專利名稱：原兒茶醛在制備治療人神經(jīng)退行性疾病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原兒茶醛在制備人神經(jīng)保護(hù)藥物中的用途，尤其涉及原兒茶醛在預(yù)防或治療由神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷所誘導(dǎo)的人神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，屬于原兒茶醛的藥理用途領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要的病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元變性缺失和Lewy小體形成。帕金森病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常等運(yùn)動(dòng)癥狀，此外還可伴發(fā)抑郁、人格改變等精神癥狀。PD的病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未徹底研究清楚，認(rèn)為是遺傳因素、環(huán)境毒素、氧化應(yīng)激增加、興奮性氨基酸毒性等多種因素共同作用的結(jié)果，盡管這些因素可導(dǎo)致不同的病理生理改變，但最終都可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，因此氧化應(yīng)激被認(rèn)為是PD發(fā)病的核心機(jī)制。在60歲以上的人群中PD的發(fā)病率約為1 % -2%，隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，且大部分患者為散發(fā)病例，少數(shù)顯性或隱性遺傳家族性患者是由于基因突變引起的。目前家族性PD致病基因的鑒定與克隆以及功能研究為闡明PD的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索，也為 PD的治療提供了新的策略。1997年DJ-I首次被報(bào)道(Nagakubo D，Taira T，Kitaura H， et al. DJ-l,a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation with ras. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 231 (2) :509-13.)是一種癌基因，可與激活的 ras 協(xié)同轉(zhuǎn)化小鼠 NIH3T3 細(xì)胞。2003 年 Bonifati 等(Bonifati V, Rizzu P, van Baren MJ, et al. Mutations in the DJ-I gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science, 2003, 299 (5604) :256-9.)在 2 個(gè)常染色體隱性遺傳性早發(fā)型帕金森綜合征家系中發(fā)現(xiàn)了 DJ-I基因(PARK7)的兩種突變(L166P、第1 5外顯子缺失突變)，至今已發(fā)現(xiàn)了 10余種DJ-I基因突變類型。目前研究發(fā)現(xiàn)DJ-I有眾多功能，包括參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、線粒體調(diào)節(jié)、分子伴侶以及蛋白酶的功能。DJ-I 基因突變后導(dǎo)致帕金森病的發(fā)病機(jī)制主要與DJ-I的抗氧化應(yīng)激功能相關(guān)。DJ-I可通過多種途徑發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，首先，DJ-I可通過自身氧化清除氧自由基發(fā)揮作用。DJ-I 蛋白序列中共有三個(gè)半胱氨酸殘基，分別位于46位，53位和106位，其中106位的半胱氨酸對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感，可被逐步氧化由Cys-SH轉(zhuǎn)變?yōu)镃ys-SOH，Cys-SO2H, Cys-SO3H，這一改變使DJ-I等電點(diǎn)向偏酸的方向轉(zhuǎn)移，也說明可通過自身氧化清除氧自由基。但DJ-I 蛋白的過氧化可導(dǎo)致蛋白功能的喪失，在帕金森病患者中，DJ-I過氧化狀態(tài)隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增多。其次，DJ-I可轉(zhuǎn)錄調(diào)控抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因。在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下， DJ-I的亞細(xì)胞定位和功能狀態(tài)發(fā)生改變。在氧化應(yīng)激早期，DJ-I轉(zhuǎn)移到線粒體，主要定位在線粒體外膜，這對(duì)于維持線粒體外膜的完整性以及阻止凋亡蛋白引發(fā)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)非常重要。長(zhǎng)時(shí)間的氧化應(yīng)激可使DJ-I向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)，如 Nrf2 基因。Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor)，其作用于ARE (antioxidant response element)，是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)一系列超過200個(gè)基因的表達(dá)，包括抗氧化基因和解毒酶類，如NADPH quinine oxidoreductase-1 (NQ0-1)，hemeoxygenase-1 (HO-I)等。再次 DJ-1 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活細(xì)胞生存通路如PI3K\AKT通路等。多種因素如胰島素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞應(yīng)激等可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PII向細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)移。PII磷酸化PIP2產(chǎn)生PIP3，同時(shí)PTEN可以抑制這一過程使PIP3去磷酸化。PIP3通過磷酸化作用而激活A(yù)KT，活化的AKT參與多種細(xì)胞生理病理過程，如細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、增殖、葡萄糖攝取、代謝和血管生成等。Aleyasin等研究發(fā)現(xiàn)DJ-I在氧化應(yīng)激條件下可以調(diào)節(jié)AKT的活化。此外DJ-I可與PTEN結(jié)合降低PTEN的活性減弱對(duì)PIP3生成的抑制作用，從而刺激AKT的活化。在PD患者中腦多巴胺神經(jīng)元內(nèi)發(fā)現(xiàn)總AKT和磷酸化AKT水平均較正常組降低，表明PD患者存在AKT信號(hào)通路缺陷。DJ-I蛋白對(duì)AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用有助于多巴胺能神經(jīng)元的存活。在體外實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)野生型DJ-I可保護(hù)神經(jīng)元抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染了野生型DJ-I 的小鼠對(duì)MPTP引起的黑質(zhì)紋狀體的損傷有抵抗作用，使更多的多巴胺能神經(jīng)元存活。敲除DJ-I基因后增加細(xì)胞或動(dòng)物模型對(duì)氧化應(yīng)激損傷的敏感性。在DJ-I敲除的細(xì)胞中，對(duì) H2O2，MPP+，6-0HDA等刺激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的敏感性增加。在DJ-I敲除的小鼠中，黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元和紋狀體中神經(jīng)纖維密度和多巴胺的含量正常。但是MPTP處理后多巴胺能神經(jīng)元的丟失和紋狀體的去神經(jīng)支配增多。然而使DJ-I缺陷的細(xì)胞或動(dòng)物模型恢復(fù)過表達(dá)DJ-I后，該模型對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性也恢復(fù)正常。因此細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一定量的DJ-I蛋白以及DJ-I蛋白維持在正常功能狀態(tài)對(duì)于細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激至關(guān)重要。臨床上對(duì)帕金森病的治療主要分為藥物治療和外科手術(shù)治療。常用的藥物有復(fù)方左旋多巴、多巴胺受體激動(dòng)劑、多巴胺增效劑和金剛烷胺等，治療的原則主要為對(duì)癥治療以減輕患者運(yùn)動(dòng)障礙的癥狀，提高生活質(zhì)量為主，至今尚沒有明確的起到神經(jīng)保護(hù)作用的藥物。左旋多巴制劑仍舊是緩解帕金森病運(yùn)動(dòng)癥狀最有效的藥物，然而左旋多巴的長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)許多嚴(yán)重副作用，如“開-關(guān)”現(xiàn)象、劑末惡化、劑峰運(yùn)動(dòng)障礙、肌張力障礙、精神障礙等，并且隨著神經(jīng)元變性的發(fā)展其效能逐漸減小。此外由于左旋多巴的代謝過程會(huì)產(chǎn)生氧自由基，因此關(guān)于左旋多巴是否存在神經(jīng)毒性尚有爭(zhēng)論。外科手術(shù)治療有蒼白球切開術(shù)、腦深部電刺激術(shù)等，但手術(shù)治療的風(fēng)險(xiǎn)性大，手術(shù)的最佳效果并不優(yōu)于藥物治療，只適用于少數(shù)長(zhǎng)期服用藥物療效不滿意或藥物不良反應(yīng)較嚴(yán)重的患者。自體或胎兒腎上腺髓質(zhì)或胎腦移植術(shù)的療效不確定，且存在供體來(lái)源有限、免疫排斥等問題。利用酪氨酸羥化酶和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因進(jìn)行的基因治療目前技術(shù)還不成熟，還處在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。因此亟待開發(fā)出具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物來(lái)治療帕金森病。原兒茶醛是丹參有效成分中水溶性酚酸類化合物之一，丹參是常用中藥，為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，中醫(yī)理論認(rèn)為丹參性苦微寒，歸心、肝二經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)，清心除煩的功效。丹參的有效成分包括脂溶性二萜醌類和水溶性酚酸類化合物。 此外原兒茶醛還存在于四季青葉、烏蕨等藥用植物中。許多研究表明原兒茶醛具有增加冠脈流量、降低冠脈阻力、抑制血小板聚集、減低血小板膜流動(dòng)性、降低紅細(xì)胞漿Ca2+濃度等作用。韓純潔等(韓純潔，林蓉，劉俊田，等.原兒茶醛對(duì)OX2LDL損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用.中藥材，2007(30)，12:巧41-44.)發(fā)現(xiàn)原兒茶醛可保護(hù)ox_LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(CRL21730)損傷，可能通過抗炎作用起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。^iou等(ZhouΖ, Liu Y, Miao AD, et al. Protocatechuic aldehyde suppresses TNF-alpha—induced ICAM-I and VCAM-I expression in human umbilical vein endothelial cells. Eur J Pharmacol, 2005, 513 (1-2) 1-8)通過研究發(fā)現(xiàn)原兒茶醛可抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮粘附分子VCAM-I和ICAM-I的表達(dá)，從而起到預(yù)防和阻斷動(dòng)脈粥樣硬化的作用。葉志華等(葉志華，邢雅玲，田琳琳等.原兒茶醛對(duì)叔丁基過氧化氫損傷H印G2細(xì)胞的保護(hù)作用.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2007，31 O) =126-129)在叔丁基過氧化氫損傷人肝癌細(xì)胞0fepG2)模型中考察了原兒茶醛對(duì)肝損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過提高抗氧化酶活性、加快活性氧的清除實(shí)現(xiàn)細(xì)胞保護(hù)作用。迄今為止，有關(guān)原兒茶醛在神經(jīng)細(xì)胞中的抗氧化應(yīng)激保護(hù)作用、機(jī)制以及預(yù)防治療帕金森病的應(yīng)用前景目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是提供原兒茶醛的一種新的藥理用途。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原兒茶醛具有與帕金森病相關(guān)蛋白DJ-I相互作用的活性。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原兒茶醛具有抗氧化應(yīng)激，防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的 SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的死亡，抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生等作用，而且在AKT細(xì)胞信號(hào)通路中，是原兒茶醛保護(hù)細(xì)胞生存通路之一，原兒茶醛激活A(yù)KT，抑制PTEN，升高DJ-I基因的表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。并且原兒茶醛可以阻止DJ-I蛋白中半胱氨酸巰基的過氧化， 從而維持DJ-I的正?；钚缘人幚碜饔谩Ｉ鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果表明原兒茶醛具有神經(jīng)保護(hù)作用，且其作用與DJ-I蛋白相關(guān)，可用于制備成預(yù)防或治療包括帕金森病在內(nèi)的由神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病。DJ-I被鑒定為一種隱性遺傳家族性帕金森病的致病基因。DJ-I蛋白在細(xì)胞的功能中起著非常重要的作用，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激等?；趯?duì)DJ-I功能的認(rèn)識(shí)以及DJ-I 基因的突變可導(dǎo)致帕金森病，本發(fā)明旨在發(fā)現(xiàn)以DJ-I蛋白為靶點(diǎn)的抗帕金森病的藥物，以期為帕金森病的治療提供新的有效藥物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了原兒茶醛(protocatechuic aldehyde，PAL—種中藥單體化合物) 在體外能夠與重組DJ-I蛋白結(jié)合。在SH-SY5Y細(xì)胞PAL能夠阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷，但是在DJ-lknockdown細(xì)胞中，PAL卻失去了保護(hù)作用，這表明PAL的保護(hù)作用是由DJ-I蛋白介導(dǎo)的。PAL可以抑制氧自由基的產(chǎn)生，在DJ-lknockdown細(xì)胞中PAL清除氧自由基的能力減弱?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的具有抗氧化功能的化合物多達(dá)幾十種，但是沒有文獻(xiàn)報(bào)道原兒茶醛具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的作用。葉志華等公開了原兒茶醛能清除肝細(xì)胞的活性氧自由基從而對(duì)肝損傷有保護(hù)作用，推測(cè)了其作用機(jī)制可能是因?yàn)樵瓋翰枞┩ㄟ^提高抗氧化酶活性、加快活性氧的清除實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞保護(hù)作用。但是肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞在形態(tài)、 結(jié)構(gòu)、代謝和功能等方面存在巨大的差異，造成了肝臟和腦在機(jī)體中行使著不同的功能，形成了器官的特異性和復(fù)雜性。另外，從分子生物學(xué)方面來(lái)講，肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜也存在很大的差異。所以，文獻(xiàn)中雖然報(bào)道了原兒茶醛對(duì)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，但是不能據(jù)此推測(cè)原兒茶醛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷也一定有確切的保護(hù)作用。本發(fā)明基于以帕金森病的致病基因相關(guān)蛋白DJ-I為靶點(diǎn)進(jìn)行的藥物篩選之后獲得結(jié)果，本發(fā)明同時(shí)以現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的其它19種化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些化合物對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞并無(wú)確切的保護(hù)作用。帕金森病患者在抗氧化應(yīng)激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面存在缺損，在AKT細(xì)胞信號(hào)通路中，是原兒茶醛保護(hù)細(xì)胞生存通路之一，原兒茶醛激活A(yù)KT，抑制 PTEN，升高DJ-I基因的表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。此外，原兒茶醛還可以阻止 DJ-I蛋白中半胱氨酸巰基的過氧化，從而維持DJ-I的正常活性等藥理作用?？梢?，原兒茶醛保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制與其保護(hù)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制全然不同。原兒茶醛在臨床應(yīng)用于治療或預(yù)防包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病時(shí)，可向其加入所需的各種輔料和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體后制備成任何一種臨床上可接受的適宜制劑，包括口服制劑或注射制劑。例如，可以是注射劑(粉針、凍干粉針、水針、輸液等)、片劑、口服液、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊、滴丸等；其中，所述的輔料可以是抗氧絡(luò)合劑、 填充劑、骨架材料等；所述的藥學(xué)上可接受的載體是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化鈉、葡萄糖酸鈣或磷酸鈣中的一種或幾種，優(yōu)選為甘露醇或乳糖。


圖1原兒茶醛的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2石英晶體微天平OlCM)檢測(cè)原兒茶醛與DJ-I蛋白(A)和BSA(B)相互作用的
實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3原兒茶醛保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞抵抗H2A誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4原兒茶醛的抗氧化應(yīng)激作用依賴于細(xì)胞內(nèi)DJ-I蛋白的存在。(A)SH_SY5Y細(xì)胞 DJ-I Knockdown 后 Western blot 檢測(cè) DJ-I 表達(dá)水平(B)轉(zhuǎn)染 DJ-IsiRNA 的 SH-SY5Y 細(xì)胞，(C)轉(zhuǎn)染 control siRNA 的 SH-SY5Y 細(xì)胞。圖5原兒茶醛清除氧自由基依賴于細(xì)胞內(nèi)DJ-I的正常表達(dá)。圖eWestern blot分析顯示原兒茶醛可激活A(yù)KT信號(hào)通路，增加磷酸化AKT的表達(dá)，降低磷酸化PTEN的表達(dá)，輕度上調(diào)DJ-I蛋白的表達(dá)。圖7原兒茶醛阻止DJ-I蛋白Cys-106的過氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8 19種化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)例1、實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法1. 1、細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y(購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)在含有10%牛血清的 Dulbecco，s modified Eagle，s medium(DMEM)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為 37°C，5% CO2 的培養(yǎng)才直。1. 2、MTT法分析細(xì)胞活力SH-SY5Y細(xì)胞按每孔lOOulDMEM含有IxlO4個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，M小時(shí)后待細(xì)胞貼附于板底后加入不同濃度的原兒茶醛(5uM、10uM、20uM)繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育 24小時(shí)。然后加入IOul不同濃度的H202(325uM、350uM、375uM)3小時(shí)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。之后加入IOul Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑(購(gòu)自日本D0JIND0公司)孵育4小時(shí)，用 microplate reader (Bio-Rad)在450nm下檢測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)設(shè)立未損傷組(不加原兒茶醛和H2O2)、損傷組(只加H2O2)和藥物保護(hù)組(加原兒茶醛和H2O2)。1. 3、石英晶體微天平OlCM)分析與DJ-I結(jié)合的化合物用去離子水沖洗QCM的芯片，取50ul 1 % SDS滴于芯片上并用棉棒輕輕涂擦，然后取5ul洗凈液( 硫酸1 3)滴于QCM的芯片室溫孵育5分鐘，之后用去離子水洗凈芯片并吹干。將4ul溶于氯仿的化合物(IuM)滴于芯片上，待溶劑揮發(fā)干凈后用去離子水沖洗吹干。將芯片裝置于QCM上，并浸入盛有8ml PBS(137mM NaCl,26. 8mM KCl,8mM Na2HPO4, 1. 5mM KH2PO4)的反應(yīng)杯中，設(shè)定溫度為25°C，旋轉(zhuǎn)速度1000rmp/min，用affinix version 1. 52軟件記錄芯片振動(dòng)頻率的變化。待基線穩(wěn)定(noise < 3Hz/sec，drift < 30Hz/10min) 后，向反應(yīng)杯中加入8ul(lmg/ml)BSA或DJ-I蛋白，記錄加入蛋白后芯片振動(dòng)頻率的改變， 頻率的變化反應(yīng)了化合物與蛋白的結(jié)合速度以及結(jié)合量。1.4、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的測(cè)定采用熒光探針H2DCFDA測(cè)定R0S，H2DCFDA溶于乙醇配成IOmM的儲(chǔ)存液分裝_20°C 保存。將細(xì)胞接種于6孔板OXlO5細(xì)胞/孔，板底加蓋玻片)，待24h細(xì)胞貼壁后，加入 20uM的原兒茶醛培養(yǎng)M小時(shí)。用H2A處理細(xì)胞作用Ih后，用Hank's液(日本NISSUI制藥公司產(chǎn)品；KH2PO4 0. 06g, NaCl 8. 0g, NaHCO3 0. 35g, KCl 0. 4g,葡萄糖 1. 0g, Na2HPO4 · H2O 0. 06g，加H2O至1000ml)洗2次。每孔加入終濃度IOuM(Hank，s液)的熒光探針，避光反應(yīng) 20min 后，吸掉探針，Hank，s 洗 3 次。熒光顯微鏡(Biozero BZ-8000 ；Keyence, Osaka) 下觀察照相。1.5、蛋白提取培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液(150mM NaCl，5mM EDTA, 50mM Tris (pH7. 5) ,0. 5 % NP-40，蛋白酶抑制劑)，冰上放置 30 分鐘。 12，000rpm/min，4°C離心15分鐘，取上清液做蛋白定量。1. 6、Western blot 分析每組樣品取20ug蛋白加入6Xlaemmli上樣緩沖液，100°C變性5分鐘。待冷卻后上樣到12%的聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠上，以濃縮膠電壓80v，分離膠電壓120v，進(jìn)行 SDS-PAGE，等到溴酚藍(lán)指示劑跑出凝膠下緣時(shí)停止電泳。將凝膠從電泳槽中取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘。準(zhǔn)備海綿、6張濾紙、一張硝酸纖維素膜，尺寸與凝膠大小相仿，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5分鐘。按以下順序放置黑板-海綿-3層濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-3層濾紙-海綿-紅板，每層之間趕盡氣泡。將凝膠面與負(fù)極相連，硝酸纖維素膜面與正極相連，轉(zhuǎn)膜電壓16v，4°C過夜。轉(zhuǎn)膜完畢后取出硝酸纖維素膜，將膜放入IX TBST中清洗3次，每次5分鐘，搖床搖動(dòng)；用5%的脫脂奶粉將膜室溫封閉1小時(shí)，不洗；加入TBST1 1000稀釋的一抗，室溫孵育5小時(shí)；將膜放入IX TBST中清洗3次，每次5分鐘；加入 IXTBSTl 600稀釋的熒光二抗，室溫2小時(shí)；將膜放入IX TBST中清洗3次，每次5分鐘；Odyssey遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)掃描成像。一抗采用下列抗體anti-phospho-AKT(kr473) (1 1000，美國(guó) Cell Signaling 公司)，anti-AKT(l 1000，美國(guó) Cell Signaling 公司)， anti-phospho-PTEN(Ser380/Thr382/Thr383/Ser385) (1 1000，美國(guó) Novus Biologicals 公司)，anti-PTEN(l 1000，美國(guó) Cell Signaling 公司)，anti-DJ-I (1 1000，美國(guó) Enzo life sciences 公司)，anti-actin(l 10000，美國(guó) Millipore 公司)；熒光二抗采用下列抗體IRDye800(美國(guó)Rockland公司)or Alexafluor 680-conjugated secondary antibody (美 15 Molecular Probes 公司)。1. 7、利用 MALDI-T0F/T0F-MS 分析 DJ-1 中 Cys-106 氧化狀態(tài)用原兒茶醛和H2A處理各組SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取各組蛋白。向各組蛋白中加入兔抗DJ-I多克隆抗體Oug/ml)(購(gòu)自日本Cyclex公司)，4°C旋轉(zhuǎn)過夜。然后加入 20ulproteinA/G Plus-Agarose 4°C旋轉(zhuǎn) 2 小時(shí)。3000rpm4°C離心 5 分鐘，沉淀用 0. 1 % NP-40洗3次。盡量吸凈上清沉淀加入6X Iaemmli上樣緩沖液，10(TC變性5分鐘。待冷卻后上樣到12. 5%的聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠上，以濃縮膠電壓80v，分離膠電壓120v，進(jìn)行SDS-PAGE，等到溴酚藍(lán)指示劑跑出凝膠下緣時(shí)停止電泳。取出凝膠放于考馬斯亮藍(lán)染液中染色過夜，脫色直至背景清晰，切取DJ-I蛋白相應(yīng)的條帶放入EP管中，加入IOOul 25mM 的NH4HC03/50 % ACN脫色液加入EP管中，振搖lOmin。3000rmp flash后，吸掉上清。脫色不完全時(shí)，再用30% ACN的脫色液再次脫色。膠中加200ul ACN, EP管加蓋18G注射針頭扎孔的蓋子，speed vac干燥。IOOul還原液50mM的TCEP/25mM NH4HCO3加到EP管中， 600C IOmin ；3000rmp flash 去除上清，力卩 IOOul 洗凈液 25mM NH4HCO3,振搖 lOmin，3 次； 3000rmp flash 去除上清，加堿化液 55mM 碘乙酰胺(Iodoacetamide)/25mM NH4HCO3IOOul, 避光，室溫，30-60min ；3000rmp f lash去除上清，加洗凈液lOOul，振搖lOmin，3次；3000rmp flash去除上清，加脫水液lOOul，振搖5min 3次；3000rmp flash去除上清，加ACN IOOul, speed vac干燥。取10_20ul消化液10ng/ul Trypin/25mM NH4HCO3加入干燥的膠中，冰上30min，使消化液浸透干膠。吸出多余水分，加入與膠等量的25mM NH4HCO3，薄膜包好放入37°C溫箱孵育過夜；消化后的膠中加入50ul抽出液50% TFA，超聲2_;3min，振搖30min， 3000rmp flash，上清含有肽段移入新EP管，speed vac減壓濃縮，殘余膠加入30ul抽出液， 同上處理，合并上清，濃縮至約IOul。點(diǎn)樣板用丙酮輕輕擦拭，加l_2ul基質(zhì)溶液到600um 的anchor上，并用pipette移除液體。Anchor會(huì)自動(dòng)吸收基質(zhì)形成薄膜。滴Iul樣品于 anchor基質(zhì)薄膜上，靜置;3min，不必完全干燥。加2_如1 washing buffer到殘余的液體上，并pipette所有的液體。加Iul結(jié)晶液重結(jié)晶。點(diǎn)樣板裝置于Ultraflex 11-18 TOF/ TOF質(zhì)譜儀，F(xiàn)lex analysis software2. 4獲取肽指紋圖譜。肽段100-122含有Cys-106，核質(zhì)比為2267，2觀3，2299和2258的肽片段峰分別對(duì)應(yīng)含有還原態(tài)(-SH)和氧化態(tài)(-S0H)， (-SO2H), (-SO3H)的 Cys-106。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 1石英晶體微天平OlCM)分析與DJ-I相結(jié)合的化合物QCM是一種高度敏感的質(zhì)量檢測(cè)儀器，能夠記錄金電極芯片表面納克級(jí)質(zhì)量的變化。將原兒茶醛固定在芯片表面，浸入PBS溶液中。芯片振動(dòng)頻率隨時(shí)間的降低反應(yīng)了原兒茶醛結(jié)合蛋白的量以及結(jié)合的速度。圖2所示當(dāng)DJ-I注射到PBS溶液后，QCM記錄到振動(dòng)頻率隨時(shí)間下降，表明DJ-I蛋白不斷的結(jié)合到原兒茶醛分子上。原兒茶醛與DJ-I蛋白結(jié)合的解離常數(shù)Kd為9. 167 χ 10_8。當(dāng)BSA注射到PBS溶液時(shí)，QCM沒有記錄到芯片振動(dòng)頻率的明顯變化。QCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原兒茶醛體外可與DJ-I特異結(jié)合。2. 2原兒茶醛保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞抵抗H2A誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)結(jié)果SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)處理各種濃度原兒茶醛M小時(shí)，然后用325uM，350uM和375uM的 H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激3小時(shí)，MTT分析結(jié)果顯示，在沒有原兒茶醛預(yù)處理的細(xì)胞，H2O2可以引起細(xì)胞毒性導(dǎo)致細(xì)胞活力下降且呈劑量依賴性。預(yù)處理5uM，IOuM和20uM原兒茶醛的細(xì)胞組， 明顯減弱H2A誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，且隨著原兒茶醛劑量的增加，生存的細(xì)胞也隨著增加，呈明顯的劑量依賴關(guān)系(圖3)。2. 3原兒茶醛抗氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制為了確定原兒茶醛針對(duì)DJ-I蛋白的特異性，選用DJ-lkn0Ckd0WnSH-SY5Y細(xì)胞MTT 分析原兒茶醛的抗氧化應(yīng)激損傷的作用。Western blot檢測(cè)DJ-I表達(dá)的水平以確認(rèn)DJ-I 被Knockdown的效率，與轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染DJ-IsiRNA的細(xì)胞DJ-I的表達(dá)降低了約78. 2%。GAPDH(1 1000美國(guó)Abcam公司)為內(nèi)參(圖4A)。在轉(zhuǎn)染了 DJ-IsiRNA 的細(xì)胞中，預(yù)處理原兒茶醛M小時(shí)后，加入H2A誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞的生存率沒有明顯變化，原兒茶醛失去了預(yù)保護(hù)作用。然而在轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞中，三種劑量的原兒茶醛組均表現(xiàn)明顯的保護(hù)作用，劑量依賴關(guān)系仍然存在。在DJ-lknockdown SH-SY5Y細(xì)胞中，MTT分析表明原兒茶醛的抗氧化應(yīng)激作用依賴于細(xì)胞內(nèi)一定量DJ-I蛋白的存在(圖4B，C)。2. 4原兒茶醛清除氧自由基依賴于細(xì)胞內(nèi)DJ-I的正常表達(dá)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平超出細(xì)胞自身抗氧化能力時(shí)，細(xì)胞便產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞損傷。采用氧化還原敏感的熒光探針吐00 0々檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧自由基的水平，評(píng)價(jià)原兒茶醛的清除氧自由基的能力。H2O2可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，在正常SH-SY5Y細(xì)胞和DJ-lknockdown SH-SY5Y細(xì)胞均可見較強(qiáng)的綠色熒光。預(yù)處理20uM原兒茶醛在正常 SH-SY5Y細(xì)胞可以清除氧自由基的產(chǎn)生，綠色熒光明顯減弱。但在DJ-lknockdown SH-SY5Y 細(xì)胞不能完全清除氧自由基，仍然可見較強(qiáng)的熒光。這表明原兒茶醛清除氧自由基的能力依賴于細(xì)胞內(nèi)DJ-I蛋白(圖5)。2. 5 Western blot 分析結(jié)果與PAL㈠/ ㈠組細(xì)胞相比，PAL⑴/ ㈠處理組磷酸化AKT水平明顯增加， 增加到183%。當(dāng)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，PAL (+)/H2O2 (+)處理組的磷酸化AKT水平增加更為明顯，增加到四5%。表明原兒茶醛(PAL)可激活A(yù)KT信號(hào)通路。進(jìn)一步研究顯示，原兒茶醛降低PTEN的表達(dá)，PTEN是AKT激活的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，因此PTEN的低表達(dá)有助于AKT的活化。另外預(yù)處理原兒茶醛可以增加DJ-I的表達(dá)，DJ-I有抑制PTEN的活性的功能，DJ-I表達(dá)的增加有利于激活A(yù)KT信號(hào)通路。Western blot分析顯示原兒茶醛可激活A(yù)KT信號(hào)通路，增加磷酸化AKT的表達(dá)，降低磷酸化PTEN的表達(dá)，輕度上調(diào)DJ-I蛋白的表達(dá)。2. 6原兒茶醛阻止DJ-I蛋白Cys-106的過氧化DJ-I的功能受到106位半胱氨酸殘基氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)，CyslOe的過氧化狀態(tài)-SO2H和-SO3H導(dǎo)致DJ-I功能的喪失。MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜分析Cys 106氧化狀態(tài)顯示，PAL (-)/ ㈠和PAL (+) /H2O2 (-)組，還原態(tài)和-SOH氧化態(tài)的Cysl06占總Cysl06的 71.7%。在H2O2處理組，過氧化狀態(tài)明顯增加，占總和的48.9%。預(yù)處理原兒茶醛時(shí)，可阻止Cysl06的過氧化，-SO2H和-SO3H狀態(tài)恢復(fù)至39. 1%。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，原兒茶醛可阻止DJ-I蛋白Cysioe的過氧化，使細(xì)胞內(nèi)活性狀態(tài)的DJ-I蛋白增加，從而保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞避免死亡。對(duì)比實(shí)驗(yàn)例IMTT法分析19種化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法與材料1. 1實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)驗(yàn)例1中的1. 2 ；1. 2供試化合物19種供試化合物的結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.原兒茶醛在制備預(yù)防或治療由神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷所誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病藥物中的用途。
2.按照權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病。
3.原兒茶醛在制備保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷藥物中的用途。
4.原兒茶醛在制備增加人體內(nèi)DJ-I蛋白表達(dá)的藥物中的用途。
5.原兒茶醛在制備降低人體內(nèi)DJ-I蛋白過氧化狀態(tài)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了原兒茶醛在制備治療人神經(jīng)退行性疾病藥物中的用途。本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)原兒茶醛具有與帕金森病相關(guān)蛋白DJ-1相互作用的活性；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原兒茶醛具有抗氧化應(yīng)激、防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的死亡以及抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生等作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原兒茶醛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用是由DJ-1蛋白所介導(dǎo)，具有確切的神經(jīng)保護(hù)作用，可用于預(yù)防或治療包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102451174SQ20101053019
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者有賀寬芳, 蒲小平, 高建偉 申請(qǐng)人:北京大學(xué)