一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性組合物藥物包括以下組分：組分Ⅰ：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF，95.0%≤純度＜98.0%；組分Ⅱ：rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF中的一種或者幾種，0%≤含量≤5.0%，且0%≤rhG-CSF含量≤3.0%；組分Ⅲ：mPEG，0%≤含量≤5.0%；以及其他組分，包含外源性DNA、宿主菌蛋白等，0%≤含量＜0.5%。本發(fā)明提供的聚乙二醇修飾的rhG-CSF組合物的藥物活性，各項指標均符合藥用要求，質量穩(wěn)定，且體外活性、半衰期、安全性等方面均優(yōu)于現(xiàn)有技術產品，能夠保證聚乙二醇修飾的rhG-CSF制劑的臨床療效及用藥安全。
【專利說明】-種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質修飾及純化領域，具體而言就是涉及一種聚乙二醇修飾的 rhG-CSF活性藥物組合物。

【背景技術】
[0002] 粒細胞集落刺激因子G-CSF可用于各種細胞減少癥，可以使干細胞和前體細胞從 骨髓轉移，并用于治療由化學療法引起的粒細胞減少癥患者。蛋白質治療藥物重組人粒細 胞刺激因子（rhG-CSF)的生物利用度通常受血漿半衰期的限制，即其體內半衰期較短，用藥 后很快從體內清除，需要每天應用，從而增加了患者的痛苦。
[0003] PEG-rhG-CSF是由rhG-CSF蛋白經PEG (聚乙二醇)修飾所得，其血漿半衰期延長， 并且免疫原性降低、生物利用度提高、穩(wěn)定性增強、安全性更高。
[0004] 中國專利申請CN1139932A (文獻1)公開了一種N-末端單聚乙二醇化的rhG-CSF 的制品，在該專利說明書中，未提示純化后樣品單PEG化的rhG-CSF的含量。我們參考該 專利公開方法，采用mPEG 20kDa對rhG-CSF進行反應，單PEG化的rhG-CSF的轉化率只有 70%左右，同時對其產品進行體外活性檢測，其生物學活性為3. 5 X 107IU/mg。中國專利申 請CN1663962A (文獻2)公開了 rhG-CSF N末端和非N末端聚乙二醇修飾物及其一步純化 工藝。我們參考該專利公開的方法，采用mPEG 20kDa對rhG-CSF進行反應，經純化后的產 品含 98%mPEG-rhG-CSF 及 2% 的 rhG-CSF，其生物學活性為 4. OX 107IU/mg。
[0005] 根據文獻1公開的方法制得的mPEG-rhG-CSF其純度僅有70%左右，含有雜 質較多，同時其生物學活性為3. 5X107IU/mg，活性較低。根據文獻2制得的N末端 mPEG-rhG-CSF其純度可達到98%以上，但是其生物學活性與文獻1制得的產品活性相近，僅 為4. OX 107IU/mg活性較低。


【發(fā)明內容】

[0006] 為了提高N-末端mPEG-rhG-CSF的產品純度及其生物學活性，獲得藥效更高的產 品而提供一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物。
[0007] 本發(fā)明主要是通過對制備得到的mPEG-rhG-CSF產品進行研究，發(fā)現(xiàn)產品中主要 存在以下組分 ： (1) 未反應完的原料，如：mPEG，rhG-CSF ; (2) 其它取代位置的單（mono)取代mPEG-rhG-CSF ; (3) 多取代的 mPEG-rhG-CSF，如 di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF ; (4) 其它組分，如外源性DNA、宿主菌蛋白等。
[0008] 發(fā)明人通過大量研究發(fā)現(xiàn)，當產品中N末端mono-mPEG-rhG-CSF的純度在[95%， 98%)區(qū)間，上述（2)~ (3)類組分總和含量在[2%，5%)區(qū)間，且（1)類組分中rhG-CSF含量 在[0,彡3%]區(qū)間，（4)類組分含量在（0,0. 5%)區(qū)間時，產品質量穩(wěn)定，保障了其臨床用藥 安全。
[0009] 因此，本發(fā)明提供一種N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物，包括以下組 分： 組分 I :N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF，95. 0% 彡純度 < 98. 0% ; 組分 II :選自 rhG-CSF、非 N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、 tri-mPEG-rhG-CSF中的一種或幾種，0彡含量彡5· 0%，且0彡rhG-CSF含量彡3· 0% ; 組分III :mPEG，0彡含量彡5. 0% ; 以及其他組分，〇彡含量< 〇. 5%。
[0010] 上述藥物活性組合物中： 優(yōu)選地，組分I :96. 0%彡純度< 97. 0% ;組分II :選自rhG-CSF、非N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri- mPEG-rhG-CSF 中的一種或幾種，0 彡含量 彡3. 0% ;組分III :0彡mPEG含量彡3. 0% ;以及其他組分，0彡含量< 0· 5% ; 更優(yōu)選地，組分I :97. 0%彡純度< 98. 0% ;組分II :選自rhG-CSF、非N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri- mPEG-rhG-CSF 中的一種或幾種，0 彡含量 彡2. 0% ;組分III :0彡mPEG含量彡2. 0% ;以及其他組分，0彡含量< 0· 5%。
[0011] 上述任一藥物活性組合物中，所述組分II與組分III的總含量彡2%。
[0012] 上述任一藥物活性組合物中，所述mPEG優(yōu)選為分子量為20kDa的mPEG。
[0013] 上述任一藥物活性組合物中，所述其他組分包含外源性DNA、宿主菌蛋白；優(yōu)選 地，所述外源性DNA含量< IOng/劑量，所述宿主菌蛋白含量< 0. 02%。
[0014] rhG-CSF序列中的5個賴氨酸為mPEG的結合位點，因此，上述藥物活性組合物中， 所述mono-mPEG-rhG-CSF指的是，5個結合位點中，任一位點與PEG結合的mPEG-rhG-CSF ; 非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF指的是，除N-末端外，其它任一結合位點形成的 mono-mPEG-rhG-CSF ;所述di-mPEG-rhG-CSF指的是，5個結合位點中任意兩個位點結合 mPEG的mPEG-rhG-CSF ;所述tri-mPEG-rhG-CSF指的是，5個結合位點中任意三個位點結合 mPEG 的 mPEG-rhG-CSF。
[0015] 本發(fā)明中所述組分I含量指的是其蛋白含量。
[0016] 本發(fā)明的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物組合物制成的mPEG-rhG-CSF產品，體 外活性彡 9. 0X107IU/mg。
[0017] 本發(fā)明所述聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性組合物，其純度可達到95%以上，且其 生物學活性達到9. OXlO7IUAig以上，是現(xiàn)有技術制備產品的生物學活性的兩倍以上，因 此本發(fā)明的藥物組合物具有更優(yōu)的藥效。同時，本發(fā)明的藥物組合物的其他各項指標均符 合藥用要求，質量穩(wěn)定，且半衰期、安全性等方面均優(yōu)于現(xiàn)有技術產品，能夠保證N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF制劑的臨床療效及用藥安全。
[0018] 具體實施實例 實施例1制備mPEG-rhG-CSF粗品 制備 rhG-CSF 反應溶液，濃度為 5. 0mg/mL，含有 IOOmMNaH2PO4, 20mM NaCNBH3, ρΗ5· 0,將 其于4°C下充分攪拌后，加入摩爾數(shù)為rhG-CSF摩爾數(shù)5倍量的20kDamPEG，反應液于4°C下 攪拌反應l〇h。然后將反應液用IOOmM HCl調至pH4.0,濃縮，得mPEG-rhG-CSF粗品。HPLC 檢測，檢測結果見表3,體外活性測定結果見表4。
[0019] 實施例 2: N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF的制備 (1) 離子交換色譜法層析：將實施例l所得mPEG-rhG-CSF粗品用MaCr0CapSP(直徑 300mm，高12cm)的離子交換色譜法層析： ① 上樣：將mPEG-rhG-CSF粗品以緩沖液A (IOmM醋酸鈉-醋酸，0. 004%吐溫-80， ρΗ4· 0±0· 5)稀釋至 100~200μ g/mL，以 340mL/min±10% 流速上樣，上樣量 IOmg 蛋白 /ml 填料； ② 沖洗：以緩沖液A 400mL/min± 10%流速沖洗3個柱體積； ③ 梯度洗脫：以緩沖液A及緩沖液B( IM氯化鈉，IOmM醋酸鈉-醋酸，0. 004%吐溫-80， pH4. 0±0. 5)以90mL/min± 10%的流速洗脫梯度洗脫6個柱體積（梯度從0%至60%)，收集 mPEG-rhG-CSF蛋白洗脫峰； (2) 分子篩層析： ① 將離子交換層析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱(直徑200mm，高60cm) 以120mL/min± 10%的流速上樣，上樣體積為柱體積的5% ; ② 以緩沖液A以120mL/min±10%的流速洗脫，收集目的蛋白N-末端 mono-PEG-rhG-CSF。
[0020] 將所得流分進行濃縮至5mg/mL，HPLC檢測，檢測結果見表3,體外活性測定結果見 表4。
[0021] 實施例 3: N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF的制備 (1) 離子交換色譜法層析：將實施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP (直徑 300mm，高12cm)的離子交換色譜法層析： ① 上樣：將mPEG-rhG-CSF粗品以緩沖液A (IOmM醋酸鈉-醋酸，0. 004%吐溫-80， ρΗ4· 0±0· 5)稀釋至 100~200 μ g/mL,以 340mL/min± 10% 流速上樣，上樣量 8mg 蛋白 /ml 填 料； ② 沖洗：以緩沖液A 400mL/min± 10%流速沖洗3個柱體積； ③ 梯度洗脫：以緩沖液A及緩沖液B( IM氯化鈉，IOmM醋酸鈉-醋酸，0. 004%吐溫-80， pH4. 0±0. 5)以90mL/min± 10%的流速洗脫梯度洗脫6個柱體積（梯度從0%至60%)，收集 mPEG-rhG-CSF蛋白洗脫峰； (2) 分子篩層析： ① 將離子交換層析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱(直徑200mm，高60cm) 以120mL/min± 10%的流速上樣，上樣體積為柱體積的5% ; ② 以緩沖液A以120mL/min±10%的流速洗脫，收集目的蛋白N-末端 mono-PEG-rhG-CSF。
[0022] 將所得流分進行濃縮至5mg/mL，HPLC檢測，檢測結果見表3,體外活性測定結果見 表4。
[0023] 實施例4:N-末端mono-mPEG-;rhG-CSF的制備 (1)離子交換色譜法層析：將實施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP (直徑 300mm，高12cm)的離子交換色譜法層析： ①上樣：將mPEG-rhG-CSF粗品以緩沖液A (IOmM醋酸鈉-醋酸，0. 004%吐溫-80， ρΗ4· 0±0· 5)稀釋至 100~200 μ g/mL,以 340mL/min± 10% 流速上樣，上樣量 6mg 蛋白 /ml 填 料； ② 沖洗：以緩沖液A 400mL/min± 10%流速沖洗3個柱體積； ③ 梯度洗脫：以緩沖液A及緩沖液B( IM氯化鈉，IOmM醋酸鈉-醋酸，0. 004%吐溫-80， pH4. 0±0. 5)以90mL/min± 10%的流速洗脫梯度洗脫6個柱體積（梯度從0%至60%)，收集 mPEG-rhG-CSF蛋白洗脫峰； (2)分子篩層析： ① 將離子交換層析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱(直徑200mm，高60cm) 以120mL/min± 10%的流速上樣，上樣體積為柱體積的5% ; ② 以緩沖液A以120mL/min±10%的流速洗脫，收集目的蛋白N-末端 mono-PEG-rhG-CSF。
[0024] 將所得流分進行濃縮至5mg/mL，HPLC檢測，檢測結果見表3,體外活性測定結果見 表4。
[0025] 實施例 5:mPEG-rhG-CSF的制備 取純化所得rhG-CSF，稀釋至2. Omg/ml，對0. IMNaH2PO4, pH5. 0于4°C透析過夜，調節(jié)pH 至 5. 0。
[0026] ①取分子量為20kD的mPEG，按mPEG :rhG-CSF摩爾比5:1比例加入mPEG，充分攪 拌溶解。
[0027] ②再取IM NaCNBH3加入反應液，終濃度為20mM。充分攪拌混勻后置4°C反應過夜。
[0028] ③取修飾后樣品，用蒸餾水稀釋兩倍體積后，再用乙酸調節(jié)至pH4. 0,離心去沉淀。
[0029] ④取陽離子層析介質SP Sepharose F. F.，裝柱后取平衡緩沖液I (10mmol/L乙 酸-乙酸鈉，PH4. 0)平衡至基線后上樣樣品，再用平衡緩沖液II (lOmmol/L乙酸-乙酸鈉， pH5. 0)平衡至基線。
[0030] ⑤取洗脫緩沖液I (lOmmol/L乙酸-乙酸鈉，pH5. 6)洗脫下N-末端修飾的 mPEG-rhG-CSF目的蛋白峰。
[0031] 將所得流分進行濃縮至5mg/mL，HPLC檢測，檢測結果見表3,體外活性測定結果見 表4。
[0032] 實施例6:實施例組分檢測方法 1.組分I及組分II中各成分的含量檢測方法：高效液相色譜法 色譜條件及測定方法 儀器：WATERS 600型高效液相色譜儀 色譜柱：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 測定方法：以A相(三氟乙酸-水溶液：量取LOml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)、 B相(三氟乙酸-乙腈溶液：量取I. Oml三氟乙酸和99ml水加入色譜純乙腈至1000ml，充分 混勻)為流動相，在室溫條件下，按下表進行梯度洗脫。上樣量應不低于lOKg，在波長280nm 處檢測。
[0033] 表1組分I及組分II流動相洗脫梯度

【權利要求】
1. 一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物，其特征在于，包括以下組分： 組分 I :N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF，95. 0% 彡純度〈98. 0% ; 組分 II :選自 rhG-CSF、非 N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri- mPEG-rhG-CSF中的一種或幾種，0彡含量彡5. 0% ; 組分III :mPEG，0彡含量彡5. 0% ; 以及其他組分，包含外源性DNA、宿主菌蛋白，0 <含量〈0. 5%。
2. 如權利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物，其特征在于所 述組分II、組分III及其他組分，2. 0%〈三者總含量< 5. 0%。
3. 如權利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物，其特征在于所 述0彡rhG-CSF含量彡3. 0%。
4. 如權利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物，其特征在于所 述外源性DNA含量< 10ng/劑量，所述宿主菌蛋白含量< 0. 02%。
5. 如權利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF活性藥物組合物，其特征在于所 述mPEG的分子量為20kDa。
【文檔編號】A61K47/48GK104491843SQ201510033535
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月23日 優(yōu)先權日:2015年1月23日
【發(fā)明者】竇燕峰 申請人:石藥集團百克(山東)生物制藥有限公司