如果用異種供體作為移植組織的來源，優(yōu)選地該供體與受體具M(jìn)HC相對相容性；如狒狒或黑猩猩將優(yōu)選作為向人類提供移植組織的供體。本發(fā)明可用于促進(jìn)任何機體組織或器官類型的移植，不必考慮提供的(移植)組織是完整器官，還是器官或組織的部分，或是分離的細(xì)胞。適宜組織的非限制性實例有腎臟、肝臟、心臟、胰臟(如胰島)、皮膚、血管、神經(jīng)、骨、軟骨之類的哺乳動物機體組織。
如本文所公布，本發(fā)明原理經(jīng)相關(guān)的臨床前模型中的檢驗而證明有效。一個CD40CD154結(jié)合阻斷物的實例(抗CD40L單克隆抗體5c8)已單獨及與其它免疫調(diào)節(jié)劑實例(CD28結(jié)合阻斷物CTLA4-Ig；霉酚酸莫非替克；藤霉素)一起在恒河猴體外外周血白細(xì)胞上及在用初級脈管化腎臟同種異體移植物移植的恒河猴體內(nèi)進(jìn)行了檢驗。
本發(fā)明的前述及其它目標(biāo)、特點和優(yōu)點以及發(fā)明本身，將通過以下優(yōu)選實施方案的描述而得到更全面理解。
發(fā)明詳述過去20多年累積的資料證實T細(xì)胞的活化需要TCR介導(dǎo)的信號，還需要同時傳遞的共同刺激信號。如，在針對蛋白質(zhì)抗原的應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體需要與T淋巴細(xì)胞的特異性、共同刺激性相互作用。這種B細(xì)胞/T細(xì)胞相互作用通過除TCR參與之外還有多個受體-配體結(jié)合事件而介導(dǎo)完成。這些另外的結(jié)合事件包括B細(xì)胞上的CD40與T細(xì)胞上的CD154(CD40L)結(jié)合。人CD40是表達(dá)在成熟B細(xì)胞、以及巨噬細(xì)胞和活化內(nèi)皮細(xì)胞上的一種50KD的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。CD40屬于涉及細(xì)胞程序性死亡的受體類群，其中包括Fas/CD95和腫瘤壞死因子(TNF)α受體。人CD154(CD40L)是與暫時性基本表達(dá)在活化T細(xì)胞上的TNFα同源的一種32KD II型膜糖蛋白。CD40CD154的結(jié)合已顯示是所有依賴T細(xì)胞的抗體應(yīng)答所必需的。具體地說，CD40CD154結(jié)合提供了抗凋亡和/或淋巴因子刺激性信號。
另一種重要的共同刺激信號由T細(xì)胞上的CD28與抗原呈遞細(xì)胞(APC)和可能還有實質(zhì)細(xì)胞上的相應(yīng)受體CD80(B7-1)或CD86(B7-2)結(jié)合而產(chǎn)生。明顯地，CD80和/或CD86的表達(dá)由CD40與CD154結(jié)合產(chǎn)生的信號刺激而上調(diào)。進(jìn)一步研究顯示T細(xì)胞分子CTLA4(CD152)似乎下調(diào)共同刺激和TCR介導(dǎo)的活化，至少部分原因是CTLA4與CD28競爭CD80/CD86，并只向TCR信號傳導(dǎo)復(fù)合體傳送一個獨特的負(fù)信號。
CD40CD154結(jié)合在促進(jìn)T細(xì)胞依賴性生物學(xué)應(yīng)答中的重要性在缺乏功能性CD154的人體內(nèi)X連鎖的超IgM綜合征(X-HIGM)的病情發(fā)展中顯得尤為重要。這些病人有正常的或較高的IgM水平，但不能產(chǎn)生IgG、IgA或IgE抗體。被感染者出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作(有時是嚴(yán)重)的細(xì)菌感染(最常見肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的感染)和某些不太常見的寄生蟲感染，并且淋巴瘤和腹部癌癥的發(fā)生率增加。這些病癥的臨床表現(xiàn)可通過靜脈內(nèi)免疫球蛋白取代療法而得到控制。
X-HIGM的影響在CD154編碼基因為零合基因的動物(基因敲除動物)中得到模擬。用零合子進(jìn)行的研究證實，盡管B細(xì)胞無需CD40LCD154結(jié)合就能產(chǎn)生IgM，但它們不能進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換，或在親和性成熟之后不能正常存活。缺乏功能性CD40CD154相互作用時，淋巴結(jié)的生發(fā)中心不能正確發(fā)育，記憶B細(xì)胞的發(fā)育受損。這些缺陷造成再次(成熟)抗體應(yīng)答的嚴(yán)重減弱或完全缺乏。
伴有X-HIGH的個體和CD154零合子還有細(xì)胞免疫的缺陷。這些缺陷表現(xiàn)在增加了卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、莢膜組織孢漿菌(Histoplasma capsulatum)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)以及慢性蘭伯氏賈第鞭毛蟲(Giardia lambli)感染的發(fā)生率。鼠零合子不能抗利什曼原蟲感染。這些受細(xì)胞介導(dǎo)的缺陷中很多可通過施用IL-12或IFNγ而逆轉(zhuǎn)。這些資料證實了以下觀點即CD40CD154的結(jié)合啟動了I型T輔助細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答。進(jìn)一步的支持來自以下觀察所得即巨噬細(xì)胞活化在CD154缺陷體系中也是缺陷的，而對小鼠施用抗CD40L抗體可減弱它們清除肺囊蟲感染的能力。阻礙CD40CD154的結(jié)合將削弱巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的能力，而一氧化氮介導(dǎo)著巨噬細(xì)胞的多種促炎活性。但應(yīng)注意到，缺乏功能性CD154的哺乳動物(包括人類)發(fā)生病毒感染或膿毒的機率并不明顯。
一些臨床前研究證實，CD40CD154結(jié)合阻斷劑可作為免疫調(diào)節(jié)劑。在鼠中，抗CD154的抗體在體外和體內(nèi)均可阻斷針對外來抗原的初次和再次免疫應(yīng)答。抗CD154的抗體引起小鼠和猴生發(fā)中心的退化，這與在CD154免疫缺陷中獲得的資料一致。對三月齡的易患狠瘡的小鼠施用三劑抗CD154抗體，基本上降低了抗雙鏈DNA和核小體的滴度，推遲了嚴(yán)重腎炎的發(fā)生，并減少了死亡率。而且，對5至7月齡有嚴(yán)重腎炎的小鼠施用抗CD154抗體顯示能穩(wěn)定或甚至逆轉(zhuǎn)腎病。CD154抗體與小的靜止期同種異體淋巴細(xì)胞一起給予時可使小鼠胰島自體移植物無限期存活。在其它動物模型中，對CD40CD154結(jié)合進(jìn)行干擾已被證實能減輕自身免疫病(如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病)、移植物排斥反應(yīng)(心臟同種異體移植、移植物抗宿主病)和氯化汞誘導(dǎo)的腎小球腎炎(由體液和細(xì)胞機制共同介導(dǎo)產(chǎn)生)的癥狀。
對嚙齒動物的其它研究顯示，通過干擾CD80/CD86與其T細(xì)胞對應(yīng)受體CD28和CTLA4的結(jié)合，可阻止T細(xì)胞活化，并延長嚙齒動物同種異體移植物的存活時間。這些研究包括應(yīng)用CD80/CD86特異性融合蛋白CTLA4-Ig作為CD28信號傳導(dǎo)的阻斷物。其它研究已證實CD80/CD86的上調(diào)可通過應(yīng)用CD40CD154結(jié)合阻斷物(如單克隆抗體MRI)而阻止。兩類免疫調(diào)節(jié)劑的有效似乎均依賴于TCR的參與。故這些制劑能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性生物學(xué)過程的特異性，而不是依賴對所有T細(xì)胞進(jìn)行免疫抑制。在移植排斥反應(yīng)的嚙齒動物模型體內(nèi)應(yīng)用這些制劑的研究已產(chǎn)生驚人的結(jié)果(包括對完全不匹配的皮膚移植物的接受)，這是應(yīng)用目前可行的免疫抑制法無法獲得的一個結(jié)果。
但應(yīng)注意，以前報道的嚙齒動物體內(nèi)移植物長期存活的所有研究，當(dāng)在其它哺乳動物(尤其是靈長類)中檢驗時均告失敗，或產(chǎn)生無法接受的毒性。
相比之下，在此公布的本發(fā)明原理驗證研究表明，單獨應(yīng)用CD40CD154結(jié)合阻斷物，或聯(lián)合另一種免疫調(diào)節(jié)劑或免疫抑制劑(如CD28信號傳導(dǎo)阻斷物)使用時，可促進(jìn)異種(MHC不匹配的)供體組織在靈長類受體內(nèi)長期、無排斥性整合。令人鼓舞的是本文公布的治療方法相當(dāng)簡單(包括通過標(biāo)準(zhǔn)的外周靜脈導(dǎo)管施用治療劑)并很易被受體接受。這完全相反于為使移植物在靈長類被長期接受而用的其它治療方案(它們要求電離輻射、施用供體來源的骨髓、并進(jìn)行重要的周期性免疫抑制)。本文所述研究中治療的動物未見經(jīng)抗CD3抗體治療后通常能觀察到的T細(xì)胞活化或細(xì)胞因子釋放的征兆，延長存活期也不會有機會感染的明顯代價。此外，這些研究期間未見外周血的血液學(xué)參數(shù)有任何改變。長期存活時并不發(fā)生任何淋巴細(xì)胞亞群的明顯清除或全體退化，也沒有失去體外T細(xì)胞應(yīng)答性。故所觀察到的效應(yīng)不太可能是由于抗體或融合蛋白調(diào)理后T細(xì)胞毀滅造成的。這些結(jié)論仍有爭議。恒河猴遠(yuǎn)交系中的成功暗示同種異體移植(或甚至異種移植)整合可用這種或相當(dāng)?shù)闹委煼椒ㄔ谌梭w內(nèi)實現(xiàn)。
下述選擇性聯(lián)合治療中的機制及每種制劑的相對作用仍不清楚。CD40CD154阻斷單獨使用獲得成功暗示，在維持排斥應(yīng)答中任何基本的共同刺激性信號傳導(dǎo)都不及CD80/CD86的上調(diào)重要。確實，抗CD154抗體單獨施用時導(dǎo)致完全無排斥的存活，而CD28阻斷物(CTLA4-Ig)的效果則較為短暫。已知CD154表達(dá)在非髓樣細(xì)胞(包括血管內(nèi)皮和平滑肌)上，而CD80可誘導(dǎo)產(chǎn)生在成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞上，因此，在產(chǎn)生對抗供體組織的反應(yīng)中非T細(xì)胞事件可能比較關(guān)鍵。通過在移植時避免免疫系統(tǒng)接觸重要實質(zhì)粘附和共同刺激信號，可預(yù)防對移植物的識別和破壞。供體實質(zhì)誘導(dǎo)的活化作用與淋巴樣細(xì)胞誘導(dǎo)的活化作用之間的區(qū)別可解釋在移植物行使正常功能的情況下還發(fā)現(xiàn)了可維持對供體淋巴細(xì)胞的體外反應(yīng)性這一現(xiàn)象，以及為什么MLR反應(yīng)性與臨床移植結(jié)果之間一般很少有關(guān)聯(lián)性。盡管如此，共同刺激阻斷劑CTLA4-Ig和人源化5c8(抗人CD154)的效應(yīng)顯示無論在體外或體內(nèi)均有協(xié)同性。可能CTLA4-Ig可確保逃避了人源化5c8對CD40CD154結(jié)合的阻斷效應(yīng)的CD80/CD86表達(dá)受到對抗。此時，需要一定的時間發(fā)動對逃避了初始阻斷效應(yīng)的少數(shù)細(xì)胞的有效急性排斥反應(yīng)。
由于這一策略可成功逆轉(zhuǎn)已有的經(jīng)活檢證實的排斥反應(yīng)，表明排斥過程應(yīng)通過連續(xù)共同刺激維持，而不是一個一旦啟動便持續(xù)直至效應(yīng)細(xì)胞耗盡或不能提供TCR信號傳導(dǎo)為止的過程。就目的論而言，人體可通過易于控制的炎癥反應(yīng)而受到最好照顧。故在沒有攻擊指令時，就退卻到默許水平。這一點支持以下觀點利用免疫系統(tǒng)的天然下調(diào)傾向?qū)⒈热w免疫抑制更為優(yōu)越。
以下討論舉例說明了本發(fā)明實施內(nèi)容及實施環(huán)境，并提供了涉及本發(fā)明特殊實施方案的原理論證性研究。
受體宿主本發(fā)明可用于對組織移植物的任何哺乳動物受體，或需要組織移植物的任何哺乳動物進(jìn)行治療或預(yù)防。優(yōu)選地，受體(本文亦稱受體宿主，或簡稱宿主)為靈長類，更優(yōu)選為高等靈長類，最優(yōu)選為人類。在其它實施方案中，受體可以是另一種需要組織移植的哺乳動物，尤其是有重要商業(yè)用途的哺乳動物，或?qū)櫸锘蚱渌袃r值的動物，如瀕危物種的成員。故受體宿主還包括，但不限于綿羊、馬、牛、山羊、豬、狗、貓、兔、豚鼠、倉鼠、沙鼠、大鼠和小鼠。
供體或移植組織本發(fā)明可用于任何類型組織的移植或移植過程，尤其是供體(移植的)組織發(fā)生衰竭或被受體宿主的免疫系統(tǒng)排斥、或存在這類危險性的操作中。本發(fā)明尤其可用于供體組織與受體組織不相容的情況中。故除了自體的或同源的供體組織之外，本發(fā)明還可用同種異體或甚至異種的供體組織。該供體組織可通過常規(guī)方法得自志愿者或其它活的供體，或得自尸體供體。優(yōu)選地，供體與受體的組織相容性在可接受水平。故當(dāng)受體為人時，自體和同種異體供體組織為優(yōu)選。但供體組織可得自異種動物(此時它稱為異種移植物)，如非人靈長類(如黑猩猩或狒狒)，或相對可相容的其它哺乳動物(如豬)。
在一些實施方案中，供體組織包含器官或部分機體。在其它實施方案中，供體組織包括供體器官或組織的一部分或活檢標(biāo)本。在另外的實施方案中，供體組織包含細(xì)胞，尤其是分離的或懸浮的細(xì)胞，包括取自或切自供體宿主的細(xì)胞，維持在原代培養(yǎng)中的細(xì)胞，或永生化的細(xì)胞系。供體組織還可選擇地包括攜有外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞，如已經(jīng)遺傳改造而包含產(chǎn)生對受體有治療價值的多肽所必需遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(或衍生自已經(jīng)上述改造的始祖細(xì)胞的細(xì)胞)。在又另外的實施方案中，供體組織可衍生自己經(jīng)遺傳改造而包含可在某些或全部機體組織中產(chǎn)生對受體有治療價值的多肽所必需遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。對受體有治療價值的多肽實例有激素，如胰島素或生長激素；細(xì)胞因子；生長及分化因子；酶；結(jié)構(gòu)蛋白；等等。
故由前述，很明顯本發(fā)明可用于如下實體器官移植物移植的腎、肝、胰、肺、心臟等等。相似地，本發(fā)明可用前述各器官的一個部分，也可用于其它組織類型，特別是腎、肝、胰(尤其是胰島)、呼吸道、心臟、皮膚、脈管、神經(jīng)、骨、骨髓、軟骨、肌腱、韌帶、肌肉、脂肪、乳房、胃腸道、上皮、內(nèi)皮、結(jié)締組織等。而且，本發(fā)明可用于含多種組織類型的軀體部分，如用于眼、耳、鼻、手指或足趾、關(guān)節(jié)、血管、神經(jīng)、肌肉、四肢或其它軀體部分的更換或其它外科改變或重建中。在另外的實施方案中，本發(fā)明可用于細(xì)胞制備物或懸浮液，其導(dǎo)入受體的全身或局部。例如，分離的、懸浮的或分散的細(xì)胞可靜脈注入或埋入所希望的位置(如骨髓腔、肝臟、腎囊內(nèi)或關(guān)節(jié)囊內(nèi))或肌肉注射或局部用于受傷部位。細(xì)胞實例包括外周血細(xì)胞、骨髓或它的任何造血成分、間充質(zhì)干細(xì)胞、肌衛(wèi)星細(xì)胞、肝細(xì)胞、激素生產(chǎn)細(xì)胞或神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)嵴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等等。在某些實施方案中，細(xì)胞均能有絲分裂并產(chǎn)生供體源的新組織。在另外的實施方案中，細(xì)胞不能有絲分裂，但產(chǎn)生或表達(dá)對受體有治療價值的多肽或其它產(chǎn)物。
CD40CD154阻斷物實例可用于本發(fā)明之方法的治療性化合物包括任何可阻斷細(xì)胞表面CD40(如B細(xì)胞上)與表達(dá)在活化T細(xì)胞表面上的CD40L(CD154)相互作用的化合物。具體涉及的CD40CD154結(jié)合阻斷物化合物，如抗CD40L化合物，包括多克隆抗體和單克隆抗體(mAb)，以及抗體衍生物如嵌合分子、人源化分子、有減低的效應(yīng)物功能的分子、雙特異性分子及抗體的偶聯(lián)物。在一個優(yōu)選實施方案中，該抗體是5c8(由美國專利號5,474,771所述，該文獻(xiàn)全文引入本文作為參考)。在一個當(dāng)前極為優(yōu)選的實施方案中，該抗體為人源化5c8。其它已知抗CD154抗體包括抗體ImxM90，ImxM91和ImxM92(得自Immunex)，由Ancell公司提供的商品化抗CD40L mAb(克隆24-31，產(chǎn)品目錄號353-020，Bayport，MN)，及由Genzyme公司提供的商品化抗CD40L mAb(劍橋，MA，產(chǎn)品目錄號80-3703-01)。其它商品化產(chǎn)品還有PharMingen公司的抗CD40L mAb(圣迭哥，產(chǎn)品目錄號33580D)。另有很多抗CD40L抗體已經(jīng)生產(chǎn)并被鑒定(見，如，Bristol-Myers Squibb的WO 96/23071，其說明書已引入本文作為參考)。
本發(fā)明還包括其它類型的抗CD40L分子，如完整Fab片段，F(xiàn)(ab′)2化合物，VH區(qū)，F(xiàn)V區(qū)，單鏈抗體(見，如WO 96/23071)，多肽，多肽的融合構(gòu)建體，CD40的融合體(如已引入本文作為參考的Hollenbaugh等，免疫學(xué)方法雜志1881-7，1995中的CD40Ig)，以及小分子化合物如小的半肽化合物或非肽化合物，以上所有分子均能封閉或阻礙CD40CD154的結(jié)合。有關(guān)設(shè)計、篩選和優(yōu)化小分子的程序提供在專利申請PCT/US96/10664(1996年6月21日提交，其說明書引入本文作為參考)中。
抗體的各種形式也可用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)(Winter和Milstein，自然349293-99，1991)。例如，可構(gòu)建成“嵌合”抗體，其中動物抗體的抗原結(jié)合區(qū)與人類恒定區(qū)相連(最初衍生自非人類清乳動物的抗體，其中應(yīng)用重組DNA技術(shù)使絞鏈區(qū)和重鏈恒定區(qū)和/或輕連恒定區(qū)的全部或部分被人類免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應(yīng)區(qū)所取代)(見，如Cabilly等，美國專利號4,816,567；Morrison等，美國國家科學(xué)院學(xué)報816851-55，1984)。嵌合抗體應(yīng)用于人類臨床治療時可減少由動物抗體所引起的免疫原性應(yīng)答。
此外，可合成重組“人源化”抗體。人源化抗體是最初來自非人類哺乳動物，但其中已應(yīng)用重組DNA技術(shù)將非抗原結(jié)合所必需的部分或全部氨基酸替換成人免疫球蛋白輕鏈或重鏈相應(yīng)區(qū)氨基酸的抗體。即，它們是包含盡可能多的人免疫球蛋白序列，但其中已插入負(fù)責(zé)特異性抗原結(jié)合的區(qū)域的嵌合體(見，如PCT專利申請WO 94/04679)。動物用所希望的抗原免疫，分離相應(yīng)抗體并分出負(fù)責(zé)特異性抗原結(jié)合的可變區(qū)序列部分。然后將此動物源性抗原結(jié)合區(qū)克隆進(jìn)已缺失抗原結(jié)合區(qū)的人源抗體基因的適當(dāng)位置。人源化抗體可使應(yīng)用于人類治療的抗體中所用異源(種間)序列最少化，從而很少引起不需要的免疫應(yīng)答。靈長類化的抗體可類似于此產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一個實施方案包括可產(chǎn)生于非人類哺乳動物(如攜帶一個或多個人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物)中的人類抗體的應(yīng)用。這些動物可作為雜交瘤生產(chǎn)的脾細(xì)胞來源，如U.S.5,569,825所示。
抗體片段和單價抗體也可用于本發(fā)明的方法和組合物中。單價抗體包含結(jié)合了另一種重鏈的Fc(或主干)區(qū)的重鏈/輕鏈二聚體。“Fab區(qū)”指大體上等價于或類似于含重鏈Y分枝區(qū)部分的序列及完整輕鏈的那些鏈部分，它們聚集在一起(成為聚集物)則顯示有抗體活性。Fab蛋白包括一條重鏈和一條輕鏈的聚集物(通常稱Fab′)，也包括對應(yīng)于抗體Y兩個分支片段的四聚體(通常稱F(ab)2)，其中任何一個分支片段均共價或非共價聚集，從而能與某種特殊抗原或抗原家族選擇性反應(yīng)。
此外，標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)可用于改變重組抗體對它們的抗原的結(jié)合親和力，方法是改變抗原結(jié)合位點附近的氨基酸殘基。人源化抗體的抗原結(jié)合親和力可通過基于分子模擬的誘變技術(shù)而提高(Queen等，美國國家科學(xué)院學(xué)報8610029-33，1989；PCT專利申請WO94/04679)。根據(jù)所靶向組織類型或所設(shè)想治療時間表的不同，有可能需要使抗體與CD40L的親和力提高或降低。這一點可應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)來進(jìn)行(見，如，Winter等，免疫學(xué)年鑒12433-455，1994；和Schier等，分子生物學(xué)雜志25528-43，1996，全文引入本文作為參考)。例如，進(jìn)行半預(yù)防性治療時，用固定水平的對CD40L親和力降低的抗體治療病人比較有利。相似地，對CD40L親和力提高的抗體對短期治療比較有利。
給藥途徑本發(fā)明的化合物可用醫(yī)學(xué)上可接受的任何方式給藥。根據(jù)具體情況的不同，可選用局部或全身用藥。優(yōu)選化合物經(jīng)非胃腸道途徑給藥，如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、眼窩內(nèi)、心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、包膜下、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、或鼻內(nèi)注射、輸入或吸入?；衔镆嗫赏ㄟ^在供體組織植入前或后向受體植入輸入泵，或生物相容性或生物可蝕性緩釋植入物而給藥?；蛘撸景l(fā)明的特定化合物，或它們的配制物，可適合于口服或腸道給藥。還有本發(fā)明的其它化合物可適合于局部給藥。
總而言之，本發(fā)明的化合物將施用于受體。但化合物也可施用于供體，或供體組織。例如，本發(fā)明之化合物可包含在將供體組織整合進(jìn)受體之前保存或運輸供體組織的灌流液或保存液中。
治療的劑量和頻率施用于免疫綜合性疾病患者的任何特殊化合物的劑量及用藥頻率是組織移植領(lǐng)域的一般執(zhí)業(yè)者如外科移植大夫的技術(shù)和臨床判斷范圍之內(nèi)。通過涉及深入但卻是常規(guī)的對化合物最佳用藥參數(shù)進(jìn)行測定的臨床前及臨床試驗研究可確立總劑量和用藥方案。即使在提出了這些建議之后，執(zhí)業(yè)者還經(jīng)常基于不同考慮，如病人的年齡、病情、體重、性別及同時參與治療的其它藥物，而改變不同受體的給藥劑量。確定用于抑制移植排斥反應(yīng)的每種抗CD40L化合物的最佳劑量和用藥方案對于藥學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言屬于常規(guī)程序。
通常，用藥頻率由主治醫(yī)師或類似的熟練執(zhí)業(yè)者確定，并有可能包含較高用藥頻率階段(如每天或每周一次)與較低用藥頻率階段(如每月或更長時間一次)的交替給藥方案。
為舉例說明抗CD40L化合物的用藥思想，給出下述抗CD40L mAb的一些用藥策略實例。用藥量可根據(jù)其它類型的抗CD40L化合物而很容易作出調(diào)整。通常，單次劑量在約0.05和約50mg/kg病人體重之間，最常見1-20mg/kg范圍內(nèi)。緊急情況下治療時，如移植前或移植時，或在有移植物排斥反應(yīng)已經(jīng)開始的征兆時，抗體的有效劑量范圍從約1mg/kg體重至約20mg/kg體重，在約1至5天的時間內(nèi)每天用藥，優(yōu)選靜脈內(nèi)施用大藥丸。相同的劑量和用藥時間表可用于移植物維持方案中的移植時期，維持期內(nèi)靜脈或肌肉內(nèi)施用約0.1mg/kg體重至約20mg/kg體重的抗體，針對任意部位，治療間隔從一周至3個月不等。慢性治療也可執(zhí)行維持方案，其中抗體經(jīng)靜脈或肌肉內(nèi)途徑施用，劑量從約0.1mg/kg體重至20mg/kg體重，用藥間隔時間從約1周至約3個月不等。此外，慢性治療可采用不連續(xù)的靜脈內(nèi)藥丸方案，其中施用的抗體在約1.0mg/kg體重和約100mg/kg體重之間，連續(xù)治療的間隔時間從1個月至6個月不等。除了不連續(xù)的藥丸方案外，其它所有方案的用藥也可采用口服、肺內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下途徑。
根據(jù)本發(fā)明抑制移植物排斥反應(yīng)的另一可互換實施方案，抗體的有效率可因為連續(xù)用藥或與傳統(tǒng)的抗排斥治療劑或藥物(如皮質(zhì)類固醇或免疫抑制劑)聯(lián)合應(yīng)用而提高。或者，這些抗體可偶聯(lián)至傳統(tǒng)的藥劑上。這將有利于使傳統(tǒng)藥劑的用量少于傳統(tǒng)劑量，如比單用時少用約50％的傳統(tǒng)劑量。相應(yīng)地，可避免發(fā)生與該傳統(tǒng)藥劑相關(guān)的很多付作用。
根據(jù)本發(fā)明對移植物排斥反應(yīng)進(jìn)行治療的聯(lián)合治療法包括應(yīng)用抗CD40L抗體的同時還應(yīng)用靶向B細(xì)胞的藥劑如抗CD19、抗CD-28或抗CD20抗體(未偶聯(lián)的或放射標(biāo)記的)、IL-14拮抗物、LJP394(LaJollaPharmaceutical受體封閉物)、IR-1116(Takeda小分子)和抗Ig獨特型單克隆抗體。或者，聯(lián)合用藥可包括靶向T細(xì)胞/B細(xì)胞的藥劑如CTLA4Ig、IL-2拮抗物、IL-4拮抗物、IL-6拮抗物、受體拮抗物、抗CD80/CD86單克隆抗體、TNF、LFA1/ICAM拮抗物、VLA4/VCAM拮抗物、brequinar和IL-2毒素偶聯(lián)物(如DAB)、強的松、抗CD3MAb(OKT3)、霉酚酸莫非替克(MMF)、環(huán)磷酰胺，及其它免疫抑制劑如鈣調(diào)磷酸酶信號傳導(dǎo)阻斷劑(包括但不限于藤霉素(FK506))。聯(lián)合用藥也可包括靶向T細(xì)胞的藥物如CD4拮抗物、CD2拮抗物及IL-12。
為維持移植物的整合，或在對急性移植物排斥反應(yīng)進(jìn)行抑制后的一個階段內(nèi)，若有必要則單獨或與傳統(tǒng)的抗排斥劑聯(lián)合施用維持劑量的抗CD40L抗體。隨后，可降低用藥劑量和/或頻率。當(dāng)不再有移植物排斥的表現(xiàn)時，可停止治療，但仍嚴(yán)密監(jiān)控有關(guān)移植物排斥反應(yīng)的任何征兆。在其它由普通執(zhí)業(yè)者確定的治療中，治療可以是偶爾為之，如間隔4周或更長時間一次。但受體將需要在較長時期內(nèi)接受間斷性治療以防止病情復(fù)發(fā)。
配方通常，本發(fā)明的化合物懸浮、溶解或分散于藥學(xué)可接受的載體或賦形劑中。所得藥物組合物對受體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，尤其電解質(zhì)平衡沒有負(fù)面影響。故一個載體實例包含生理鹽水(0.15M NaCl，pH 7.0-7.4)。其它可接受的載體為領(lǐng)域內(nèi)熟知并描述在，如，Remington制藥學(xué)，Gennaro編，Mack Publishing公司，1990?？山邮艿妮d體可包括生物相容性、惰性或生物可吸收性鹽，緩沖劑，寡糖或多糖，聚合物，粘度改善劑，防腐劑之類。
本發(fā)明的方法中所用抗CD40L化合物以藥學(xué)有效性或治療有效性劑量施用，該劑量足以對有可能發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生移植物排斥反應(yīng)的受體產(chǎn)生可檢測的，優(yōu)選較有利的醫(yī)療效應(yīng)。較有利醫(yī)療效包括防止、推遲或減少受體病情的惡化，或?qū)Ω纳剖荏w病情有可以檢測的效果。如在一例腎同種異體移植或異種移植中，腎功能及健康狀況可用一項或多項常規(guī)實驗室檢驗進(jìn)行監(jiān)控，這些檢測是測量血或尿中相關(guān)物質(zhì)的濃度，其它尿特征，或各種物質(zhì)從血向尿中清除的速率。由這些檢測測得的參數(shù)，可被醫(yī)生單獨或綜合用于評估腎功能或腎損害。這些參數(shù)的實例有尿素、肌酸酐或蛋白質(zhì)的血液濃度；蛋白質(zhì)或各種血細(xì)胞如紅細(xì)胞或白細(xì)胞的尿濃度；尿的比重；尿量；菊粉、肌酸酐、尿素或?qū)Π被R尿酸的清除速率；以及是否有高血壓或水腫。
作為本發(fā)明方法的臨床應(yīng)用特例，在腎移植受體體內(nèi)，手術(shù)前后或出現(xiàn)移植物排斥征兆后施用抗CD40L MAb(如hu5c8)。急性腎同種異體移植物排斥反應(yīng)可有多種表現(xiàn)，包括血清肌酸酐或血尿氮的增加，尿排泄的減少、蛋白尿和/或血尿的加重，或其它移植物排斥反應(yīng)的表現(xiàn)。免疫調(diào)節(jié)治療的劑量和時間進(jìn)程應(yīng)足以使這些表現(xiàn)中的一個或多個產(chǎn)生臨床有利的改變。本文中的原則論證性研究中給出了一個時間進(jìn)程和劑量安排的實例。但最起碼，治療應(yīng)涉及靜脈內(nèi)施用多達(dá)50mg/kg的CD40CD154結(jié)合阻斷物(例如hu5c8藥丸，初次治療后兩周內(nèi)或直至移植物排斥或衰竭的指征有預(yù)期的有利變化之前，要采取相應(yīng)的后續(xù)用藥方案(如每天靜脈或皮下注射)。
另一個實例是，對于有其它器官排斥的受體，可以類似于上述的形式施用抗CD40L化合物。例如，肝移植的急性排斥導(dǎo)致黃疸(高膽紅素血癥)、肝炎(轉(zhuǎn)氨酶水平升高)、凝血病和腦病。
評估CD40CD154阻斷物治療方案的臨床前模型系統(tǒng)用于檢驗CD40CD154阻斷化合物(如抗CD40L化合物，如mAb5c8)療效的模型系統(tǒng)優(yōu)選實例為靈長類腎同種異體移植模型，其描述見此前相關(guān)美國臨時申請流水號60/049,389(06/11/97)及Kirk等(1997)，94美國國家科學(xué)院學(xué)報8789-8794，其教導(dǎo)引入本文作參考。此恒河猴模型已多次顯示可對免疫操作進(jìn)行嚴(yán)格檢驗它對同種異體移植物功能的極微小改變，或?qū)κ荏w傷口恢復(fù)和免疫系統(tǒng)功能的負(fù)面效應(yīng)極其敏感。此外，它與人類腎移植有顯著生物學(xué)相似性。具體地說，編碼MHC蛋白的基因在恒河猴和人之間高度保守，而且恒河猴模型對血管化器官的排斥反應(yīng)與臨床所見極其類似。
該模型系統(tǒng)適于評估含腎組織的移植物。領(lǐng)域內(nèi)已認(rèn)可的其它臨床前模型(尤其是靈長類)均適用于評估其它移植組織類型如肝、心臟、肺、胰臟、胰島、皮膚、外周或中樞神經(jīng)，或其它組織或器官類型的移植效力。
材料和方法藥物人CTLA4-Ig和對照融合蛋白-IgG1如前述制備并載于GeneticsInstitute，Cambridge，MA的溶液中?？笴D40配體的抗體(人源化5c8)如前述制備并載于Biogen公司，Cambridge，MA的溶液中。倉鼠抗小鼠CD28單克隆抗體PV-1(IgG1，克隆G62)從雜交瘤培養(yǎng)物上清中純化并用作獨特型單克隆抗體對照。
MHC定型和供體/受體選擇供體-受體對和提供第三方細(xì)胞的動物根據(jù)MHC I類和II類遺傳性不相同原則進(jìn)行選擇。I類不一致性由前述單向等電聚集確定。II類不一致性根據(jù)單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MIR)的結(jié)果確定。此外，動物的DRB位點經(jīng)變性梯度凝膠電泳和對DRB第二個外顯子的直接測序(如前述)檢驗證實各不相同。體外針對所有供體-受體對證實受體對供體的強烈T細(xì)胞應(yīng)答。此研究中所述實驗按“實驗動物的護理和應(yīng)用”實驗動物資源研究所，國家研究會(National Research Council)，DHHS，Pub.No.NIH 86-23(1985)所列舉的原則進(jìn)行。
體外細(xì)胞分析單向MLR在移植前的所有動物身上以及移植100天后仍存活并無排斥反應(yīng)的動物身上進(jìn)行。每只動物針對所有可能的供體進(jìn)行檢驗以確定移植的最佳反應(yīng)對。將反應(yīng)細(xì)胞(3×105)與輻射刺激細(xì)胞(1×105)在37℃溫育5天。細(xì)胞用3H-胸苷作脈沖標(biāo)記，根據(jù)3H-胸苷的摻入監(jiān)控其增殖。用伴刀豆球蛋白A(25mcg/ml)多克隆刺激作陽性對照。刺激指標(biāo)在對自身反應(yīng)性(所有例子中均接近本底摻入量)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后計算。為進(jìn)行體外劑量反應(yīng)研究，將CTLA4-Ig或人源化5c8在第1天以100mcg/ml-0.01mcg/ml的濃度加入MLR。聯(lián)合處理的方式是改變CTLA4-Ig的濃度而將人源化5c8的濃度穩(wěn)定在50mcg/ml。
外周血淋巴細(xì)胞表型分析在移植前以及藥物治療期間和之后分階段進(jìn)行。試驗評估了用磷酸鹽緩沖液和1％胎牛血清稀釋的肝素化全血共0.2ml。FITC標(biāo)記的T11，B1(Coulter)和FN18(Dr.David M.Neville，Jr.惠贈)單克隆抗體分別用于評估CD2陽性細(xì)胞(T細(xì)胞/NK細(xì)胞)、CD20陽性細(xì)胞(B細(xì)胞)、及CD3陽性細(xì)胞(T細(xì)胞)的百分率。血中紅細(xì)胞在染色后經(jīng)ACK裂解液(0.15M NH4Cl，1.0mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA，pH 7.3)處理后從制劑中除去。細(xì)胞馬上或在1％多聚甲醛中固定后經(jīng)流式細(xì)胞儀計數(shù)。流式細(xì)胞儀計數(shù)在Becton DickinsonFACSCAN上進(jìn)行。
腎同種異體移植腎同種異體移植如前述進(jìn)行。簡短而言，遠(yuǎn)交系幼齡(1至3歲)恒河猴(猴免疫缺陷病毒、猴逆轉(zhuǎn)錄病毒和乙型皰疹病毒血清陰性)得自靈長類動物中心(Wisconsin大學(xué))或LABS(Yemassee，SC)。全過程在使用氯胺酮(肌內(nèi)注射1mg/kg)、甲苯噻嗪(肌內(nèi)注射1mg/kg)及氟烷(1％吸入)作一般性麻醉的情況下完成。移植在由上述MHC分析所確定的遺傳上相區(qū)別的供體-受體對之間進(jìn)行。動物在器官收獲和植入期間被肝素化(100單位/kg)。同種異體移植物的植入采用標(biāo)準(zhǔn)微脈管技術(shù)在供體腎動脈和受體主動脈末端之間以及供體腎靜脈與受體腔靜脈之間產(chǎn)生末端側(cè)接吻合。然后施初級輸尿管膀胱吻合術(shù)。閉合之前完成內(nèi)部雙側(cè)腎切除術(shù)。
動物經(jīng)靜脈內(nèi)液體處理近36小時，直至口腔吸收適量為止。甲氧芐氨嘧啶-磺胺(Trimethaprim-sulfa)施用3天以進(jìn)行術(shù)后抗生素預(yù)防。每只動物手術(shù)當(dāng)天接受81mg阿斯匹林。密切關(guān)注是否需要鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)痛的維持為肌內(nèi)注射環(huán)丁甲二羥嗎喃。動物每周稱體重。7至10天后皮膚拆線。靜脈內(nèi)施用CTLA4-Ig和/或人源化5c8，其劑量和用藥安排根據(jù)對相應(yīng)藥物的累積經(jīng)驗進(jìn)行變化。不再施用其它免疫藥物。每隔一天測定血清肌酸酐，和全血電解質(zhì)Na+，K+，Ca2+，以及血紅蛋白，直至它們的水平達(dá)到穩(wěn)定，然后每周測一次。
病理學(xué)分析用20號針頭核心裝置(Biopty-Cut，Bard)對疑有排斥反應(yīng)的動物進(jìn)行活檢。在冰凍的或福爾馬林固定的組織上用蘇木素和伊紅進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)染色，以證實對排斥反應(yīng)的診斷。無尿時或體重比移植前減少15％(根據(jù)AAALAC標(biāo)準(zhǔn))時將動物處死。所有動物死亡時接受全面的大致觀察和組織病理學(xué)評估。
結(jié)果CTLA4-Ig和人源化5c8均以劑量依賴形式抑制了恒河猴的MLR。但CTLA4-Ig作為單獨用藥物比人源化5c8在阻止T細(xì)胞增殖方面更有效。胸苷摻入量的顯著減少在CTLA4-Ig濃度為0.1mcg/ml時可觀察到，濃度更高時獲得更進(jìn)一步的抑制。當(dāng)人源化5c8濃度為0.01mcg/ml時增殖略有減少，但濃度增加并未使抑制作用實質(zhì)性加強。當(dāng)同時檢驗二者時，兩種藥物一起對增殖的抑制比每個藥物單用更有效約100倍。對3只未接受任何處理的動物分別重復(fù)劑量應(yīng)答研究，得到相同結(jié)果。故CTLA4-Ig和人源化5c8可協(xié)同防止體內(nèi)對同種異體移植物的排斥反應(yīng)。
共完成12例腎同種異體移植。4只動物在無任何免疫學(xué)干擾的情況下接受移植。這些動物在第5，7，7和8天內(nèi)發(fā)生排斥。對它們的腎進(jìn)行組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)有以間質(zhì)滲出和管狀淋巴細(xì)胞浸潤為特征的急性細(xì)胞排斥反應(yīng)，并伴有水腫和細(xì)胞壞死。一只動物在移植當(dāng)時便開始接受為期5天的CTLA4-Ig(10mg/kg/d)，其移植物存活期延長至20天。移植失敗是由于與對照動物中所見幾乎沒有區(qū)別的細(xì)胞排斥反應(yīng)。一只動物在移植當(dāng)天用CTLA4-Ig 20mg/kg處理，然后接受為期12天的每隔一天10mg/kg處理，移植物存活時間延長至30天。同樣，移植失敗是由于急性細(xì)胞排斥反應(yīng)。根據(jù)前面已發(fā)表的對大鼠異位心臟同種異體移植模型所作研究，上述兩只動物在移植當(dāng)時接受供體特異性淋巴節(jié)衍生的淋巴細(xì)胞(108)的輸液。
兩只動物單用人源化5c8處理。它們均在手術(shù)當(dāng)天開始每隔一天接受20mg/kg，持續(xù)至術(shù)后14天(共8劑)。兩只動物無排斥反應(yīng)的存活期延長，只是在術(shù)后第二和第四周內(nèi)有短暫的肌酸酐水平升高。兩只動物在術(shù)后95-100天期間發(fā)生排斥。對每只動物進(jìn)行活檢以證實診斷。兩只動物隨后再用7劑人源化5c8處理(20mg/kg；一只動物每隔一天一次，另一只動物每天一次)，它們均恢復(fù)了正常的移植物功能，沒有可察覺的副效應(yīng)。它們保持活性及較佳狀態(tài)超過150天(移植后)。
兩只動物移植后各接受20mg/kg CTLA4-Ig和人源化5c8。同樣，每種藥從術(shù)后當(dāng)天開始每隔一天給一次，持續(xù)至術(shù)后14天。一只動物在術(shù)后32天發(fā)生排斥。另一只保持無排斥狀態(tài)直至100天，但象那些只用人源化5c8處理的動物一樣，排斥在100天時發(fā)生。相似地，活檢顯示有急性細(xì)胞排斥反應(yīng)。重復(fù)最初的CTLA4-Ig和人源化5c8給藥方案，動物的肌酸酐水平回復(fù)至基線值(1.0)。如此處理后的MLR分析顯示了反應(yīng)力的供體特異性喪失。第三者應(yīng)答性仍保持著。移植后165天，根據(jù)實驗程序的要求，處死體重?fù)p失的動物。此時移植物功能正常。尸檢中發(fā)現(xiàn)動物有志賀氏菌和彎曲桿菌小腸結(jié)腸炎(恒河猴的常見感染)。此病在最初的靈長類群落已感染了很多動物，包括一些未接受治療的動物。未見其它病理學(xué)異常；具體地說，沒有淋巴細(xì)胞增生性疾病或機會感染的表現(xiàn)。就組織學(xué)而言，移植物在小間隙中有隔離的淋巴細(xì)胞網(wǎng)，但未見血管浸潤、腎小球損傷或?qū)嵸|(zhì)壞死。
象只接受人源化5c8治療的動物一樣，這兩只動物在術(shù)后第4周內(nèi)有暫時性肌酸酐增多及移植物體積增大。推測這種移植物腫脹反映了第二輪淋巴細(xì)胞浸潤，因此改變用藥時間表，使兩種藥物均在手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后2，4，6，8，12，16和28天給予。
兩只動物用這一修改后方案進(jìn)行治療。均表現(xiàn)為無排斥的存活，無疾病或腎功能的改變，此狀態(tài)維持了150天以上。無排斥存活100天后，重復(fù)對供體細(xì)胞和第三方細(xì)胞進(jìn)行MLR。未見體外反應(yīng)性有何改變。無排斥存活150天后重復(fù)這些研究得到相同結(jié)果。兩只動物均保持了對供體和第三方細(xì)胞的強有力體外應(yīng)答，但卻不能排斥它們的同種異體移植物。無一動物顯示所用治療方法存在毒性。具體地說，沒有發(fā)現(xiàn)發(fā)燒、厭食癥、血液動力學(xué)異常，也沒發(fā)生機會感染。動物以標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)并允許與群體內(nèi)其它動物接觸。它們保持正常體重。實驗室化學(xué)和血液學(xué)參數(shù)如血紅蛋白和白細(xì)胞計數(shù)一直正常。表達(dá)CD2，CD3和CD20的細(xì)胞的百分率未受任何治療方案的影響。具體地說，任何動物在治療期間或之后都未見T細(xì)胞計數(shù)的減少。
用靈長類腎同種異體移植模型系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步臨床前研究隨后用上述靈長類腎同種異體移植系統(tǒng)檢驗各種其它和/或更精確的治療方案，即只用人源化mAb 5c8進(jìn)行治療，或聯(lián)合另一種治療劑，如CTLA4-Ig、MMF、藤霉素、皮質(zhì)類固醇或它們的混合物進(jìn)行治療。
對靈長類腎同種異體移植的單劑治療兩只動物接受了5c8單劑治療，治療的誘導(dǎo)和維持方案如下誘導(dǎo)治療包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用20mg/kg 5c8，其中第0天為施行同種異體腎移植術(shù)的當(dāng)天。維持治療包括從研究的第28天開始每月施用20mg/kg 5c8。接受治療的動物分別在研究的第170天和163天監(jiān)控其淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)和/或血清肌酸酐水平，顯示它們保持了對移植物基本無排斥的狀態(tài)。
另兩只動物接受5c8單劑治療的標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案和低劑量維持方案如下誘導(dǎo)治療包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用20mg/kg 5c8(第0天為腎同種異體移植術(shù)當(dāng)天)。維持方案包括從研究的第28天開始每月施用10mg/kg 5c8。接受治療的動物分別在研究的149天和148天保持了對移植物的基本無排斥狀態(tài)。
又有兩只動物接受了用低劑量誘導(dǎo)方案和低劑量維持方案進(jìn)行的5c8單劑治療，如下誘導(dǎo)治療包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用10mg/kg 5c8(第0天為腎同種異體移植術(shù)當(dāng)天)。維持方案包括從研究的第28天開始每月施用10mg/kg 5c8。接受治療的動物保持對移植物的基本無排斥分別至研究的第38天和9天。
還有兩只動物接受了用更低劑量誘導(dǎo)治療并用更低劑量維持方案的5c8單劑治療，如下誘導(dǎo)治療包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用5mg/kg 5c8(第0天為腎同種異體移植術(shù)當(dāng)天)。維持方案包括自研究的第28天開始每月施用5mg/kg 5c8。接受治療的動物在研究的第7-10天對腎移植物發(fā)生排斥。
對靈長類體內(nèi)腎同種異體移植物的聯(lián)合治療所有動物都接受用上述標(biāo)準(zhǔn)的20mg/kg誘導(dǎo)及20mg/kg維持方案進(jìn)行的5c8治療，與此同時還聯(lián)合其它免疫抑制治療方案，如下三只動物接受包括治療有效量的皮質(zhì)類固醇(如6甲氫化強的松龍，采用為期5天的誘導(dǎo)治療)和霉酚酸莫非替克(MMF；20mg/kg po BID)的聯(lián)合治療。這些動物分別將對移植物的基本無排斥狀態(tài)保持到研究的第143天，81天和80天。相比之下，一只用相似劑量MMF和糖皮質(zhì)激素治療但未接受5c8治療的動物在研究的第7天對腎移植物產(chǎn)生排斥。
另兩只動物接受了包括治療有效劑量(1.5-2mg/kg po BID，targettrough 10ng/ml)的免疫抑制劑藤霉素(以前稱FK506)的聯(lián)合治療。受治動物保持基本無移植物排斥反應(yīng)分別直至研究的31和36天。
又有兩只動物接受了包括治療有效劑量的CTLA4-Ig的聯(lián)合治療。它們分別保持基本無移植物排斥反應(yīng)的狀態(tài)至研究的122和3天。
根據(jù)臨床前模型研究所得出的結(jié)論綜合上述結(jié)果，說明用CD40CD154結(jié)合阻斷物人源化5c8單獨誘導(dǎo)移植物的整合可導(dǎo)致同種異體移植組織長期存活。人源化5c8的效應(yīng)與CD28信號傳導(dǎo)阻斷物CTLA4-Ig的效應(yīng)有聯(lián)合協(xié)同性，而且與一些已知的免疫抑制劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑相容。
等價內(nèi)容本發(fā)明可以在不脫離其精神或基本特征的前體下實施其它特殊形式。故前述實施方案均應(yīng)看作對本文公布的發(fā)明的舉例說明，而非限制。因而本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書說明，而不是由前面的描述說明，而且權(quán)利要求書含義及范圍內(nèi)的變化均涵蓋于本文中。
權(quán)利要求
1.CD40CD154結(jié)合阻斷物在制備可用于抑制靈長類移植受體對組織移植物的排斥反應(yīng)的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中該CD40CD154結(jié)合阻斷物為抗CD40L(抗CD154)化合物。
3.權(quán)利要求2的用途，其中該抗CD40L化合物為單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3的用途，其中該單克隆抗體可結(jié)合5c8抗原。
5.權(quán)利要求4的用途，其中該單克隆抗體具有ATCC錄入號HB10916產(chǎn)生的5c8抗體的抗原特異性結(jié)合特征。
6.CD40CD154結(jié)合阻斷物在制備可用于逆轉(zhuǎn)靈長類移植受體對移植組織急性排斥反應(yīng)的藥物中的用途。
7.權(quán)利要求6的用途，其中該移植組織選自腎、肝、心臟、胰、皮膚、血管、神經(jīng)、骨和軟骨組織。
8.CD40CD154結(jié)合阻斷物在制備可用于延長靈長類移植受體中移植組織的存活時間的藥物中的用途。
9.CD40CD154結(jié)合阻斷物在制備可用于減少靈長類移植受體中移植組織衰竭的免疫學(xué)并發(fā)癥的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1，6，8或9的用途，其中該移植組織為該靈長類的同種異體組織；或為該靈長類的異種組織。
11.權(quán)利要求1，6，8或9的用途，其中該移植組織由分離的或懸浮的細(xì)胞組成。
12.權(quán)利要求11的用途，其中該分離的或懸浮的細(xì)胞選自以下組(a)外周血細(xì)胞；和(b)骨髓細(xì)胞或其任何造血成分。
13.權(quán)利要求1，6，8，或9的用途，其中包括另一步向該靈長類施用有效量的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物。
14.權(quán)利要求13的用途，其中該免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物為能阻斷經(jīng)由CD28的T細(xì)胞共同刺激性信號傳導(dǎo)的藥物；或為可阻斷鈣調(diào)磷酸酶信號傳導(dǎo)的藥物。
15.權(quán)利要求14的用途，其中該免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物選自皮質(zhì)類固醇、抗增殖劑、環(huán)孢菌素、藤霉素、西洛霉素、霉酚酸莫非替克、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布瑞喹那鈉、來氟米物和阿扎斯哌然。
16.CD40CD154結(jié)合阻斷物在制備可用于抑制靈長類移植受體對組織移植物的排斥反應(yīng)的藥物中的用途，其中在該移植物植入該靈長類的當(dāng)天算起，在2，4，6，8，12，16和28天向該靈長類施用有效量的該藥物。
17.CD40CD154結(jié)合阻斷物在制備可用于抑制靈長類移植受體對組織移植物的排斥反應(yīng)的藥物中的用途，其中向預(yù)計的靈長類移植受體提供有效量的該藥物；一天后，將該組織移植物植入該靈長類并同時向該靈長類施用有效量的該藥物；并且從植入當(dāng)天算起，在3，10，18和28天向該靈長類施用有效量的該藥物。
18.權(quán)利要求17的用途，其中從植入當(dāng)天算起，在28天后的一個月后開始，每月重復(fù)施用該藥物。
19.CD40CD154結(jié)合阻斷物在制備可用于逆轉(zhuǎn)靈長類移植受體對移植組織的急性排斥反應(yīng)的藥物中的用途，其中在該靈長類出現(xiàn)急性移植排斥征兆的當(dāng)天，及其后的3，10，18和28天對該靈長類施用該藥物。
20.權(quán)利要求19的用途，其中從急性移植排斥反應(yīng)征兆出現(xiàn)的當(dāng)天算起，在第28天后的一個月后開始，每月向該靈長類施用該藥物。
21.權(quán)利要求1，6，8，9，16，17或19的用途，其中該靈長類為人類。
22.權(quán)利要求1，6，8，9，16，17或19的用途，其中該CD40CD154結(jié)合阻斷物通過選自下組的方式施用于該靈長類移植受體(a)非胃腸道途徑；(b)生物相容性或生物可蝕性緩釋植入；(c)灌注泵植入；(d)口腔或腸道給藥；及(e)局部給藥。
23.權(quán)利要求1，6，8，9，20，21或23的用途，其中該CD40CD154結(jié)合阻斷物在該移植組織植入該靈長類移植受體之前施用于供體或移植組織。
24.一種組合物，其中包含具有ATCC錄入號HB 10916產(chǎn)生的5c8抗體的抗原特異性結(jié)合特征的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段；和，選自下組的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物(a)可阻斷T細(xì)胞經(jīng)由CD28的共同刺激性信號傳導(dǎo)的藥物；(b)可阻斷鈣調(diào)磷酸酶信號傳導(dǎo)的藥物；(c)皮質(zhì)類固醇或抗增殖劑；或(d)藤霉素，西洛霉素，霉酚酸莫非替克，咪唑立賓，脫氧精胍菌素，布瑞喹那鈉，來氟米物，和阿扎斯哌然。
全文摘要
本文公布的組合物和方法依賴這樣一個發(fā)現(xiàn)對組織移植物的排斥可單用CD40CD154結(jié)合阻斷抑制物，或聯(lián)合應(yīng)用其它免疫調(diào)節(jié)劑或免疫抑制劑進(jìn)行抑制。一種有利的協(xié)同性聯(lián)合包括CD40CD154結(jié)合阻斷物和CD28信號傳導(dǎo)阻斷物。CD40CD154結(jié)合阻斷物的一個實例為抗CD154單克隆抗體，如具有5c8單克隆抗體的抗原特異性結(jié)合特征的抗體。CD28信號傳導(dǎo)阻斷物的一個實例為CTLA4－Ig融合蛋白。所公布的組合物和方法出乎意料地可用于延長受體內(nèi)移植組織的存活時間，逆轉(zhuǎn)急性移植排斥反應(yīng)，并減少移植組織衰竭的免疫學(xué)并發(fā)癥。
文檔編號A61P37/06GK1736483SQ20051006378
公開日2006年2月22日 申請日期1998年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月17日
發(fā)明者A·D·柯克, D·M·哈蘭, D·托馬斯, M·考夫曼, L·伯克利 申請人:拜奧根Idec馬薩諸塞公司, (由海軍研究總部部長代表的)美利堅合眾國