專利名稱：淋巴因子制劑和用其局部或局部和系統(tǒng)地控制細胞增生性疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于定位持續(xù)遞送淋巴因子到溫血動物的領(lǐng)域。具體地講，本發(fā)明涉及治療用制劑和用其局部或局部和系統(tǒng)地控制細胞增生性疾病的方法。
背景技術(shù)：
對免疫系統(tǒng)認識的最新發(fā)展已經(jīng)導(dǎo)致了免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑的鑒定，這些免疫調(diào)節(jié)劑通常稱為細胞因子，或者，如果是由淋巴細胞產(chǎn)生，則稱為淋巴因子。Rosenberg，Steven A.″The Immunotherapy and GeneTherapy of Cancer.″J.Clin.Oncology 10180-199(1992)。細胞因子是主要、但不只是由免疫系統(tǒng)的細胞分泌的小蛋白，它們促進其他細胞的增生和/或分化功能。細胞因子的例子包括白介素、干擾素、生血性集落刺激因子(CSF)和促炎因子，如腫瘤壞死因子(TNF)。細胞因子和相關(guān)腫瘤調(diào)節(jié)劑的施用可以使患各種類型腫瘤的病人產(chǎn)生客觀腫瘤應(yīng)答。Sarna，Gregory等，″A Pilot Study of Intralymphatic Interleukin-2.II.Clinical andBiological Effects″，J.Biol.Response Modifiers，981-86(1990)。然而，目前的細胞因子施用方式通常伴隨著毒性，從而限制了這些藥物的治療價值。
白介素-2(IL-2)是一種由正常外周血淋巴細胞在暴露于植物凝集素、抗原或其他刺激物后產(chǎn)生的淋巴因子，其誘導(dǎo)抗原或有絲分裂原刺激的T細胞的增生，白介素-2首先由Morgan，D.A.等，Science(1976)，1931007-1008報道。IL-2作用于三種主要類型的淋巴細胞T細胞、B細胞和NK細胞，刺激它們增生和增強它們的分化功能。IL-2不但通過刺激NK細胞而增強先天性的或天然的宿主防御功能，而且通過刺激T細胞和B細胞增強抗原特異性獲得的免疫反應(yīng)。IL-2最初通過培養(yǎng)人外周血淋巴細胞(PBL)或其他生產(chǎn)IL-2的細胞系得到，描述于，例如美國專利號4,401,756。重組DNA技術(shù)提供了PBL和其他細胞系的替代物以生產(chǎn)IL-2。Taniguchi，T.等，Nature(1983)，302305-310和Devos，R.，Nucleic AcidsResearch(1983)，114307-4323報道了在微生物中人IL-2基因的克隆和表達。
美國專利號4,518,584描述并要求保護突變的IL-2蛋白，其中通常在野生型或天然分子的125位發(fā)生的半胱氨酸被中性氨基酸(如絲氨酸或丙氨酸)所替代。美國專利號4,530,787和4,569,790公開并要求保護純化重組天然IL-2及其突變蛋白的方法以及純化形式的IL-2。美國專利號4,604,377公開了合適于在藥學上可接受的水性載體中復(fù)制的IL-2組合物，該組合物含有氧化的、微生物生產(chǎn)的重組IL-2。
一些稱為輔助T細胞的淋巴細胞亞群在應(yīng)答腫瘤抗原時分泌少量的IL-2。該種IL-2局部作用于腫瘤抗原刺激位置以激活介導(dǎo)系統(tǒng)性腫瘤細胞破壞的細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞。靜脈內(nèi)、淋巴內(nèi)和疾病部位內(nèi)施用IL-2可以使某些癌癥患者體內(nèi)產(chǎn)生臨床上重要的應(yīng)答。已經(jīng)表明，高劑量的系統(tǒng)性施用重組IL-2導(dǎo)致在小鼠中已經(jīng)形成的轉(zhuǎn)移性癌的退化，并且在人體內(nèi)刺激淋巴因子激活的殺傷細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞。Rosenberg等，J.Exp.Med.(1985)1611169-1188；Rosenberg，S.等，NewEng J.Med.(1985)3131485-1492；Rosenberg等，Science(1986)2331318-1321)。然而，嚴重毒性(低血壓和水腫)限制了靜脈內(nèi)和淋巴內(nèi)施用IL-2的劑量和功效。Hoover，H.C.Jr.等.Cancer Res.(1984)，44(4)1671-6。系統(tǒng)性施用淋巴因子的毒性并不奇怪，因為這些藥物介導(dǎo)局部細胞相互作用且它們通常只是微量分泌。此外，其他淋巴因子，如白介素-4(IL-4)、干擾素α(α-INF)和干擾素γ(γ-INF)已被用于刺激腫瘤細胞的免疫應(yīng)答。像IL-2一樣，現(xiàn)今的施用方式具有不利的副作用。
為了解決系統(tǒng)性施用IL-2的毒性問題，一些研究人員已經(jīng)試驗了IL-2的疾病部位內(nèi)注射。該方法消除了伴隨著系統(tǒng)性IL-2施用的毒性。然而，需要多次疾病部位內(nèi)注射以優(yōu)化療效。Bubenik，J.等，ImmunologyLetters.23287-292(1989/1990)；Borden，Ernest C.和Sondel，Paul MCancer.1990 Feb 1；65(3 Suppl)800-14；Rosenberg，Steven A.等，108853-864(1988)。所以，這些注射對許多病人是不切實際的，特別是當沒有潛在的發(fā)病率并且腫瘤位置無法注射時尤其如此。
美國專利號6,045,788中述及，低劑量的天然和重組IL-2可以連續(xù)的施用于病人以延長作用時間，例如長于3月，以激活和/或刺激他們的免疫系統(tǒng)同時又不產(chǎn)生顯著的毒性。然而，需要經(jīng)常施用以延長作用時間，或者，需要最優(yōu)的緩釋制劑，但是在上述專利中沒有描述該種緩釋制劑。
除了潛在的毒性外，系統(tǒng)性施用IL-2的另一個問題是快速的腎清除。當IL-2被靜脈施用時，其很快被清除，最初清除半衰期和末期清除半衰期分別為6到12分鐘和40到80分鐘。
因此，需要一種IL-2制劑，其在被局部施用于溫血動物后形成含IL-2的貯庫制劑。該含有IL-2的貯庫制劑提供了IL-2的連續(xù)的、長期的釋放，足以刺激局部或局部和系統(tǒng)地起作用的細胞毒性T淋巴細胞(CTTL)而不產(chǎn)生不可接受的副作用。本發(fā)明制劑中另一種用作可注射的或可植入的聚合藥物載體的最佳材料應(yīng)該是可生物降解的和可與藥物配伍的，并且施用后能和簡單的、安全溶劑(如水)組合，而不需要額外聚合或其他共價鍵形成的反應(yīng)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有具有熱可逆性明膠性質(zhì)的生物可降解的嵌段共聚藥物載體和有效量的淋巴因子的治療制劑，所述制劑可以腫瘤內(nèi)/腫瘤周圍施用并且形成含有淋巴因子的貯庫制劑。該含有淋巴因子的貯庫制劑提供了連續(xù)的、長期釋放的淋巴因子(如IL-2)以足夠產(chǎn)生局部或局部和系統(tǒng)性作用的細胞毒性T淋巴細胞而不會導(dǎo)致任何顯著的不需要的系統(tǒng)性副作用。術(shù)語“淋巴因子”指具有IL-2或其他白介素活性的藥物，包括天然的、重組的和突變的IL-2或其他白介素及其類似物和衍生物。優(yōu)選的細胞因子可選自白介素-2(IL-2)、白介素-4、白介素-12和它們的衍生物。
本發(fā)明還提供了將高毒性藥物，即IL-2或其他淋巴因子轉(zhuǎn)化成具有最小的不可接受的副作用的完全有效的藥物的方法，該方法包括將IL-2或其他細胞因子整和到生物可降解藥物載體中，局部施用后該載體能夠形成含有藥物的貯庫制劑。優(yōu)選地，該生物可降解藥物載體具有熱可逆性明膠的性質(zhì)，即這些藥物載體在體溫以下處于液體狀態(tài)，但當它們受熱時轉(zhuǎn)變成凝膠或固態(tài)狀態(tài)，并且在體溫或接近體溫時以凝膠的形式存在。在該公開的其余部分，將其統(tǒng)稱為IL-2，除非另外說明，本發(fā)明擴展到此處包括的所有藥物。優(yōu)選IL-2是重組人IL-2。
本發(fā)明還提供治療或預(yù)防溫血動物宿主腫瘤的方法，該方法包括對所述宿主局部施用含有有效量的IL-2或其他細胞因子的制劑，該制劑用具有熱可逆性明膠性質(zhì)的生物可降解藥物載體配制。
本發(fā)明可用于治療/治愈細胞增生性疾病(如癌癥或疣)。當局部施用時，本發(fā)明制劑提供了直接對待治療的患病組織，即腫瘤或疣，的高水平IL-2或其他淋巴因子的局部緩釋(相對于系統(tǒng)性暴露仍然是較低的總劑量)，刺激在局部位置和全身攻擊細胞毒性T淋巴細胞的產(chǎn)生而不會導(dǎo)致不可接受的系統(tǒng)性副作用。如果沒有本制劑中使用的藥物載體，則由于在CTTL刺激發(fā)生前，IL-2從注射位點被快速清除而導(dǎo)致大部分的失效。因為該藥，即IL-2或其他淋巴因子，可以刺激機體自身的防御功能從而攻擊患病組織，消除了抗藥性的潛在問題。因此，本發(fā)明提供了通過簡單的、低劑量局部注射治療多種類型的局部和轉(zhuǎn)移性癌癥的制劑和方法。本發(fā)明制劑可以在每日到每月的范圍內(nèi)間隔地施用。本發(fā)明制劑還從定位注射某個劑量的IL-2而提供局部的或局部和系統(tǒng)性的抗癌治療，如果采用系統(tǒng)施用，該IL-2將是亞治療的。
附圖簡述考慮到下面的詳細說明和附圖，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將變得顯而易見根據(jù)實施例1，

圖1A闡明了IL-2制劑的IL-2體外釋放，通過ELISA分析和監(jiān)測。
根據(jù)實施例1，圖1B闡明了IL-2制劑的IL-2體外釋放，通過細胞增生測定法分析和監(jiān)測。
根據(jù)實施例1，圖2闡明了IL-2制劑的細胞毒性測定結(jié)果，通過特異性細胞裂解百分比測量。
根據(jù)實施例1，圖3闡明了施用IL-2制劑對纖維肉瘤腫瘤生長的影響，通過腫瘤大小隨時間發(fā)生的改變測量。
根據(jù)實施例4，圖4闡明了IL-2制劑的體外IL-2釋放，通過ELISA監(jiān)測。
根據(jù)實施例4，圖5闡明了施用IL-2制劑劑量遞增對腫瘤生長的影響，通過腫瘤大小隨時間發(fā)生的改變測量。
根據(jù)實施例4，圖6闡明了反復(fù)施用IL-2制劑對腫瘤生長的影響，通過腫瘤大小隨時間的發(fā)生的改變測量。
根據(jù)實施例4，圖7闡明了反復(fù)施用IL-2制劑對MetA纖維肉瘤腫瘤模型中小鼠存活率的影響。
根據(jù)實施例4，圖8闡明了反復(fù)施用IL-2制劑對B16黑素瘤腫瘤模型中小鼠存活率的影響。
發(fā)明詳述在公開和描述該治療制劑及用于藥物遞送(尤其是用于IL-2遞送)的使用方法之前，應(yīng)該明白本發(fā)明并不限于此處公開的這些特定的方式、方法步驟和材料。這些方式、方法步驟和材料可以有一定的改變，這些改變均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。還應(yīng)該明白此處所用的術(shù)語只是用于描述特定實施方案而并不是要限定本發(fā)明的范圍，因為本發(fā)明的范圍只被所附的權(quán)利要求書及與其等同物所限定。
必須注意到，該說明書和所附的權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)，除非上下文明確地表示單數(shù)形式。所以，例如，遞送“一種藥物”的組合物包括一種、兩種或多種藥物。在描述和要求保護本發(fā)明時，將根據(jù)下面列出的定義使用下列術(shù)語。
“腸胃外的”指腫瘤內(nèi)的、腫瘤周圍的、疾病部位內(nèi)的、疾病部位周圍的、鞘內(nèi)的、腹膜內(nèi)的和腹內(nèi)的。
術(shù)語“細胞增生疾病”包括細胞增生和分化疾病，通常認為是瘤的或惡性的，如癌。癌包括，例如癌、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤等等。術(shù)語“癌”還包括前癌組織和細胞，如果不進行治療的話，它們會發(fā)展成真正的癌。細胞增生疾病的其他例子是疣。
術(shù)語“治療性的”治療指在用本領(lǐng)域的任何方法檢測病人患癌后(即確定了患有腫瘤后)，對病人施用一種藥物(特別是IL-2)以期減輕或消除存在的腫瘤。
術(shù)語“預(yù)防性的”治療指在進行了治療性治療后的預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的施用。
術(shù)語“藥理學有效量”指此處的方法或組合物的每種活性成分的量，該量足夠顯示出對病人有意義的好處，即，延長生命和/或減輕疾病和/或任何臨床上顯著性的改善。當使用此處定義的有效量時，用組合比單獨施用每種成分更有功效。如對患者單獨施用一種活性成分，那么該術(shù)語只指該成分；當組合使用時，該術(shù)語指有治療或預(yù)防效果的制劑中的組合的量。
術(shù)語“重組的”指由重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的藥物，其中，對于IL-2這一特例，用已知的重組DNA技術(shù)克隆編碼IL-2的基因。
術(shù)語“藥學上可接受的”指一種載體介質(zhì)，其不干擾藥物的生物學活性的有效性且對所施用的宿主沒有毒性。
“凝膠化溫度”指生物可降解嵌段共聚物經(jīng)歷熱可逆性凝膠化的溫度。換句話說，低于該溫度時，該嵌段共聚物明顯是可溶的或以在水中均一的膠狀系統(tǒng)存在和以自由流動的液體存在，高于該溫度時，該嵌段共聚物經(jīng)歷相變而增加粘度或形成半固態(tài)凝膠。術(shù)語“凝膠化溫度”和“熱可逆性凝膠化溫度”等等將可以互換使用，表示凝膠化溫度。
“聚合物溶液”，“水性溶液”，“溶液”，“均勻溶液”等等當用于表示包含于這樣的溶液中的生物可降解嵌段共聚物時，指一種基于水的溶液，該溶液含有功能濃度的溶解于其中的或均一膠狀狀態(tài)的嵌段共聚物，并且該溶液保持在該嵌段共聚物凝膠化溫度以下的溫度。它們包括沒有添加劑的水或含有在制備藥物組合物中常用的添加劑或賦形劑(如pH緩沖劑、張力調(diào)節(jié)組分、抗氧化劑、防腐劑、藥物穩(wěn)定劑等)的水性溶液。
“熱可逆性凝膠化”是一種當溶液溫度升高到嵌段共聚物的凝膠化溫度以上時，該嵌段共聚物溶液自發(fā)地增加粘度，許多情況下轉(zhuǎn)變成半固態(tài)凝膠。在本發(fā)明中，術(shù)語“凝膠”包括半固態(tài)凝膠和在凝膠化溫度以上存在的高粘度狀態(tài)。當冷卻至低于凝膠化溫度時，該凝膠在幾分鐘到幾小時之內(nèi)自發(fā)逆轉(zhuǎn)而重新形成較低粘度的自由流動的液體。產(chǎn)生該凝膠的所有相互作用都是物理的，并且不涉及共價鍵的形成或斷裂。
“藥物遞送液體”或“具有熱可逆性凝膠性質(zhì)的藥物遞送液體”指含有適合施用于溫血動物的藥物(藥物本身可以溶解、分散或是膠狀的)的聚合物溶液。當溫度升高到或高于藥物遞送液體的凝膠化溫度時，該含有藥物的聚合物溶液形成一種凝膠化藥物貯庫制劑。
“貯庫制劑”指身體中含有濃縮活性物質(zhì)或藥物的局部化位點。形成貯庫制劑的制劑的例子為凝膠、植入劑、微球體、基質(zhì)、微粒等。
“凝膠”指半固相，隨著“聚合物溶液”或“藥物遞送液體”溫度升高至或高于嵌段共聚物的凝膠溫度，半固相狀態(tài)自發(fā)形成。
“凝膠混合物”或“三嵌段共聚物混合物”指含有兩種或兩種以上的ABA或BAB三嵌段共聚物組分的熱可逆性凝膠系統(tǒng)。通過簡單混合兩種或兩種以上單獨合成的三嵌段共聚物組分或者通過在一個合成容器中合成兩種或兩種以上類型的共聚物系統(tǒng)產(chǎn)生的混合物。用上面兩種方法制備的混合物可以與水組合形成聚合物溶液，該聚合物溶液可有相同或不同的凝膠特性和凝膠質(zhì)量。
“溶液”，“溶解的”和所有其他術(shù)語指一種溶液或溶解狀態(tài)，包括均勻溶液、微束溶液或任何表觀上均一的膠體狀態(tài)，如乳液或懸液。
“生物可降解的”指在身體內(nèi)可化學分解或降解形成無毒組分的嵌段共聚物。降解的速率可以和藥物釋放速率相同或不同。
“藥物”指可以采用或用于治療目的的具有生物或藥理學活性的任何有機或無機化合物或物質(zhì)。
“肽”，“多肽”，“寡肽”和“蛋白質(zhì)”當表示肽或蛋白藥物時，將可以互換地使用，并且不限于任何特定的分子量、肽序列或長度、生物活性領(lǐng)域或治療用途，除非專門說明。
“白介素”指具有白介素活性、特別是IL-2和IL-12活性的任何蛋白質(zhì)/多肽藥物或其衍生物、類似物或模擬物，包括天然和重組IL-2和IL-12，天然和重組白介素的藥學上可接受的融合蛋白、它們的衍生物和混合物。
“hIL-2”指顯示出具有人白介素-2活性特征的蛋白。特別地，該蛋白必須能夠刺激hIL-2依賴的細胞溶解和輔助T細胞系的增生，如S.Gillis等，J.Immunol.(1978)1202027-2032和J.Watson，J.Exp.Med.(1979)1501510-1519中的標準測定方法所列出的那樣。修飾的IL-2和IL-12也包括在該定義中，只要該修飾沒有破壞生物學活性。
“PLGA”指從縮合共聚乳酸和乙醇酸或者通過開環(huán)共聚乳酸酯和乙醇酸酯得到的共聚物或共聚物基。術(shù)語乳酸和乳酸酯可互換使用；乙醇酸和乙醇酸酯也可互換使用。
“PLA”指通過縮合乳酸或通過開環(huán)聚合乳酸酯得到的聚合物。
“PGA”指通過縮合乙醇酸或通過開環(huán)聚合乙醇酸酯得到的聚合物。
“生物可降解的聚酯或聚(原酸酯)”指任何生物可降解的聚酯或聚(原酸酯)，其中聚酯優(yōu)選由選自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸、∈-己內(nèi)酯、∈-羥基己酸、γ-丁內(nèi)酯、γ-羥基丁酸、δ-戊內(nèi)酯、δ-羥基戊酸、羥基丁酸、蘋果酸和它們的共聚物的單體合成。
“ReGel”是MacroMed Incorporated公司的一類具有熱可逆性凝膠性質(zhì)的低分子量的、生物可降解嵌段共聚物的商品名，如美國專利號6,004,573，6,117,949，6,201,072和6,287,588所述，此處引入作為參考。它還包括待審美國專利申請序號09/906,041和09/559,799公開的組合物，此處將這些專利申請引入作為參考。生物可降解藥物載體包含ABA型或BAB型三嵌段共聚物或其混合物，其中A嵌段相對疏水且包含生物可降解聚酯或聚(原酸酯)，B嵌段相對親水且包含聚乙二醇(PEG)，所述共聚物具有的疏水含量在50.1到83％(重量)之間，親水含量在17％到49.9％(重量)之間，總嵌段共聚物分子量在2000到8000之間。該藥物載體在正常哺乳動物體溫以下時顯示水溶性，在等于哺乳動物生理體溫的溫度時，經(jīng)歷熱可逆性凝膠化，然后以凝膠存在。該生物可降解的、疏水A聚合物嵌段含有聚酯或聚(原酸酯)，其中聚酯由選自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸、ε-己內(nèi)酯、ε-羥基己酸、γ-丁內(nèi)酯、γ-羥基丁酸、δ-戊內(nèi)酯、δ-羥基戊酸、羥基丁酸、蘋果酸和它們的共聚物的單體合成且其平均分子量在約600到3000之間。疏水B嵌段片段優(yōu)選為聚乙二醇(PEG)且其平均分子量在約500到2200之間。
在低于凝膠化溫度的溫度下，嵌段共聚物是可溶的濃度可以認為是功能濃度。一般來說，可以使用低至3％，高至約50％(重量)的嵌段共聚物濃度，且該濃度仍然是有功能的。然而，優(yōu)選約5％到40％(重量)的濃度，最優(yōu)選約10％到30％的濃度。在較低的功能濃度范圍內(nèi)，相變可導(dǎo)致形成稀的凝膠或粘稠的液體，然而對于本發(fā)明的目的而言，這些系統(tǒng)仍然是有功能的。
本發(fā)明的制劑也可以含有重構(gòu)增強和可實施試劑，其含有液體聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇衍生物，或PEG和PEG衍生物的混合物，所述PEG或PEG衍生物的分子量在150到1100道爾頓之間。PEG衍生物包含由用選自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸它們的共聚物的成員衍生的PEG。該PEG衍生物也可以用R1-CO-O-(PEG)-CO-R2或R1-O-(PEG)-R2表示，其中R1和R2獨立選自H和C1到C10的烷基。
生物可降解的共聚物和藥物(如IL-2的混合物)可以制備成低于凝膠化溫度時的共聚物水性溶液或均一膠體以形成一種IL-2遞送液體，其中IL-2可以部分或全部溶解。然后通過遞送的局部途徑(如腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍)對病人施用該IL-2遞送液體，于是該IL-2遞送液體經(jīng)歷熱可逆性凝膠化，因為體溫將高于凝膠化溫度。這樣可以顯著減少或者在大多數(shù)情況下消除IL-2的系統(tǒng)性毒性并且使得免疫系統(tǒng)對癌細胞的應(yīng)答最大化。其他對本發(fā)明IL-2制劑的可能的施用方式包括在手術(shù)介入/腫瘤切除的部位局部施用以殺死術(shù)后剩余的癌細胞。治療惡性腫瘤的其他可能的局部遞送途徑包括對位于腹膜內(nèi)的腫瘤/轉(zhuǎn)移進行腹膜內(nèi)的施用，以及對位于顱內(nèi)的腫瘤進行顱內(nèi)的施用。
本發(fā)明還提供了將高毒性細胞因子和相關(guān)藥物(如淋巴因子，包括IL-2、IL-4、IL-12及其衍生物和模擬物)轉(zhuǎn)化成有效的抗癌藥物，而使不利的副作用最小化的通用方法。本發(fā)明制劑提供了局部貯庫制劑的持續(xù)遞送，該貯庫制劑在單個或幾個局部化腫瘤位點于腫瘤內(nèi)/腫瘤周圍形成，本發(fā)明制劑可使局部的或局部和系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
通過在腫瘤內(nèi)/腫瘤周圍形成局部持續(xù)的長效藥物遞送，在腫瘤位點得到了相對高的局部細胞因子穩(wěn)態(tài)濃度。該高局部濃度的IL-2刺激腫瘤特異CTTL的激活和產(chǎn)生，CTTL局部地和全身地供給攻擊腫瘤組織，而整個系統(tǒng)的IL-2水平卻足夠低以避免任何顯著的、不可接受的副作用。
本發(fā)明的制劑和方法可用于治療代表以癌癥出現(xiàn)的任何腫瘤，包括癌、肉瘤、黑素瘤、骨髓瘤等等，該種癌癥可以由任何惡性或前癌組織形成。本發(fā)明的制劑和方法提供了將高毒性藥物(尤其是細胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12和它們的衍生物和模擬物)轉(zhuǎn)變成有效治療制劑而沒有顯著的不需要的副作用的一種途徑。盡管與系統(tǒng)性治療所需的IL-2或其他淋巴因子的劑量相比，所施用的總的淋巴因子的劑量降低了一個數(shù)量級，但是本發(fā)明的制劑仍然提供了更好的或相當?shù)乃幮А?br> 在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-2被結(jié)合入生物可降解的嵌段共聚物藥物載體中，該藥物載體具有熱可逆性凝膠化性質(zhì)(ReGel)，該藥物載體為可溶形式或以懸液或其他膠體的形式存在且在低于其凝膠化溫度下保存。在將該制劑腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍地施用于體溫高于ReGel凝膠化溫度的病人或患病動物(溫血哺乳動物宿主)后，其形成局部貯庫制劑，能夠連續(xù)、持續(xù)地釋放IL-2。該IL-2/ReGel制劑還可以含有各種添加劑，如多元醇，包括糖、表面活性劑、氨基酸、其他蛋白和緩沖鹽。這些添加劑可作為特定細胞因子(包括IL-2、IL-4、IL-12和它們的衍生物和模擬物)的注射前(液態(tài))的或注射后(凝膠中位于局部IL-2貯庫制劑位點)的功能的和/或生理的穩(wěn)定劑。
本發(fā)明制劑可以施用一次，但優(yōu)選在每天到每月的基礎(chǔ)上反復(fù)施用以提供改善的療效，如腫瘤大小的衰退，這樣可長期的控制癌癥或使腫瘤完全消失或不再出現(xiàn)。由于生物可降解嵌段共聚物的自發(fā)地、體內(nèi)的、化學的降解而從注射位點快速清除制劑使得在同一注射位點反復(fù)施用成為可能，消除制劑的時間從幾天到4周，這取決于藥物載體的類型。
一般地，本發(fā)明的制劑可以腫瘤周圍地或腫瘤內(nèi)地施用于腫瘤位點，該腫瘤位點已經(jīng)通過成熟的診斷成像技術(shù)確診。一種需要精確定位腫瘤的治療惡性腫瘤的本發(fā)明IL-2制劑的特定途徑是對顱內(nèi)腫瘤的顱內(nèi)施用。另一種不需要精確定位腫瘤的治療惡性腫瘤的本發(fā)明IL-2制劑的特定途徑是對位于腹膜內(nèi)的原發(fā)腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移的腹膜內(nèi)IL-2施用。另一種不需要任何復(fù)雜成像技術(shù)的特定施用途徑是皮下注射本發(fā)明IL-2制劑到接近位于皮膚的腫瘤，例如原發(fā)和轉(zhuǎn)移黑素瘤。另一個特定施用途徑是局部施用IL-2制劑于手術(shù)介入/腫瘤切除的位點以殺死術(shù)后剩余癌細胞。
所施用的最適劑量將取決于癌的類型、宿主類型、腫瘤位置、途徑、施用時間表和順序、已經(jīng)存在的腫瘤(疾病狀態(tài))、細胞因子的類型(尤其是IL-2、IL-4、IL-12和它們的衍生物和模擬物)或者所用的其他淋巴因子。然而，對于本發(fā)明的IL-2制劑，通常的范圍在1000I.U.到1×108I.U.之間。
本發(fā)明的方法包括將藥理學有效量的藥物(特別是IL-2)施用于溫血哺乳動物宿主，包括小鼠、大鼠、兔、靈長類動物、豬或人宿主，優(yōu)選病人。該系統(tǒng)將不會對周圍產(chǎn)生不可接受的毒性或機械傷害，因為該物質(zhì)的生物相容性和凝膠的柔軟性，并且將在特定的時間段內(nèi)被完全生物降解成乳酸、乙醇酸或其他相應(yīng)的單體和聚乙二醇。通過適當?shù)脑O(shè)計方案和制備各種藥物載體可以控制IL-2的釋放速率、凝膠強度、凝膠化溫度和降解速度。例如，可以更改A嵌段和B嵌段的重量、含有A嵌段的單體的摩爾百分比、ABA或BAB三嵌段共聚物的分子量和多分散性。還可通過調(diào)整藥物遞送液體中的聚合物濃度來控制IL-2的釋放。
將含有IL-2的聚合物溶液，即藥物遞送液體的劑量形式施用于機體。然后由于嵌段共聚物的熱可逆性凝膠化性質(zhì)，當制劑的溫度升高到體溫時，該制劑自發(fā)地凝膠化而形成藥物貯庫制劑。在大多數(shù)情況下，該IL-2將制成約1000I.U.到1×108I.U./ml的藥物遞送液體。在某些情況下，可以通過向水性溶液或懸浮液中加入各種添加劑來提高白介素的功能性或物理穩(wěn)定性?？梢允褂锰砑觿?，如多元醇(包括糖)、氨基酸、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、張力調(diào)節(jié)劑、其他蛋白和一些鹽。這些添加劑可以結(jié)合進藥物遞送液體中。
似乎最有效的劑量是可以使腫瘤體積減小、完全消失或不再出現(xiàn)的，并且對宿主無毒或有可接受的毒性的劑量。這個最優(yōu)劑量水平將取決于許多因素，例如，宿主類型和癌類型、施用途徑、時間表和順序、存在的腫瘤、IL-2的類型和毒性的定義。
在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-2(20×106I.U.)與ReGel組合形成一種液體制劑，然后該液體制劑注射于腫瘤周圍。當IL-2/ReGel的溫度上升到體溫時，其在注射部位形成凝膠，該貯庫制劑提供了延長的釋放，其中IL-2緩慢而持續(xù)的釋放若干天。從凝膠釋放的IL-2具有活性并局部和系統(tǒng)地刺激CTTL。相反，傳統(tǒng)制劑(即沒有ReGel載體)中的IL-2的單次注射已被證明在控制腫瘤生長中是無效的。因此，本發(fā)明IL-2/ReGel制劑提供了局部或局部和系統(tǒng)地抗癌治療，而如果系統(tǒng)地給藥，局部注射IL-2劑量將是亞治療的。
下面的實施例用以闡明本發(fā)明組合物的制備方法和使用該組合物的方法。
實施例1本實施例闡明本發(fā)明的IL-2制劑的IL-2的體外釋放。
本實施例中的生物可降解嵌段共聚物載體是嵌段共聚物的23wt％的溶液，該嵌段共聚物的PLG/PEG-1000的重量比為2.4，L/G摩爾比為75/25，分子量為4,000道爾頓，凝膠化溫度為14℃。
將一定體積(1mL)的含有50,000I.U.(3μg)IL-2(Proleukin，可從Chiron購得)無菌IL-2制劑以一式兩份置于50mL組織培養(yǎng)瓶的底部。在存在25mL組織培養(yǎng)液(RPMI 1640，Bio Whittaker，Inc.)的條件下于37℃孵育搖瓶。在預(yù)先選取的時間點取出等份試樣(0.5mL)的釋放培養(yǎng)液并且在適當稀釋后分析IL-2含量。通過特異性酶聯(lián)免疫測定(OptEIAHuman IL-2 Set，Pharmingen)和(在3H-胸腺嘧啶摻入細胞后用CTTL-20指示細胞的)定量細胞增生測定(37℃孵育24小時)分析IL-2含量。對于定量細胞增生測定，用IL-2的標準系列稀釋液制作劑量反應(yīng)曲線。所得結(jié)果以累積的IL-2的釋放隨時間改變的函數(shù)表示(圖1A，IL-2用ELISA測量，圖1B，IL-2用細胞增生測定測量)。兩種方法都表明，IL-2的釋放是定量的，延續(xù)3到4天，并且釋放的IL-2具有完全的生物活性。
實施例2用與實施例1中描述的相同IL-2制劑，該實施例闡明了從本發(fā)明制劑釋放的IL-2誘導(dǎo)細胞毒性淋巴細胞的能力。
將含有遞增劑量的IL-2(Proleukin；12,500I.U.；25,000I.U.；50,000I.U.)的如實施例1所述的一定體積(0.5mL)的無菌IL-2制劑以一式兩份置于25mL組織培養(yǎng)瓶的底部。在存在25mL含有鼠脾細胞的組織培養(yǎng)液(RPMI 1640，Bio Whittaker，Inc.)的條件下于37℃孵育搖瓶3天。收獲活化的淋巴細胞并在51Cr釋放測定法中分析它們殺死RD-995纖維肉瘤腫瘤細胞的能力，結(jié)果以測定腫瘤細胞溶解的百分比(％)表示。如圖2所示，與在釋放開始時加至釋放介質(zhì)中的游離IL-2相比，由ReGel中釋放的IL-2具有完全生物活性。圖2中的E∶T的比代表效應(yīng)細胞(活化的淋巴細胞)與靶細胞(RD-995腫瘤細胞)的比，每個樣品(104)中靶細胞的數(shù)量保持恒定。總之，從本發(fā)明制劑中釋放的IL-2具有完全的生物活性，并且該制劑可用作持續(xù)的局部腫瘤周圍的IL-2體內(nèi)遞送的有效遞送系統(tǒng)。
實施例3該實施例通過在小鼠中單次腫瘤周圍注射本發(fā)明IL-2制劑闡明了腫瘤的退化。
對小鼠(C3H/HEN)皮下植入RD-995纖維肉瘤腫瘤細胞。當實體瘤的大小生長至4-5mm時，對小鼠(分成每組6只)注射0.2mL如實施例1的IL-2制劑，腫瘤周圍的對側(cè)每一側(cè)0.1mL。該IL-2制劑含有遞增劑量即100,000I.U.；250,000I.U.或500,000I.U.的IL-2。在對照組中，僅注射藥物載體。每隔1天連續(xù)3周測量腫瘤大小(圖3)。相對于對照組，每組中腫瘤的生長受到了阻滯。
實施例4該實施例闡明了從凝膠化溫度高于20℃的藥物載體中IL-2的體外釋放。
該實施例中的生物可降解聚合物載體是嵌段共聚物的13wt％的溶液，該嵌段共聚物的PEG(1000)/PEG(1450)的重量比為20/80，PLG/PEG的重量比為2.06，L/G摩爾比為85/15，分子量為4,800道爾頓，凝膠化溫度為26℃。
將一定體積(1mL)的含有50,000I.U.(3μg)IL-2(Proleukin)無菌IL-2制劑以一式兩份置于50mL組織培養(yǎng)瓶的底部。在存在25mL組織培養(yǎng)液(RPMI 1640，Bio Whittaker，Inc.)的條件下于37℃孵育搖瓶。在預(yù)先選取的時間點取出等份試樣(0.5mL)的釋放培養(yǎng)液并且在適當稀釋后分析IL-2含量。通過特異性酶聯(lián)免疫測定(OptEIA Human IL-2 Set，Pharmingen)分析IL-2含量。用IL-2的累積釋放對時間作圖(圖4)。在4天內(nèi)，負載于ReGel中的IL-2以生物活性形式從凝膠貯庫制劑中定量的體外釋放。
實施例5該實施例闡明了在小鼠中單次腫瘤周圍注射IL-2制劑的腫瘤退化。該IL-2制劑和實施例4中描述的相同。
對小鼠(C3H/HEN)皮下植入RD-995纖維肉瘤腫瘤細胞。當實體瘤的大小生長至4-5mm時，對小鼠(分成每組10只)注射0.2mL IL-2制劑(腫瘤周圍的對側(cè)每一側(cè)0.1mL)。該IL-2制劑含有遞增劑量的IL-2(500,000I.U.；2,000,000I.U.或4,000,000I.U.)。在對照組中，腫瘤周圍注射只有ReGel的制劑(無藥物)或傳統(tǒng)的IL-2制劑(500,000I.U.)。每隔1天、連續(xù)26天測量腫瘤大小(圖5)。相對于對照組，每個ReGel/IL-2組中腫瘤的生長受到阻滯約3周。施用后在第3天和第5天測量每組動物的血壓。所有血壓值都保持在生理范圍內(nèi)，并且沒有檢測到不利的血壓降低作用，這表明本發(fā)明的IL-2制劑沒有產(chǎn)生不利的副作用。
實施例6該實施例闡明了在小鼠中每周腫瘤周圍注射IL-2制劑引起的腫瘤退化。該IL-2制劑和實施例4描述的相同。
對小鼠(C3H/HEN)皮下植入RD-995纖維肉瘤腫瘤細胞。當實體瘤的大小生長至4-5mm時，對小鼠(分成每組10只)注射0.2mL IL-2制劑(腫瘤周圍的對側(cè)每一側(cè)0.1mL)。該IL-2制劑含有2,000,000I.U.的IL-2。在對照組中，腫瘤周圍注射只有藥物載體的制劑(無藥物)或傳統(tǒng)的IL-2制劑(500,000I.U.)。用傳統(tǒng)的IL-2制劑(180,000I.U.)系統(tǒng)施用(S.C)，一天兩次(B.I.D)，連續(xù)5天(小鼠中系統(tǒng)性IL-2的最大耐受劑量)，治療另一個對照組。除了傳統(tǒng)的系統(tǒng)性B.I.D組外，該施用在第7、14和21天重復(fù)一次。每隔1天測量腫瘤大小(圖6)。相對于對照組，在IL-2制劑組中腫瘤的生長受到阻滯約41/2周。在第一次施用后的第8天測量每組動物的血壓。所有血壓值都保持在生理范圍內(nèi)，并且沒有檢測到不利的血壓降低作用。
實施例7該實施例闡明在MethA腹膜內(nèi)腫瘤小鼠模型中IL-2制劑的每周腹膜內(nèi)注射的作用。該IL-2制劑和實施例4中的相同。
用106MethA纖維肉瘤腫瘤細胞腹膜內(nèi)注射小鼠(Balb C)。3天后(第0天，圖7)，用0.2mL含有遞增劑量的IL-2(100,000I.U.；500,000I.U.或2,000,000I.U.)的IL-2制劑腹膜內(nèi)注射小鼠(分成每組10只)。對照組由有腫瘤沒治療的小鼠、無藥制劑注射的小鼠、用傳統(tǒng)系統(tǒng)性IL-2(180,00I.U.S.C.B.I.D.x5天)治療的小鼠和用500,000I.U.傳統(tǒng)IL-2腹膜內(nèi)注射的小鼠組成。除了傳統(tǒng)的系統(tǒng)性B.I.D.組之外，在第7、14、21、28和35天每周重復(fù)注射。跟蹤小鼠的存活(圖7)。結(jié)果表明，與用傳統(tǒng)IL-2制劑的陽性對照相比，施用本發(fā)明的IL-2制劑得到較好的存活數(shù)據(jù)。
實施例8該實施例闡明了對有B16黑素瘤實體瘤的小鼠每周腫瘤周圍注射本發(fā)明IL-2制劑的存活率。該IL-2制劑和實施例4中描述的相同。
對小鼠(C57/B16)皮下植入B16黑素瘤腫瘤細胞。當實體瘤的大小生長至4-5mm時，對小鼠(分成每組8只)注射0.2mL本發(fā)明IL-2制劑(腫瘤周圍的對側(cè)每一側(cè)0.1mL)。該IL-2制劑含有2,000,000I.U.的IL-2。在對照組中，腫瘤周圍注射只有藥物載體的制劑(無藥物)或傳統(tǒng)的IL-2制劑(2,000,000I.U.)。在第7、14、21、28和35天重復(fù)施用。跟蹤小鼠的腫瘤生長和存活率。在第1、2、3、4和5天(第一次施用后)測量血壓并在第14、15、16、17和18天(第三次施用后)在每個動物組中重復(fù)測量。所有血壓值都保持在生理范圍內(nèi)，并且沒有檢測到不利的血壓降低作用。然而和對照組相比，用本發(fā)明IL-2制劑的組中的腫瘤生長不僅顯著地延緩，而且與用傳統(tǒng)IL-2制劑的陽性對照相比，施用本發(fā)明的IL-2制劑得到較好的存活數(shù)據(jù)(圖8)。
實施例9該實施例闡明了在小鼠中每周腫瘤周圍注射IL-2制劑引起的系統(tǒng)性免疫性活化作用，藥物載體和實施例1中描述的相同。
對小鼠(C3H/HEN)皮下植入兩個腫瘤，用RD-995纖維肉瘤腫瘤細胞在每脅植入一個腫瘤。當實體瘤的大小生長至4-5mm時，對小鼠(分成每組10只)注射0.2mL實施例1中所述的制劑，僅在右側(cè)腫瘤(5只小鼠)或左側(cè)腫瘤(5只小鼠)注射含有2,000,000I.U.的IL-2，腫瘤周圍對側(cè)每一側(cè)0.1ml。對照組由含有兩個腫瘤而沒有治療的小鼠、只注射藥物載體的小鼠(5只小鼠在左側(cè)腫瘤注射，5只小鼠在右側(cè)腫瘤注射)和用傳統(tǒng)IL-2制劑(2,000,000I.U.)腫瘤周圍注射的小鼠(5只小鼠在左側(cè)腫瘤注射，5只小鼠在右側(cè)腫瘤注射)組成。在每組中，在相同的預(yù)先選擇的腫瘤位點每周重復(fù)施用，連續(xù)8周。在IL-2/制劑組中，治療的和未治療的腫瘤的生長都受到阻滯(或腫瘤完全退化)，而在對照組中，兩個腫瘤都繼續(xù)生長。因此，IL-2制劑組的存活數(shù)據(jù)比對照組(包括腫瘤周圍用傳統(tǒng)IL-2治療組)得到的數(shù)據(jù)要優(yōu)，這表明用本發(fā)明IL-2制劑才得到了系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。
實施例10該實施例闡明了在小鼠中每周腫瘤周圍注射IL-2制劑對系統(tǒng)性免疫性活化作用。藥物載體和實施例4中描述的相同。
對小鼠(C3H/HEN)皮下植入兩個腫瘤，用RD-995纖維肉瘤腫瘤細胞在每脅植入一個腫瘤。當實體瘤的大小在4-5mm時，對小鼠(分成每組10只)注射0.2mL實施例4所述的IL-2制劑，僅在右側(cè)腫瘤(5只小鼠)或左側(cè)腫瘤(5只小鼠)注射含有2,000,000I.U.的IL-2，腫瘤周圍對側(cè)每一側(cè)0.1ml。對照組由含有兩個腫瘤而沒有治療的小鼠、只注射藥物載體的小鼠(5只小鼠在左側(cè)腫瘤注射，5只小鼠在右側(cè)腫瘤注射)和用傳統(tǒng)IL-2制劑(2,000,000I.U.)腫瘤周圍注射的小鼠(5只小鼠在左側(cè)腫瘤注射，5只小鼠在右側(cè)腫瘤注射)組成。在每組中，在相同的預(yù)先選擇的腫瘤位點每周重復(fù)施用，連續(xù)8周。在IL-2制劑組中，治療的和未治療的腫瘤的生長都受到阻滯(或腫瘤完全退化)，而在對照組中，兩個腫瘤都繼續(xù)生長。因此，IL-2制劑組的存活數(shù)據(jù)比對照組(包括腫瘤周圍用傳統(tǒng)IL-2治療組)得到的數(shù)據(jù)要優(yōu)，這表明用本發(fā)明IL-2制劑才得到了系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。
上面的實施例只是用于闡明的目的，而不是也不應(yīng)解釋為以任何方式對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以對本發(fā)明的化合物和方法做各種修改。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以作各種修改，本發(fā)明范圍僅僅由下面的權(quán)利要求書和等同物所限制。
權(quán)利要求
1.一種局部施用一種淋巴因子予溫血動物以提供局部的或局部和系統(tǒng)的療效的制劑，該制劑含有a)有效量的一種淋巴因子；b)生物可降解的ABA-或BAB-型三嵌段共聚物，它包含i)含有生物可降解的聚酯或聚(原酸酯)的51到83％(重量)的生物可降解的疏水A嵌段，和ii)含有聚乙二醇(PEG)的17％到49％(重量)的親水B嵌段，所述三嵌段共聚物平均分子量在約2000到4990之間，并且具有熱可逆性凝膠化性質(zhì)；和c)一種重構(gòu)增強和可實施劑，其含有聚乙二醇(PEG)、PEG衍生物或PEG與PEG衍生物的混合物，所述PEG或PEG衍生物的平均分子量為150到1100道爾頓；其中所述制劑在施用后形成一種含有淋巴因子的貯庫制劑并連續(xù)地、持久地釋放淋巴因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中所述淋巴因子選自白介素-2(IL-2)、白介素-4、白介素-12、它們的衍生物和模擬物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中在施用前該制劑是可注射的液體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，該制劑還含有生物相容性添加劑，所述添加劑選自包括糖的多元醇、表面活性劑、氨基酸、蛋白質(zhì)、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、張力增強劑、緩沖鹽和它們的等價試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中PEG衍生物由被選自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸和它們的共聚物的成員衍生的PEG組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中PEG衍生物由R1-CO-O-(PEG)-CO-R2或R1-O-(PEG)-R2代表，其中R1和R2獨立選自H和C1到C10的烷基。
7.一種局部地或局部地和系統(tǒng)地控制溫血動物中增生性疾病的方法，該方法包括a)制備權(quán)利要求1到6的淋巴因子制劑，b)將所述制劑施用于所述溫血動物的增生性疾病發(fā)生的部位附近或之中，c)使所述制劑形成含有淋巴因子的貯庫制劑，該貯庫制劑提供了淋巴因子的連續(xù)、持久的釋放而得到局部的和系統(tǒng)性的療效同時沒有產(chǎn)生不可接受的副作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述增生性疾病是癌或疣。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中該施用通過選自腫瘤內(nèi)、腫瘤周圍、疾病部位周圍、疾病部位內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)和腹腔內(nèi)的腸胃外的方式進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中該制劑每天或每月施用。
全文摘要
本發(fā)明公開含有有效量的IL－2或其他淋巴因子和具有熱可逆性凝膠化性質(zhì)的生物可降解聚合載體的治療制劑和使用其局部或局部和系統(tǒng)地控制增生性疾病的方法。該制劑可以腫瘤內(nèi)/腫瘤周圍的施用并且形成一種含有IL－2的貯庫制劑。該含有IL－2的貯庫制劑提供了IL－2的連續(xù)的、持久的釋放，足夠刺激局部和系統(tǒng)地起作用的細胞毒性T淋巴細胞而不會引起不可接受的副作用。
文檔編號A61K9/00GK1610694SQ02811185
公開日2005年4月27日 申請日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月14日
發(fā)明者G·M·曾特納, M·博迪斯, M·尤雷克, W·薩莫勞斯基 申請人:麥克羅米德公司