專利名稱：紅曲在制備防治腹主動(dòng)脈瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅曲在制備防治腹主動(dòng)脈瘤藥物中的應(yīng)用。 背景技術(shù)：
腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysms，AAA)是種常見的致命性退行性血 管病變，由于其潛在破裂危險(xiǎn)，自然病程中五年存活率僅19.6%。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資 料顯示，在60歲以上男性和女性人群中，無癥狀性腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病率分別為4% -8%和 0. 5% -1. 5%，主要危險(xiǎn)因素包括年齡、男性、吸煙史和腹主動(dòng)脈瘤家族史，而控制/未控制 的高血壓、高膽固醇血癥、冠狀動(dòng)脈疾病、外周阻塞性血管病都能促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤病程的進(jìn) 展。腹主動(dòng)脈瘤在歐美人群的心血管性死因中居第13位，在中國人群中發(fā)病率呈逐漸上升 趨勢，其病因?qū)W和病理學(xué)機(jī)制與歐美國家人群相似。在美國，因腹主動(dòng)脈瘤破裂和外科術(shù)后并發(fā)癥而致死的患者每年達(dá)15000例，某 些報(bào)道可達(dá)30000例，其死亡率相當(dāng)于前列腺和乳腺腫瘤。由于該病有很高的致死率和致 殘率，無疑增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。根據(jù)美國心臟病學(xué)會(huì)/美國心臟學(xué)會(huì)(ACC/AHA)臨 床治療指南，腹主動(dòng)脈瘤直徑在5. 0-5. 5cm以上可予外科手術(shù)或血管內(nèi)介入性修復(fù)。大部 分腹主動(dòng)脈瘤患者是在對(duì)其他部位進(jìn)行影像學(xué)檢查時(shí)偶爾發(fā)現(xiàn)的，90%的腹主動(dòng)脈瘤在發(fā) 現(xiàn)時(shí)直徑小于5. Ocm0臨床治療無癥狀性腹主動(dòng)脈瘤的“瓶頸”在于缺乏早期特異性的生物 學(xué)檢測指標(biāo)。盡管血管超聲或磁共振(MRI)等檢測可以早期發(fā)現(xiàn)無癥狀性腹主動(dòng)脈瘤，但 迄今為止尚未證明有藥物能防治腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生。腹主動(dòng)脈瘤是種慢性大動(dòng)脈退行性病變，負(fù)荷較重的血管壁發(fā)生破壞性重構(gòu)。其 主要病理過程包括①血管壁外層慢性炎癥浸潤，伴有大量新生血管形成和促炎因子表達(dá)； ②局部大量激活的基質(zhì)降解蛋白酶；③細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(尤其是彈性纖維和膠原纖維)的 進(jìn)行性破壞導(dǎo)致血管壁薄弱擴(kuò)張；④血管中層平滑肌細(xì)胞過度丟失影響結(jié)締組織修復(fù)過 程。人群中腹主動(dòng)脈瘤好發(fā)于腎下動(dòng)脈，主要與該部位血管結(jié)構(gòu)和血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)有關(guān)，但 是病變?cè)缙谘苤袑訌椥岳w維和外層結(jié)締組織中炎癥細(xì)胞浸潤起著非常關(guān)鍵作用?；|(zhì)降 解同時(shí)釋放某些化學(xué)趨化因子，驅(qū)使炎癥細(xì)胞游走到血管壁，出現(xiàn)炎性“爆發(fā)”。國際上研究人群腹主動(dòng)脈瘤最常用的動(dòng)物模型是小鼠，利用其能敲除或攜帶特異 性基因等優(yōu)勢，廣泛用于各種遺傳學(xué)研究。小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型主要通過基因敲除或/和 化學(xué)誘導(dǎo)法，包括胰彈性酶和氯化鈣。將胰彈性酶或氯化鈣局部應(yīng)用于腎下動(dòng)脈，2周后有 顯著的動(dòng)脈擴(kuò)張，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)劑直接降解和破壞動(dòng)脈中層彈力蛋白有關(guān)。血管緊張 素II (Angiotensin II，AngII)能誘導(dǎo)高脂血癥小鼠(ApoE-/-或LDLr-/-)產(chǎn)生腹主動(dòng)脈 瘤，盡管其發(fā)生部位在腎上動(dòng)脈，與人群中腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生部位不一致(腎下動(dòng)脈)，但 是其病理形成過程能模擬人體腹主動(dòng)脈瘤的病理機(jī)制。主要表現(xiàn)在早期動(dòng)脈擴(kuò)張，繼而血 管中層彈性纖維斷裂，最終有血管極度擴(kuò)張和附壁血栓形成。因而，AngII誘導(dǎo)的小鼠腹主 動(dòng)脈瘤模型是研究人群腹主動(dòng)脈瘤藥理學(xué)和藥效學(xué)機(jī)制的最好的模式生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以紅曲作為一種中藥和食品添加劑，研究其在制備防治腹主動(dòng)脈瘤藥物中 的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是紅曲在制備防治腹主動(dòng)脈瘤藥物中的應(yīng)用。紅曲是以秈米為原料，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)分離出優(yōu)質(zhì)的紅曲霉菌 (monascuspurpureus)經(jīng)液體深層發(fā)酵精致而成，是一種純天然、安全性高、有益于人體健 康的食品添加劑?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品(肉制品、果汁、色酒、果醬、飲料、糖果、糕點(diǎn)、醬油、 保健醋等)、藥品(藥品著色劑、功能性保健品)、化妝品等領(lǐng)域。所述藥物可由紅曲添加常規(guī)藥用輔料制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑或口服液 劑等常規(guī)劑型。根據(jù)實(shí)驗(yàn)小鼠有效劑量推算，所述紅曲在制備防治腹主動(dòng)脈瘤藥物中的有效劑量 約為1.0 1.2g/天。選取12 20周齡的ApoE基因敲除的雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分成兩組，均 提供正常飲食，每周測量體重。其中，一組小鼠在潔凈飲用水中添加紅曲粉劑(4mg/d)，并采 用灌胃法給予；喂養(yǎng)1周后，在其皮下植入ALZET滲透泵(ALZET 2004，美國健康醫(yī)療儀器 國際公司)，持續(xù)4周皮下給予AngII (lOOOng/kg/min，美國Bachem公司)。另一組小鼠，以 灌胃法給予等量不含藥物的飲用水，作為陰性對(duì)照組。應(yīng)用小動(dòng)物高頻超聲成像系統(tǒng)(VevO770，加拿大VisualSonics公司)檢測小鼠腎 上動(dòng)脈、左腎動(dòng)脈的最大管腔內(nèi)徑和橫截面積，以實(shí)驗(yàn)前后腎上動(dòng)脈最大管腔內(nèi)徑增加大 于50%為診斷腹主動(dòng)脈瘤的標(biāo)準(zhǔn)。觀察小鼠腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生率和發(fā)生破裂的并發(fā)癥，定 量評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，利用膽固醇氧化酶-肌酐酶(HMMPS)法檢測血清總膽固醇 濃度，直接法檢測血清低密度脂蛋白膽固醇濃度。利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒分 別檢測血清中巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)、血清單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)濃度，以及 腎上動(dòng)脈組織裂解液中基質(zhì)金屬酶MMP-9和AP-I轉(zhuǎn)錄因子的濃度。結(jié)論(1) 口服紅曲不僅能減慢腹主動(dòng)脈瘤內(nèi)徑的擴(kuò)張速度，而且能延緩腹主動(dòng)脈瘤橫 截面積的擴(kuò)大。(2) 口服紅曲能減少主動(dòng)脈弓部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，而且縮小主動(dòng)脈根部動(dòng) 脈粥樣硬化斑塊面積。(3) 口服紅曲具有調(diào)節(jié)血脂的功效，使血清低密度脂蛋白膽固醇含量降低。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在提供了紅曲在制備防治腹主動(dòng)脈瘤藥物中的新應(yīng) 用。紅曲，既是一種中藥又是食品添加劑，能有效預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生，延緩腹主動(dòng)脈瘤 的進(jìn)展，同時(shí)又具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和降血脂的功效，是一種應(yīng)用前景廣闊的治療藥物。


圖1為紅曲降低腎上動(dòng)脈最大管腔內(nèi)徑和橫截面積；其中，A為腎上動(dòng)脈最大管腔 內(nèi)徑，B為腎上動(dòng)脈最大管腔橫截面積。圖2為紅曲減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積；其中，A為主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，B為主動(dòng)脈弓部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積占整個(gè)主動(dòng)脈弓部面積的百分比。圖3為紅曲調(diào)節(jié)血脂的作用；其中，A為血清低密度脂蛋白膽固醇濃度，B為血清 總膽固醇濃度。圖4為紅曲上調(diào)血清巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)含量，不影響血清單核細(xì)胞趨 化蛋白-I(MCP-I)含量；其中，A為血清單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)濃度，B為血清巨噬 細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)濃度。圖5為紅曲不影響動(dòng)脈瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和淀粉樣蛋白AP-I轉(zhuǎn) 錄因子的含量；其中，A為腎上動(dòng)脈組織裂解液中MMP-9濃度，B為腎上動(dòng)脈組織裂解液中 AP-I轉(zhuǎn)錄因子的濃度。圖6為紅曲不影響體重。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)應(yīng)用小動(dòng)物高頻超聲成像系統(tǒng)(VeVO770，加拿大 VisualSonics公司)檢測小鼠腎上動(dòng)脈、左腎動(dòng)脈的最大管腔內(nèi)徑和橫截面積。其中，實(shí)驗(yàn) 過程中左腎動(dòng)脈的管腔內(nèi)徑和橫截面積在應(yīng)用AngII前后沒有顯著變化(小鼠腹主動(dòng)脈瘤 的發(fā)生部位局限在腎上動(dòng)脈)，可作為參照，以實(shí)驗(yàn)前后腎上動(dòng)脈最大管腔內(nèi)徑增加值大于 50%為診斷腹主動(dòng)脈瘤的標(biāo)準(zhǔn)。選取12 20周齡的ApoE基因敲除(ApoE-/-)的雄性小鼠38只(北京維通利華 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并分成兩組，每組19只，均提供正常飲食，每周稱取 體重。其中一組，在潔凈飲用水中添加紅曲粉(浙江三禾生物工程有限公司)(4mg/d)并采 用灌胃法給予，喂養(yǎng)1周后在其皮下植入ALZET滲透泵(ALZET 2004，美國健康醫(yī)療儀器國 際公司)，持續(xù)性給予AngII (lOOOng/kg/min，美國Bachem公司)4周。另一組小鼠，采用灌 胃法給予等量不含藥物的飲用水作為陰性對(duì)照組，皮下給予AngII方法同前。將給藥4周后的小鼠經(jīng)腹腔注射lmL4%水合氯醛麻醉后，打開胸腔，從左心室抽 取動(dòng)脈血約lmL，4°C條件下以4000轉(zhuǎn)/分速度離心5min，收集上層血清并在-80°C條件下 保存；打開腹腔，分離出整個(gè)主動(dòng)脈主干，分段留取主動(dòng)脈根部、主動(dòng)脈弓部和腹主動(dòng)脈。將 主動(dòng)脈根部包括心臟長軸中上1/3段，和腹主動(dòng)脈(從腸系膜上動(dòng)脈分支到右腎動(dòng)脈分支 間)分別包埋于OCT冷凍切片包埋劑，-80°C保存；將主動(dòng)脈弓部浸泡于含10%福爾馬林的 溶液中，組織固定。將實(shí)驗(yàn)過程中死亡的小鼠尸體進(jìn)行解剖，查明死因，統(tǒng)計(jì)腹主動(dòng)脈瘤和 胸主動(dòng)脈瘤破裂的發(fā)生率。動(dòng)脈粥樣硬化的定量檢測應(yīng)用en face技術(shù)對(duì)主動(dòng)脈弓部粥樣硬化斑塊進(jìn)行定 量評(píng)估，計(jì)算主動(dòng)脈弓部內(nèi)膜層中粥樣硬化病變面積所占比例。對(duì)主動(dòng)脈根部組織(從主 動(dòng)脈竇到升主動(dòng)脈)進(jìn)行連續(xù)切片油紅染色，定量評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化病變面積。腹主動(dòng)脈瘤的定量檢測觀察小鼠腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生率和發(fā)生破裂的并發(fā)癥。根 據(jù)活體超聲影像學(xué)探測結(jié)果，比較兩組間小鼠腎上動(dòng)脈最大管腔內(nèi)徑和橫截面積。在冰上 將腹主動(dòng)脈剪成小碎片，加0.5 LOmL預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液[50mM三羥甲基氨基甲烷-HCl (Tris-HCl，pH 7. 4)，0. 1 %聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X 100), 150mM NaCl,, 0.5%脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)，0. 1 %十二烷基硫酸鈉(SDS)，2mM氟化鈉 (sodium fluoride)，ImM乙二胺四乙酸(EDTA)，用前加入2mM苯甲基硫酰氟(PMSF)]。采用玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿，直至充分裂解。4°C下12000g離心3 5min，取上清 液以BCA蛋白定量試劑(美國Pierce公司)進(jìn)行組織蛋白定量測定。以酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)試劑盒(美國R&D公司)定量檢測腎上動(dòng)脈組織裂解液中的MMP-9和AP-I轉(zhuǎn)錄因 子的含量。血清樣本檢測利用膽固醇氧化酶-HMMPS法檢測血清總膽固醇水平(日本W(wǎng)ako Chemical公司)；利用直接法檢測血清低密度脂蛋白膽固醇水平(LDL-C)；利用ELISA試劑 盒檢測血清中單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)的濃度。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見圖1 圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)論(1) 口服紅曲不僅能減慢腹主動(dòng)脈瘤內(nèi)徑的擴(kuò)張(從2. 3mm降到1. 7mm)，而且能 延緩腹主動(dòng)脈瘤橫截面積的擴(kuò)大(從3. 3mm2減到1. 9mm2)。(2) 口服紅曲能使主動(dòng)脈弓部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積比例減小36% (動(dòng)脈粥樣斑 塊面積占主動(dòng)脈弓部總面積的比例從36%下降到23% )，主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化面積縮 小47% (動(dòng)脈粥樣斑塊面積從0. 38mm2縮小到0. 20mm2)。(3)紅曲還具有調(diào)節(jié)血脂的功效，能降低血清低密度脂蛋白膽固醇17% (從 329mg/dl 降低到 274mg/dl)。
權(quán)利要求
紅曲在制備防治腹主動(dòng)脈瘤的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物制成下述之一的劑型①片劑、②顆 粒劑、③膠囊劑、④注射劑、⑤口服液劑。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述紅曲有效劑量為1.0 1.2g/天。
全文摘要
本發(fā)明提供了紅曲在制備防治腹主動(dòng)脈瘤藥物中的新應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口服紅曲不僅能減慢腹主動(dòng)脈瘤內(nèi)徑的擴(kuò)張速度，延緩腹主動(dòng)脈瘤橫截面積的擴(kuò)大，還能減小主動(dòng)脈弓部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，縮小主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化面積，同時(shí)紅曲還具有調(diào)節(jié)血脂的功效，能降低血清低密度脂蛋白膽固醇水平。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101919882SQ201010256948
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者王建安, 王迤凡, 謝小潔 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)