專利名稱：一種輸送siRNA的免疫納米載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及輸送siRNA的免疫納米載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物界普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，是生物進(jìn)化的產(chǎn)物。具體是指由雙鏈RNA (double strand RNA, dsRNA)指導(dǎo)的，在特定酶參與下，以外源或內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)，在轉(zhuǎn)錄后水平上使特異性靶基因發(fā)生的沉默現(xiàn)象，即不表達(dá)。目前研究表明RNAi廣泛存在于從真菌到高等植物、從無脊椎動物到哺乳動物的大多數(shù)真核生物中，原核生物暫未發(fā)現(xiàn)。RNAi不僅參與了細(xì)胞正常的生長、發(fā)育、衰老和凋亡的調(diào)控，還可使外源基因?qū)霑r或病毒入侵后基因不被表達(dá)，從而成為生物體的一種有效的特異性自我防御機(jī)制。RNA干擾能特異而有效的阻斷靶基因的表達(dá)外源性或內(nèi)源性dsRNA，在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致與其序列同源的分子發(fā)生特異性降解，從而干擾相應(yīng)基因的表達(dá)。dsRNA引起RNA干擾的過程為核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的siRNA，大小約21-2;3bp。siRNA具有一些特征性結(jié)構(gòu)即siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA兩條單鏈末端為5'端磷酸和3'端羥基。此外，每條單鏈的3'端均有2-3個突出的非配對的堿基，這種結(jié)構(gòu)形式對siRNA進(jìn)入蛋白復(fù)合體是必須的。siRNA是RNAi賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義鏈再與體內(nèi)一些酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。攜帶反義鏈的的 RISC 與 mRNA 的互補(bǔ)序列特異性結(jié)合并切割mRNA。被切割后斷裂的mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)特定 mRNA的降解反應(yīng)。RNAi具有普遍、高效、特異、操作簡單等突出優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。胃癌的發(fā)生是一個多步驟多階段的過程，其特征是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。還有凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)、部分自分泌生長因子和受體的過量表達(dá)也與細(xì)胞癌變有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，多個分子標(biāo)志物與胃癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，其中研究較為深入的包括CD44異構(gòu)體6 (CD44 variant isoform 6，CD44v6)。CD44由一個包含20個外顯子的基因編碼，其中10個外顯子是組成型外顯子，另外10個外顯子可選擇性拼接而被稱為變異外顯子(variant exon, vl-vl0)。僅含有組成型外顯子稱為CD44標(biāo)準(zhǔn)體(CD44 standard form，CD44s)，而含有變異外顯子則為 CD44 異構(gòu)體(CD44 variant isoform，CD44v)。CD44s 廣泛存在于在正常組織和癌組織中，而CD44v主要出現(xiàn)在機(jī)體的病理過程，特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。CD44v胞內(nèi)區(qū)域與下游因子的選擇性相互作用在協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)信號通路起著重要作用，如Mio/Ras、酪氨酸激酶途徑等，并與腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲作用密切相關(guān)。CD44v6是目前研究較為廣泛的異構(gòu)體，被認(rèn)為是上皮起源惡性腫瘤，包括肝細(xì)胞癌，乳腺癌，結(jié)直腸癌和胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，尤其是胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移相對特異的分子標(biāo)志物，制備抗CD44v6單鏈抗體用于進(jìn)展期胃癌的生物治療，可以封閉性結(jié)合胃癌組織表達(dá)的CD44v6,阻斷其與細(xì)胞外間質(zhì)或基底膜的正常連接及其所促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移，延緩腫瘤進(jìn)展；破壞CD44v6蛋白在腫瘤細(xì)胞表面形成的糖蛋白偽裝，有利于免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和殺滅，抑制腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。采用RNAi技術(shù)可特異地抑制相關(guān)基因的表達(dá)，使這些基因呈現(xiàn)沉默或休眠狀態(tài).從而達(dá)到腫瘤治療的目的。與傳統(tǒng)的基因治療的方法相比，RNAi能夠?qū)崿F(xiàn)同一基因家族的多個基因同時敲除，且抑制效果互不干擾，因?yàn)槠涮赜械膬?yōu)勢成為基因治療的新策略。siRNA給藥載體的研究和開發(fā)一直是困擾各國科學(xué)家的關(guān)鍵問題。人們一直在研究合適的載體材料能有效地將siRNA藥物分子輸送到靶細(xì)胞和部位，并在一段合理時間維持其功效。目前所采用的載體體系大多是陽離子脂質(zhì)體或水溶性的陽離子聚合物，將這些載體分子與siRNA溶液互混得到二者的復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)傳遞siRNA的目的，這類方法的不足就是不容易放大規(guī)模并且重復(fù)性較差。另外，基于高分子的納米顆粒已經(jīng)廣泛用于從小分子到生物活性DNA分子的傳遞的研究，取得了不菲成績，其中很多成果已經(jīng)用于臨床或臨床試驗(yàn)?？贵w對靶向抗原具有很高的特異性和親和力，因此目前多選用特異抗體作為靶向性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的小分子，并且在疾病診斷、預(yù)防和治療等方面廣泛應(yīng)用。但傳統(tǒng)方法制備的抗體由于分子量大和激發(fā)人體免疫反應(yīng)，且難于通過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，臨床應(yīng)用受限。 基因重組抗體可以制備單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)。scFv由重鏈可變區(qū)(variable domain of the heavy chain, VH)禾口輕鏈可變區(qū)(variable domain of the light chain，VL)通過柔性肽鏈連接起來。由于采用該技術(shù)獲取的人源性scFv總體分子量小，易于通過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，且能保持對抗原的特異識別功能且不攻擊人體的免疫系統(tǒng)。因而，采用scFv作為靶向性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的小分子，在疾病診斷、預(yù)防和治療等方面廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的所解決的技術(shù)問題在于提供輸送siRNA的免疫納米載體，將單鏈抗體與siRNA輸送載體相偶聯(lián)，既具有粒徑小、表面電位合適的理化性質(zhì)，擁有良好 siRNA復(fù)合能力、低細(xì)胞毒性和高轉(zhuǎn)染率，而且是良好的靶向性輸送特性?！矫?，本發(fā)明提供了一種輸送siRNA的免疫納米載體，所述免疫納米載體的活性成分為單鏈抗體與siRNA輸送載體的偶聯(lián)產(chǎn)物，所述siRNA輸送載體為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒。優(yōu)選地，所述單鏈抗體與聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒以等摩爾比構(gòu)建偶聯(lián)產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述聚乙二醇-聚乙烯亞胺為單甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亞胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通過配體交換包裹超順磁性氧化鐵納米粒子。其中，超順磁性氧化鐵納米粒子控制在40-60kD之間，優(yōu)選控制在50_60kD之間， 最優(yōu)為55KD ；聚乙二醇-聚乙烯亞胺控制在40-60kD之間，優(yōu)選控制在40_50kD之間，更優(yōu)地控制在42-48kD之間，最優(yōu)為45KD。例如在本發(fā)明的實(shí)施例2中，即是選擇2kD的單甲基醚聚乙二醇與25kD枝化聚乙烯亞胺以10 1的摩爾比合成聚乙二醇-聚乙烯亞胺；而后再與55kD的超順磁性氧化鐵納米粒子以偶聯(lián)形成的SiRNA輸送載體，通過對膠粒理化性質(zhì)的測試，超順磁性氧化鐵納米粒子占膠粒質(zhì)量的55%。而且結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用上述分子量范圍內(nèi)或者本發(fā)明實(shí)施例中所用的成分，能夠使siRNA載體與待輸送的siRNA有效結(jié)合，提高siRNA的輸送效率，對RNA干擾效果有積極的影響。另外，所述納米顆粒的平均粒徑為60-80nm，表面zeta電位為30_40mV。本發(fā)明實(shí)施例中納米顆粒的平均粒徑優(yōu)選為67. 3士2. Onm，表面zeta電位優(yōu)選為34. 38士 1. 66mV。優(yōu)選地，所述單鏈抗體為人源性CD44v6單鏈抗體，所述人源性CD44v6單鏈抗體基因具有如SEQ ID NO. 1的核素序列，所述人源性⑶44v6單鏈抗體具有如SEQ ID NO. 2的氨基酸序列。另一方明，本發(fā)明還提供了一種真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染液，所述轉(zhuǎn)染液包括siRNA和上述方案中揭示的免疫納米載體，所述siRNA被吸附于免疫納米載體形成復(fù)合物。其中，其中，復(fù)合物的N/P比值計(jì)算公式為
pps (Mg) x45%
ν/ρ 比值=4.2 χ ----
siRNA (μ )優(yōu)選地，所述復(fù)合物的Ν/Ρ比值控制在5-20之間。在合適的Ν/Ρ比值情況下，納米顆粒能夠與siRNA完全結(jié)合形成穩(wěn)定的負(fù)載siRNA分子的納米顆粒。從分子結(jié)構(gòu)上分析，本發(fā)明提供免疫納米載體的活性成分為單鏈抗體與siRNA 輸送載體的偶聯(lián)產(chǎn)物，一方面，單鏈抗體單鏈抗體(single-chain variable fragment, scFv)分子量小，使整個偶聯(lián)產(chǎn)物總體分子量小，不影響免疫納米載體的傳輸性能，易于通過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，而且由于scFv良好的靶向性，能夠保持對抗原的特異識別功能且不攻擊人體的免疫系統(tǒng)。另一方面，本發(fā)明中所用的siRNA輸送載體含有由超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的納米顆粒。其中，聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine, PEI)是一種廣泛采用的高分子納米載體，是一種水溶性的高分子聚合物，具有一級、二級和三級胺，胺基基團(tuán)所帶的陽性電荷和核酸的磷酸基團(tuán)帶的陰性電荷中和，產(chǎn)生強(qiáng)大的核酸親和力，形成穩(wěn)定的PEI/核酸復(fù)合物。此外，PEI突出的優(yōu)勢在于結(jié)構(gòu)靈活，易調(diào)整其分子量，可以通過引入側(cè)鏈和特異靶向性基團(tuán)來修飾多聚物骨架，進(jìn)而調(diào)整和改善載體的性能，其體積比脂質(zhì)體小，易于通過血管內(nèi)皮間隙。然而，PEI和PEI/核酸復(fù)合物有較大的細(xì)胞毒性，而本發(fā)明的siRNA的輸送載體中，通過聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾，構(gòu)成PEG-g-PEI能夠降低細(xì)胞毒性且保證PEI的基因轉(zhuǎn)染效率。需要說明的是，本發(fā)明siRNA的輸送載體用到的PEG是一種常用藥用輔料，具有良好的水溶性， 其分子量當(dāng)控制在200-35，OOODa之間。而超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPI ON)是一禾中高效的磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)造影劑，本發(fā)明的siRNA輸送載體通過將SPION與PEG-g-PEI偶聯(lián)形成 PEG-g-PEI-SPI0N(PPS)，同時具備基因輸送和MRI成像功能，通過MRI這一非侵入性成像技術(shù)能夠及早地發(fā)現(xiàn)腫瘤并更準(zhǔn)確地觀察、分析治療效果。本發(fā)明的siRNA的輸送載體具有良好的生物相容性和可降解性，其在水溶液中自組裝形成納米顆粒，具有合適的理化性質(zhì)， 良好的穩(wěn)定性，制備方法簡單，可重復(fù)性高，同時擁有良好的siRNA復(fù)合能力，低細(xì)胞毒性和高轉(zhuǎn)染率，作為載體能保護(hù)siRNA免于降解，又能結(jié)合納米顆粒本身的尺度效應(yīng)，是一種安全、高效、優(yōu)良的SiRNA輸送載體。另一方面，本發(fā)明所解決的問題還在于提供了一種輸送SiRNA的免疫納米載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將末端帶有羧基和馬來酰亞胺的聚乙二醇水溶液與帶有巰基單鏈抗體混合， 4°C孵育過夜，巰基與馬來酰亞胺偶聯(lián)，形成單鏈抗體-末端帶有羧基的聚乙二醇；(2)復(fù)合溶液用PBS超濾洗滌，截留分子量為5kDa，去除未偶聯(lián)的聚乙二醇；(3)超濾后得到的單鏈抗體-末端帶有羧基的聚乙二醇與SiRNA輸送載體以摩爾比混合，4°C孵育過夜，偶聯(lián)形成輸送siRNA的免疫納米載體；所述siRNA輸送載體為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒；所述siRNA輸送載體和單鏈抗體以等摩爾比構(gòu)建偶聯(lián)產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述單鏈抗體為人源性⑶44v6單鏈抗體，所述人源性⑶44v6單鏈抗體基因具有如SEQ ID NO. 1的核素序列，所述人源性⑶44v6單鏈抗體具有如SEQ ID NO. 2的氨
基酸序列。在本發(fā)明是具體實(shí)施方式
中，以人源性CD44v6單鏈抗體為例，詳細(xì)揭示本發(fā)明的制備方法，具體包括如下步驟(l)MAL-PEG-COOH的水溶液與帶有巰基的ScFvm44v6混合，4°C孵育過夜，巰基與馬來酰亞胺偶聯(lián)，形成scFVeD44v6-PEG-C00H ；(2)復(fù)合溶液用PBS超濾洗滌3-5次，截留分子量為5kDa，去除未偶聯(lián)的 MAL-PEG-C00H ；(3)超濾后得到的sCFVm44v6-PEG-C00H與siRNA輸送載體以摩爾比混合，4°C孵育過夜，偶聯(lián)形成輸送siRNA的免疫納米載體。其中，所述siRNA輸送載體為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒(polyethylene glycol-grafted polyethylenimine and superparamagnetic iron oxide nanoparticles, PEG-g-PEI-SPI0N,簡稱 PPS)；所述 siRNA 輸送載體和人源性 CD44v6 單鏈抗體以等摩爾比構(gòu)建偶聯(lián)產(chǎn)物。其中，所述人源性⑶44v6單鏈抗體通過以下步驟獲取(1)通過T7klect噬菌體展示庫篩選獲?、?4v6單鏈抗體基因，將此基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)將擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)質(zhì)粒pET_30b (+)進(jìn)行Ml I和Not I雙酶切、連接，構(gòu)
建重組質(zhì)粒；(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主，構(gòu)建⑶44v6單鏈抗體原核表達(dá)載體，表達(dá)純化人源性⑶44v6單鏈抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中將具有胃癌靶向性的ScFvm44v6與PPS偶聯(lián)，構(gòu)建胃癌靶向性輸送siRNA的免疫納米微粒s-PPS。通過凝膠阻滯試驗(yàn)證明，在N/P ^ 10時，s-PPS和 PPS均完全復(fù)合siRNA。通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明，s-PPS組細(xì)胞存活率和PPS組相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，說明ScFvm44v6并沒有增加細(xì)胞毒性作用，而且靶向組和非靶向組細(xì)胞均具有極高的存活率。另外，siRNA轉(zhuǎn)染率試驗(yàn)表明，在N/P = 5，10，15和20時，s-PPS和PPS的轉(zhuǎn)染率均超過95%，與lipofectamine相仿，說明本發(fā)明的免疫納米微粒s_PPS和其中用到的siRNA輸送載體PPS均具有siRNA轉(zhuǎn)化能力。同時，通過測定了 3組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度 (mean fluorescence intensity, MFI)， Lipofectamine 組 MFI 最高，明顯高于 s-PPS 組禾口 PPS組，說明Iipofectamine向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染的siRNA數(shù)量最多。該結(jié)果與Iipofectamine轉(zhuǎn)染siCD44v6沉默CD44v6的效果較PPS組明顯相符合。而且s_PPS較PPS轉(zhuǎn)染更多siRNA 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)N/P比值計(jì)算公式，N/P比值越高，承載相同量siRNA所需的納米載體量越多。而細(xì)胞所能胞吞納米載體的數(shù)量是有限的，在納米載體數(shù)量達(dá)到細(xì)胞胞吞的飽和量的情況下，N/P比值越高，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的siRNA數(shù)量則越少。相應(yīng)的，PPS組隨著N/P比值的增加，MFI逐漸下降。然而，配體與受體結(jié)合加強(qiáng)細(xì)胞對納米微粒的內(nèi)吞作用。s-PPS上偶聯(lián)的ScFvm44v6與胃癌細(xì)胞表面⑶44v6抗原結(jié)合，介導(dǎo)內(nèi)吞作用，從而增加s-PPS/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取，體外展現(xiàn)了 s-PPS向胃癌細(xì)胞的腫瘤靶向性輸送siRNA。所以在同一 N/ P比值下，s-PPS組MFI高于PPS組。而隨著N/P比值增加，非靶向組MFI下降，與靶向組的差別則變得明顯。s-PPS和PPS與siNC-Cy3按N/P = 15復(fù)合轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見紅色熒光出現(xiàn)在細(xì)胞胞漿，表明兩組siRNA聚合物均已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且s-PPS 組熒光強(qiáng)度較PPS組強(qiáng)，這與流式細(xì)胞儀檢測MFI結(jié)果相符。由于ScFvm44v6帶有His *Tag 標(biāo)簽蛋白，轉(zhuǎn)染后以FITC標(biāo)記小鼠抗6 XHis tag單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，可見 s-PPS組出現(xiàn)綠色熒光，而PPS組則無綠色熒光出現(xiàn)，說明ScFvm44v6與PPS能夠成功偶聯(lián)。另外，本發(fā)明還公開本發(fā)明的免疫納米載體和真核細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)染液在制備癌癥基因治療藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備胃癌基因治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的免疫納米載體具有良好的生物相容性，同時具有很好的穩(wěn)定性、靶向性和方便制備等特點(diǎn)，在siRNA輸送和基于RNA干擾的疾病治療中具有良好的應(yīng)用前景。


圖IA是本發(fā)明實(shí)施例1中重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖一，圖中M:100bp DNA Marker ；1、2 2個重組質(zhì)粒的Ligation PCR產(chǎn)物。圖IB是本發(fā)明實(shí)施例1中重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖二，M =IOObp DNA Marker ； 1-10 :10個單克隆菌落的菌液PCR產(chǎn)物，圖中可見1-3、5、8-10號單克隆PCR產(chǎn)物大小亦約為llOObp，為合適的克隆菌落。圖2重鏈區(qū)域氨基酸序列分析圖。圖3 是 SDS-PAGE 和 ^festern Blotting 鑒定 ScFvm44v6 表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。其中，A 是實(shí)施例1中SDS-PAGE鑒定試驗(yàn)中蛋白電泳后考馬斯亮藍(lán)染色圖樣。B是實(shí)施例1中針對 ScFvcd44v6表達(dá)做的Wfestern blot檢測結(jié)果圖。其中，Marker 預(yù)染蛋白marker ；1 無IPTG 誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白；2 :IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白；3 :IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌可溶蛋白；4 :IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌包涵體蛋白；5 純化復(fù)性后的scFVm44v6。圖4是ScFvm44v6抗原結(jié)合特異性鑒定試驗(yàn)結(jié)果圖一。其中，A圖中⑶44v6mAb作為一抗與蛋白膜孵育；B圖中ScFvm44v6作為一抗與蛋白膜孵育；C圖中⑶44v6mAb、⑶44mAb 和ScFvm44v6分別作為一抗與蛋白膜孵育。各圖中，M 生物素標(biāo)記蛋白ladder ；1 :SGC_7901 總蛋白；2 重組人可溶性⑶44std。圖5是凝膠阻滯電泳圖。其中，圖A PEG-g-PEI-SPION/siRNA復(fù)合物；圖B
7scFvGD44v6-PEG-g-PEI-SPI0N/siRNA 復(fù)合物。各泳道為 1 裸 siRNA ；2-6 :N/P 比值=2. 5,5, 10，15 和 20。圖6是細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖7A是轉(zhuǎn)染率測定結(jié)果圖。圖7B是MFI測定試驗(yàn)結(jié)果圖。圖8是s-PPS/siRNA復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)分布圖。圖9是MRI成像圖。圖10是腫瘤組織蘇木精-伊紅染色和普魯士藍(lán)染色圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)施手冊中所述的條件。本發(fā)明的以下實(shí)施方式中，將具有胃癌靶向性的ScFvm44v6與siRNA輸送載體PEG -g-PEI-SPION(PEG-g-PEI-SPION(polyethylene glycol-grafted polyethylenimine and superparamagnetic iron oxide nanoparticles, PEG-g-PEI-SPION,簡禾爾 PPS)偶聯(lián)，構(gòu)建胃癌靶向性輸送siRNA的免疫納米微粒SCFVm44v6-PEG-g-PEI-SPI0N(以下簡稱s_PPS)。并以PPS向胃癌細(xì)胞輸送靶向CD44v6基因的siRNA(siCD44v6)為例，研究s_PPS的siRNA復(fù)合能力、細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率、平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)以及細(xì)胞內(nèi)分布等生物學(xué)特性。并觀察其在裸鼠體內(nèi)胃癌靶向性、MRI成像能力，并且揭示了其在制備基因治療藥物尤其是癌癥治療藥物中的應(yīng)用。下列實(shí)施例中，采用的生物材料及其來源為1、細(xì)胞株人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901購買自上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所。人胃正常上皮細(xì)胞株GES-I購買于北京腫瘤研究所。人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375由上海腫瘤研究所惠贈。2、裸鼠雌性裸鼠，4周齡，體重約14_16g，購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SPF級培養(yǎng)。3、主要試劑高糖DMEM培養(yǎng)基GIBCO公司胎牛血清GIBCO公司青、鏈霉素GIBCO公司胰蛋白酶GIBCO公司PBS緩沖液GIBCO公司PEG-g-PEI-SPION中山大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院合成Lipofectamine 2000Invitrogen 公司siCD44v6、siNC、siNC-Cy3廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成亞鐵氰化鉀廣州化學(xué)制藥廠CD44v6、β-actin 引物寶生物工程(大連)有限公司合成6 χ DNA上樣緩沖液廣州威佳公司膠體金溶液中山二院中心實(shí)驗(yàn)室MTTSigma公司DMSO廣州威佳公司TRIZOLInvitrogen 公司焦碳酸二乙酯(DEPC)廣州威佳公司；異丙醇廣州化學(xué)制藥廠氯仿廣州化學(xué)制藥廠PrimeScriptTMRT 試劑盒寶生物工程(大連)有限公司SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒寶生物工程(大連)有限公司RIPA裂解液上海碧云天公司PMSF上海碧云天公司BCA-100蛋白定量試劑盒預(yù)染蛋白marker ECL化學(xué)發(fā)光液小鼠抗人CD44v6單克隆抗體小鼠抗人β -actin單克隆抗體 HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體 Cultrex Basement Membrane Extract (BME) 結(jié)晶紫實(shí)施例1、scFvcd44v6的表達(dá)純化按照如下步驟實(shí)現(xiàn)ScFvm44v6的表達(dá)純化(1)通過T7klect噬菌體展示庫篩選獲?、?4v6單鏈抗體基因，將此基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。⑶44v6單鏈抗體基因通過T7klect噬菌體展示庫篩選獲取，在克隆區(qū)域的上、下游分別含有T7klect引物序列。其中，人源性⑶44v6單鏈抗體基因具有如SEQ ID NO. 1 的核素序列，人源性⑶44v6單鏈抗體具有如SEQ ID NO. 2的氨基酸序列。其中，克隆區(qū)域的上、下游分別含有T7klect引物序列為T7Select Up primer 5' -GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3‘ <SEQ ID NO. 3>T7Select Down primer 5' -AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3' <SEQ ID NO. 4>(2)將擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)質(zhì)粒pET_30b (+)進(jìn)行Ml I和Not I雙酶切、連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。ScFvcd44v6 基因兩端具有 1(5' _G*TCGAC_3')和 Not 1(5' -GC*GGCCGC-3 ‘) 雙內(nèi)切酶位點(diǎn)，將基因擴(kuò)產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，用T4多聚核苷酸激酶進(jìn)行末端去磷酸化，而后純化回收目的DNA片段；將質(zhì)粒pET_30b (+)進(jìn)行類似Ml I和Not I雙酶切和末端去磷酸化處理，而后采用T4DNA連接酶將ScFvm44v6基因與pET_30b (+)質(zhì)粒重組連接；而后采用如下引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，檢測電泳圖如圖IA所示T7promoter primer 5' -TAATACGACTCACTATAGG-3‘ <SEQ ID NO. 5>T7terminator primer 5' -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3‘ <SEQ ID NO. 6>再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至克隆宿主菌大腸桿菌DH5 α中，通過上述Τ7 promoter primer和T7 terminator primer，進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖IB所示；CD44v6單鏈抗體基因與pET_30b(+)質(zhì)粒經(jīng)Ml I和Not I雙酶切、連接后，首先通過ligation PCR初步鑒定重組質(zhì)粒連接成功。如圖IA所示，重組質(zhì)粒的Ligation PCR產(chǎn)物大小約為llOObp，符合預(yù)計(jì)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 α，挑取多個單克隆菌落，其菌液 PCR產(chǎn)物大小亦約為IlOObp (圖1Β)。選取陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果證實(shí)ScFvm44v6基
上海申能博彩公司 Fermentas 公司晶美生物工程公司 Bender公司 Sigma公司 Jackson 公司 R&D公司
上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司因大小為756bp，其中l(wèi)-390bp，391-435bp以及436_756bp分別編碼ScFvm44v6重鏈區(qū)域、 (Gly4Ser)3Iinker區(qū)域和輕鏈區(qū)域。然而由于在重鏈序列末端出現(xiàn)終止子，翻譯中斷，所以 SCFVcd44v6僅含有重鏈區(qū)域，其氨基酸序列分析如圖2所示。根據(jù)菌落PCR鑒定結(jié)果，選擇合適的菌株進(jìn)行質(zhì)粒抽提，獲取重組質(zhì)粒。(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主，構(gòu)建⑶44v6單鏈抗體原核表達(dá)載體，表達(dá)純化人源性⑶44v6單鏈抗體。采用BL21 (DE3)plysS作為ScFvm44v6表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)CD44v6單鏈抗體的表達(dá)，而后通過通過SDS-PAGE和Wfestern blot檢測目的蛋白ScFvm44v6表達(dá)的部位、分子量大小以及是否含有His · Tag標(biāo)簽蛋白。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)plysS后，在IPTG誘導(dǎo)作用下表達(dá)外源基因蛋白scFVq)44v6。IPTG誘導(dǎo)后將細(xì)菌裂解提取總蛋白、可溶蛋白、包涵體蛋白以及純化的 SCFVcd44v6進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，初步鑒定ScFvm44v6在細(xì)菌的表達(dá)部位及其分子量大小。如圖3所示，A圖中，IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白、包涵體蛋白較無IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白增加了一條大小約20kDa條帶，且這一條帶與Ni柱純化、復(fù)性后蛋白的大小一致，證實(shí)ScFvm44v6 表達(dá)部位在包涵體，其分子量大小為20kDa。B圖中，Western blot試驗(yàn)為進(jìn)一步證實(shí) SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果并證明ScFvm44v6帶有His · Tag標(biāo)簽蛋白。另外，對ScFvm44v6的抗原特異性進(jìn)行鑒定，一方面，通過Western blot分析證實(shí) SCFVcd44v6與小鼠抗人CD44v6單克隆抗體所結(jié)合的抗原一致，選取在前期研究中已證實(shí)表達(dá)CD44v6的人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Wfestern blot試驗(yàn)。另一方面，并以重組人可溶性⑶44std蛋白作為對照，證實(shí)ScFvm44v6結(jié)合的抗原是⑶44v6而不是 CD44std。將SGC-7901細(xì)胞總蛋白與重組人可溶性CD44std蛋白上樣，分別以CD44v6mAb、 CD44std mAb、ScFvm44v6為一抗進(jìn)行Wfestern blot試驗(yàn)。如圖4A和4B所示，當(dāng)上樣蛋白為 SGC-7901總蛋白，分別以ScFvm44v6和CD44v6mAb作為一抗與蛋白膜孵育，兩者所出現(xiàn)的條帶大小相一致。當(dāng)上樣蛋白為重組人可溶性⑶44std，以ScFvm44v6和⑶44v6mAb作為一抗與蛋白膜孵育，兩者均沒有出現(xiàn)條帶(圖4C)。而CD44mAb能同時檢測到SGC-7901總蛋白中的 ⑶44std以及重組人可溶性⑶44std，兩者出現(xiàn)的條帶大小相一致。從而證實(shí)SGC-7901同時表達(dá)CD44v6和CD44std，而ScFvm44v6僅與CD44v6結(jié)合，并且所出現(xiàn)條帶大小與CD44v6mAb 相同。實(shí)施例2、PPS納米顆粒的制備1、聚乙二醇接枝聚乙烯亞胺(mPEG-g-PEI)的合成。稱取4. Og單甲基醚聚乙二醇(mPEG-0H，2kD)于干燥兩口瓶中60°C真空干燥8h， 冷卻后Ar保護(hù)下加入30mL已干燥的四氫呋喃(THF)，充分溶解。稱取N，N，-羧基二咪唑 (⑶I) 3. 2g置于另一干燥兩口瓶中，Ar保護(hù)下將溶有mPEG-OH的THF溶液緩慢滴加到兩口瓶中，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h。加入200 μ L水使過量的⑶I失活，反應(yīng)進(jìn)行0.證，用大量無水乙醚沉淀2次，過濾后干燥得白色粉末狀固體。再稱取支化聚乙烯亞胺(hy-PEI，25kD) 1. Ig和上述白色粉末0. 8g共溶于20mL CHCl3,室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)Mh。而后通過再生纖維透析除去CHCl3,部分溶質(zhì)在常壓下?lián)]發(fā)，將濃縮后的溶液用大量無水乙醚沉淀3次，收集沉淀物干燥得白色粉末狀固體，產(chǎn)率為80%。對產(chǎn)物進(jìn)行核磁共振分析(H-NMR)，其結(jié)果為A-NMR inCDCl3 2. 5-2. 9ppm(m, -CH2CH2NH-)，3. 4ppm(s, CH3-OCH2CH2-)，3. 65ppm(s, -OCH2CH2-)， 4. 2ppm(t,-OCH2CH2-O(C = 0)) 0與理論值相符，從而表明Pi7G成功接枝于PEI分子鏈中。2、PPS 的制備。將300mg mPEG-g-PEI溶解于3ml氯仿中，而后使15mg超順磁性氧化鐵納米粒子 (SPION, 55kD)均勻分散于該溶液中，室溫下繼續(xù)攪拌過夜。而后加入大量正己烷沉淀，離心收集沉淀物，用正己烷洗滌2次，而后進(jìn)行真空干燥除去有機(jī)溶劑。將上述得到的產(chǎn)物通過超聲波均勻溶解于雙蒸水，并通過200nm超濾膜除去大的凝聚顆粒。需要說明的是，實(shí)施例1僅僅是本發(fā)明中制備PPS的一種實(shí)現(xiàn)方式，其中采用的單甲基醚聚乙二醇(mPEG-OH，2kD)和二支化聚乙烯業(yè)胺(hy-PEI，25kD)均購自Sigma公司， 而超順磁性氧化鐵納米粒子(SPI0N，55kD)由中山大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院合成提供，PPS也是根據(jù)實(shí)施例1中方案委托中山大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院合成，通過對膠粒理化性質(zhì)的測試，超順磁性氧化鐵納米粒子占膠粒質(zhì)量的55 %。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，對于PPS的制備也會根據(jù)需要，對其用料和方法上做出調(diào)整，以實(shí)現(xiàn)解決本發(fā)明的技術(shù)問題為準(zhǔn)。為此， 本發(fā)明的技術(shù)方案中，超順磁性氧化鐵納米粒子控制在40-60kD之間，優(yōu)選控制在50-60kD 之間，最優(yōu)為^KD ；聚乙二醇-聚乙烯亞胺控制在40-60kD之間，優(yōu)選控制在40-50kD之間， 更優(yōu)控制在42-48kD之間，最優(yōu)為45KD。而PPS納米顆粒的平均粒徑則應(yīng)控制在60_80nm 之間，表面zeta電位為30-40mV。采用上述分子量范圍內(nèi)或者本發(fā)明實(shí)施例中所用的成分， 能夠使siRNA載體與待輸送的siRNA有效結(jié)合，提高siRNA的輸送效率，對RNA干擾效果有積極的影響。實(shí)施例3、PPS/siRNA和s-PPS/siRNA復(fù)合物的制備及其理化性質(zhì)的測定1、PPS/siRNA復(fù)合物的制備及其理化性質(zhì)的測定(I)PPS溶于滅菌去離子水，按照不同的N/P比值，將一定量的siRNA溶液與PPS溶液在去離子水或PBS中輕輕混勻，室溫下靜置孵育10-15分鐘，即得到不同N/P值的PPS/ siRNA復(fù)合物。其中，PPS/siRNA N/P比值計(jì)算公式
PPS (Mg) X45%
ν/ρ 比值=4.2 χ ----
siRNA (μ )(2)粒徑和電位的測定按Ν/Ρ比值5，10，15，20形成PPS/siRNA復(fù)合物，各復(fù)合物所含siRNA量設(shè)定為 10 μ g，用去離子水稀釋至500 μ 1，用kta-Plus粒度分析儀測定復(fù)合物的粒徑和電位。每個樣本測定5次，所得數(shù)值表示為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差。測定結(jié)果表明，PPS的平均粒徑是67. 3 士 2. Onm，表面zeta電位為34. 38 士 1. 66mV。 當(dāng)其與siRNA復(fù)合形成PPS/siRNA復(fù)合物后，粒徑和電位隨N/P比值的增加而變化，詳見表 1。N/P = 5和10時，復(fù)合物粒徑分別為98. 5 士 2. 2nm和93. 8 士0. 6nm，隨著N/P比值增加粒徑縮小，當(dāng)N/P = 20時復(fù)合物粒徑為88. 4士2. 6nm。此外，復(fù)合物的zeta電位隨著N/P 比值增加而增大，N/P = 5和10時，zeta電位分別為4. 18士0. 18mV和15. 10士0. 64mV，而 N/P = 20 時，zeta 電位增加至 18. 22士 1. 20mV。表1不同N/P比值下PPS/siRNA復(fù)合物的粒徑和電位
權(quán)利要求
1.一種輸送SiRNA的免疫納米載體，其中，所述免疫納米載體的活性成分為單鏈抗體與siRNA輸送載體的偶聯(lián)產(chǎn)物，所述siRNA輸送載體為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫納米載體，其中，所述單鏈抗體與聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒以等摩爾比構(gòu)建偶聯(lián)產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA輸送載體，其中，所述聚乙二醇-聚乙烯亞胺為單甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亞胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通過配體交換包裹超順磁性氧化鐵納米粒子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA輸送載體，其中，所述超順磁性氧化鐵納米粒子的分子量控制在40-60kD之間，聚乙二醇-聚乙烯亞胺的分子量控制在40-60kD之間；所述納米顆粒的平均粒徑為60-80nm，表面zeta電位為30_40mV。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫納米載體，其中，所述單鏈抗體為人源性CD44v6單鏈抗體，所述人源性⑶44v6單鏈抗體基因具有如SEQ ID NO. 1的核素序列，所述人源性⑶44v6 單鏈抗體具有如SEQ ID NO. 2的氨基酸序列。
6.一種輸送siRNA的免疫納米載體的制備方法，其包括如下步驟(1)將末端帶有羧基和馬來酰亞胺的聚乙二醇水溶液與帶有巰基單鏈抗體混合，4°C孵育過夜，巰基與馬來酰亞胺偶聯(lián)，形成單鏈抗體-末端帶有羧基的聚乙二醇；(2)復(fù)合溶液用PBS超濾洗滌，截留分子量為5kDa，去除未偶聯(lián)的聚乙二醇；(3)超濾后得到的單鏈抗體-末端帶有羧基的聚乙二醇與siRNA輸送載體以摩爾比混合，4°C孵育過夜，偶聯(lián)形成輸送siRNA的免疫納米載體；所述siRNA輸送載體為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒；所述siRNA輸送載體和單鏈抗體以等摩爾比構(gòu)建偶聯(lián)產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，所述單鏈抗體為人源性CD44v6單鏈抗體，所述人源性⑶44v6單鏈抗體基因具有如SEQ ID NO. 1的核素序列，所述人源性⑶44v6單鏈抗體具有如SEQ ID NO. 2的氨基酸序列。
8.一種真核細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)染液，其中，所述轉(zhuǎn)染液包括siRNA和如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的免疫納米載體，所述siRNA被吸附于免疫納米載體形成復(fù)合物。
9.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的免疫納米載體在制備癌癥基因治療藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求8所述的真核細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)染液在制備癌癥基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輸送siRNA的免疫納米載體，所述免疫納米載體的活性成分為單鏈抗體與siRNA輸送載體的偶聯(lián)產(chǎn)物，所述siRNA輸送載體為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵納米顆粒。另外本發(fā)明還公開了該免疫納米載體的制備方法。本發(fā)明免疫納米載體將單鏈抗體與siRNA輸送載體相偶聯(lián)，既具有粒徑小、表面電位合適的理化性質(zhì)，擁有良好siRNA復(fù)合能力、低細(xì)胞毒性和高轉(zhuǎn)染率，而且是良好的靶向性輸送特性，在siRNA輸送和基于RNA干擾的疾病治療中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK102337298SQ20111024028
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者陳茵婷, 黃開紅 申請人:陳茵婷, 黃開紅