專利名稱：緩釋注射劑用組合物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將生理活性蛋白質(zhì)封入生物降解性高分子物質(zhì)中的緩釋注射劑用組合物及其制造方法。更詳細(xì)是涉及由生理活性蛋白質(zhì)和糖類組成的、粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的噴霧干燥微粉末均勻地分散于生物降解性高分子物質(zhì)的基質(zhì)中而得到的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
背景技術(shù)：
對人給予生理活性蛋白質(zhì)已在廣泛實施，但蛋白質(zhì)口服吸收性低，在機(jī)體內(nèi)消失也快，因此，作為注射劑現(xiàn)狀是需多次給藥。在該狀況下，從避免多次給藥及提高治療效果的觀點(diǎn)來看，強(qiáng)烈希望有可將生理活性蛋白質(zhì)封入生物降解性高分子物質(zhì)中、形成微球體的緩釋技術(shù)。此外，蛋白質(zhì)會由于熱、溶劑等而變性，因此，在制造方面處理有困難，希望有更好的方法。但是，可將生理活性蛋白質(zhì)穩(wěn)定地、且封入率較高地封入微球體中、加之在溶出試驗開始后不發(fā)生初期的急劇生理活性蛋白質(zhì)的釋放(以下稱初期突釋)、具有生產(chǎn)性、可實施性的緩釋微球體的技術(shù)迄今為止還沒有。
為了不使生理活性蛋白質(zhì)的生理活性降低，以避免二氯甲烷等有機(jī)溶劑引起的變性為目的，實施了將水溶性的蛋白質(zhì)進(jìn)行粉末化處理、以保持其活性的嘗試。例如，在特開平11-322631號公報中，公開了在生理活性多肽水溶液中添加與水混溶的有機(jī)溶劑及/或銨鹽等揮發(fā)性鹽類，經(jīng)冷凍干燥將多肽制成粉末，實現(xiàn)了穩(wěn)定地封入多肽的制劑中，使封入率、緩釋性得到改善的生理活性多肽的緩釋性制劑。又特開平11-302156號公報中，公開了冷凍干燥多肽及聚乙二醇的混合水溶液，通過使用多肽不能溶解，但聚乙二醇和生物降解性高分子物質(zhì)溶解的溶劑，調(diào)制回收率高、不發(fā)生變性的高純度的多肽微粒子，將該微粒子封入微球體中。該技術(shù)是涉及在調(diào)制微球體的前階段用于多肽微?；睦鋬龈稍锛夹g(shù)，不涉及噴霧干燥技術(shù)。
作為在調(diào)制微球體的前階段使用噴霧干燥的技術(shù)，特開平4-36233號公報中有所公開。該技術(shù)是通過將多肽和明膠等水溶性高分子的混合水溶液進(jìn)行噴霧干燥，制成微球，再用生物降解性高分子溶液包衣，而使藥物的包封率得到提高，初期突釋得到抑制的具有長時間緩釋性的方法。但該方法依賴所使用的水溶性高分子、有使噴霧干燥時的溫度變?yōu)楦邷氐那闆r，可能導(dǎo)致多肽的失活。
迄今為止，在調(diào)制微球體的前階段、其后的調(diào)制階段，在生理活性的保持和與此同時的初期釋放的控制、生理活性蛋白質(zhì)的高封入率、以及長時間持續(xù)的釋放性、生產(chǎn)性、可實施性的所有方面，具有充分效果的技術(shù)還未為人所知。為了滿足上述所有的方面，需要做進(jìn)一步的改善。
因此，本發(fā)明的目的是提供含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑，它是以保持生理活性蛋白質(zhì)的生理活性的狀態(tài)經(jīng)噴霧干燥制成微粉末、以高封入率使其內(nèi)包于生物降解性高分子物質(zhì)、且這時仍可保持生理活性蛋白質(zhì)的生理活性、加之實現(xiàn)了抑制初期釋放和長時間持續(xù)釋放的生產(chǎn)性高的、具有可實施性的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑。

發(fā)明內(nèi)容
在該狀況下，本發(fā)明者對通過生理活性蛋白質(zhì)的噴霧干燥進(jìn)行微粉末化處理進(jìn)行了種種研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果以糖類、特別是甘露糖醇或2-羥丙基-β-環(huán)糊精作為載體使用，則可不使生理活性蛋白質(zhì)變性地實施噴霧干燥，可得到保持良好粒徑的微粉末，加之在采用使得到的生理活性蛋白質(zhì)的微粉末于油類中內(nèi)包于由生物降解性高分子物質(zhì)組成的緩釋基質(zhì)的方法的情況下，其生理活性完全不喪失，可實現(xiàn)高封入率、抑制初期釋放及長時間持續(xù)的藥物釋放，從而完成了本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，通過使用糖類，干燥溫度可不需設(shè)定為高溫即可實施噴霧干燥，從而可避免由于熱而導(dǎo)致的生理活性蛋白質(zhì)的變性和失活，調(diào)制粒徑得到控制的蛋白質(zhì)微粉末變得極為容易。此外，使用保持生理活性、粒徑得到充分控制的蛋白質(zhì)微粉末，可保持內(nèi)包于微球體內(nèi)的生理活性蛋白質(zhì)的生理活性、還可實現(xiàn)在微球體中的高封入率、抑制初期釋放。
即本發(fā)明是關(guān)于1.粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的由生理活性蛋白質(zhì)和糖類組成的噴霧干燥微粉末均勻地分散于生物降解性高分子物質(zhì)的基質(zhì)中的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
2.粒徑在6μm以下的噴霧干燥微粉末所占的比例為50％以上的上述1所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
3.糖類為甘露糖醇及/或環(huán)糊精類的上述2所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
4.環(huán)糊精類為2-羥丙基-β-環(huán)糊精的上述3所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
5.生物降解性高分子物質(zhì)為乳酸-乙醇酸的共聚物的上述4所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
6.生理活性蛋白質(zhì)為干擾素類的上述5所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
7.干擾素類為干擾素-α-Con1的上述6所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
8.組合物為微球體的上述7所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
9.微球體的平均粒徑約為20-250μm的上述8所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
10.生理活性蛋白質(zhì)的含有量相對于糖類約為0.01-80％(w/w)的上述9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
11.噴霧干燥微粉末的濃度相對于生物降解性高分子物質(zhì)約為0.01-20％(w/w)的上述9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
12.使以生理活性蛋白質(zhì)和糖類為實質(zhì)性的組成成分、且粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的噴霧干燥微粉末分散于生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液中之后，在油類中除去該有機(jī)溶劑而制得的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
13.使粒徑在6μm以下的噴霧干燥微粉末所占的比例為50％以上的上述12所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
14.糖類為甘露糖醇及/或環(huán)糊精類的上述13所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
15.環(huán)糊精類為2-羥丙基-β-環(huán)糊精的上述14所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
16.生物降解性高分子物質(zhì)為乳酸-乙醇酸的共聚物的上述15所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
17.生理活性蛋白質(zhì)為干擾素類的上述16所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
18.干擾素類為干擾素-α-Con1的上述17所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
19.油類為硅油、大豆油、芝麻油、棉子油、礦物油的上述18所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
20.油類為硅油的上述19所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
21.組合物為微球體的上述20所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
22.微球體的平均粒徑約為20-250μm的上述21所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
23.生理活性蛋白質(zhì)的含有量相對于糖類約為0.01-80％(w/w)的上述9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
24.噴霧干燥微粉末的濃度相對于生物降解性高分子物質(zhì)為10％(w/w)以下的上述22所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
25.使以生理活性蛋白質(zhì)和糖類為實質(zhì)性的組成成分、且粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的噴霧干燥微粉末分散于生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液中之后，在油類中除去該有機(jī)溶劑的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
26.使粒徑在6μm以下的噴霧干燥微粉末所占的比例為50％以上的上述25所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
27.糖類為甘露糖醇及/或環(huán)糊精類的上述26所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
28.環(huán)糊精類為2-羥丙基-β-環(huán)糊精的上述27所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
29.生物降解性高分子物質(zhì)為乳酸-乙醇酸的共聚物的上述28所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
30.生理活性蛋白質(zhì)為干擾素類的上述29所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
31.干擾素類為干擾素-α-Con1的上述30所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
32.油類為硅油、大豆油、芝麻油、棉子油、礦物油的上述31所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
33.油類為硅油的上述32所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
34.組合物為微球體的上述33所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
35.微球體的平均粒徑約為20-250μm的上述34所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
36.噴霧干燥微粉末的濃度相對于生物降解性高分子物質(zhì)為10％(w/w)以下的上述35所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
37.生理活性蛋白質(zhì)的含有量相對于糖類約為0.01-80％(w/w)的上述9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法。
本發(fā)明中的『基質(zhì)』表示生物降解性高分子的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)?！壕鶆虻胤稚ⅰ槐硎驹谏锝到庑愿叻肿拥木W(wǎng)眼結(jié)構(gòu)中，由生理活性蛋白質(zhì)和糖類組成的噴霧干燥粉末充分分散的狀態(tài)，本發(fā)明組合物的釋放以下述釋放試驗法進(jìn)行測定，不發(fā)生初期突釋時，可間接得知生理活性蛋白質(zhì)為『均勻分散』的狀態(tài)。
在本發(fā)明中測定『噴霧干燥微粉末粒徑』的意義在于，控制粒徑從而可使微粉末容易內(nèi)包于生物降解性高分子物質(zhì)中、可抑制初期釋放和實現(xiàn)高封入率。具體以粒徑在10μm以下的粒子占90％以上為宜，此外粒徑在6μm以下的粒子占50％以上。使用具有上述粒徑的微粉末，可使噴霧干燥微粉末、即生理活性蛋白質(zhì)內(nèi)包在以后的生物降解性高分子物質(zhì)內(nèi)變得容易，可實現(xiàn)初期釋放的抑制和高封入率。
本發(fā)明所述的『微球體』是指從粒徑為幾十μm至幾百μm的球形粒子，具體是指約10μm～300μm的球形粒子，最好約為20μm～250μm。
本發(fā)明所述的『以生理活性蛋白質(zhì)和糖類作為實質(zhì)性的組成成分』是指以生理活性蛋白質(zhì)和糖類為主要成分，但在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，也可含有其它賦形劑等成分。本發(fā)明所述的生理活性蛋白質(zhì)的『生理活性的保持』具體是指例如用下述生理活性試驗法測定生理活性蛋白質(zhì)的效價時，相對于標(biāo)準(zhǔn)品試樣的效價約為70-125％，更好約為80-115％。
對于將本發(fā)明的生理活性蛋白質(zhì)封入后的緩釋注射劑用組合物，其『初期釋放的抑制』及『持續(xù)釋放』是指采用下述釋放試驗法時，『初期釋放的抑制』表示在試驗開始后的3小時內(nèi)約為10％以下，『持續(xù)釋放』也表示『緩釋』，具體表示在使用開始后1日至1個月之間的時間范圍內(nèi)，藥物持續(xù)釋放。
此外，本發(fā)明所述的生理活性蛋白質(zhì)的『高封入率』是指例如在以下述封入率的測定法進(jìn)行測定時，封入率約為70％以上、更好約為75％以上、特好約為80％以上。
噴霧干燥時的干燥溫度的『不使用高溫』是指，例如作為機(jī)器選擇噴霧干燥器時的送風(fēng)出口溫度的低溫度范圍，具體約為0～80℃、較好約為10～60℃、更好約為20～60℃。
本發(fā)明所使用的生理活性蛋白質(zhì)只要是作為醫(yī)藥活性成分使用的蛋白質(zhì)，就沒有特別限定。作為醫(yī)藥活性成分可列舉細(xì)胞因子、生長因子、造血因子、肽激素、酶等。
具體作為細(xì)胞因子可列舉干擾素類(α型、β型、γ型等)、白細(xì)胞介素類(IL-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23等)、腫瘤壞死因子(TNF)等，作為生長因子，可列舉骨形成因子(BMP-1、2、3、4等)、神經(jīng)生長因子(NGF-1、2等)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)、上皮細(xì)胞生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1、2、3等)、成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF、bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、軟骨衍生因子(CDF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α、-β等)等。
作為造血因子，可列舉集落刺激因子(G-、M-、GM-CSF等)、血小板生成素(TPO)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生長刺激因子等，作為肽激素，可列舉生長激素(GH)、生長激素釋放因子(GRF)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、促甲狀腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)、黃體生成激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促黑素細(xì)胞激素(MSH)、胰島素、高血糖素、催乳素、降鈣素、鈉利尿肽等，作為酶可列舉組織纖溶酶原激活物(tPA)、尿激酶(UK)、超氧化物歧化酶(SOD)、天冬酰胺酶、激肽釋放酶、鏈激酶、蛋白質(zhì)C、金屬蛋白酶類、第VIII及IX因子、過氧化物酶等。
作為本發(fā)明較好的生理活性蛋白質(zhì)為干擾素類、骨形成因子、生長激素，更好為干擾素類、生長激素，特好為干擾素類。干擾素類包含天然型、基因重組型兩種。其中基因重組型的干擾素-α-Con1特別好。上述生理活性蛋白質(zhì)可1種或2種以上組合使用。此外，也可與非蛋白質(zhì)藥物例如抗病毒劑組合使用。
作為本發(fā)明的生理活性蛋白質(zhì)，分子量約為1,000～200,000，最好約為5,000～70,000。上述生理活性蛋白質(zhì)可來自天然或為經(jīng)基因重組技術(shù)等得到的變體，還可為其修飾體(例如使用聚乙二醇的化學(xué)修飾體)。此外，它們可以單體使用，也可作為同或雜的多聚物使用。
作為本發(fā)明的糖類，可列舉環(huán)狀及(直鏈及分支)的單糖、雙糖、低聚糖、多糖、或其衍生物(也包括糖醇等)等，其中，較好為糖醇或環(huán)狀低聚糖、更好為甘露糖醇或環(huán)糊精類(α型、β型、γ型、2-羥丙基-β-環(huán)糊精等)、特好為甘露糖醇及2-羥丙基-β-環(huán)糊精。上述糖類也可1種或2種以上組合使用。
本發(fā)明的生物降解性高分子物質(zhì)是指具有生物相容性的特性、且不具有生理活性的在生物降解、消失的高分子，只要是制藥學(xué)所上允許的物質(zhì)，就沒有特別限定。例如可列舉α-羥基羧酸類(乳酸、乙醇酸等)、羥基二羧酸類(蘋果酸等)、羥基三羧酸(檸檬酸等)等均聚物或共聚物等，較好為聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物，特好為乳酸乙醇酸共聚物。上述生物降解性高分子物質(zhì)可1種或2種以上組合使用。
噴霧干燥微粉末實質(zhì)上由生理活性蛋白質(zhì)和糖類組成，相對于糖類，生理活性蛋白質(zhì)的含有量較好約為0.01-80％(w/w)，更好約為2-50％(w/w)，特好約為5-20％(w/w)。如果活性蛋白質(zhì)的含有量低于該范圍，則喪失實質(zhì)性的生理活性，如果高于該范圍，則得不到糖類對穩(wěn)定性的改善。
噴霧干燥微粉末的含有量，根據(jù)生理活性蛋白質(zhì)的藥理效果及釋放時間的不同而有所差異，相對于生物降解性高分子物質(zhì)約在0.01-20％(w/w)的范圍，較好約為0.1-10％(w/w)。如果低于該范圍，則釋放時間顯著減緩，如果高于該范圍，則有釋放時間提早的可能性。
本發(fā)明的噴霧干燥微粉末可通過采用噴嘴將生理活性蛋白質(zhì)和糖類的混合水溶液向噴霧干燥器的干燥室內(nèi)噴霧、使水揮發(fā)而制得。作為噴霧干燥器的例子，可列舉噴霧式干燥器。作為噴霧干燥時所使用的噴嘴，有兩液噴嘴、壓力噴嘴、轉(zhuǎn)盤型等，根據(jù)所選擇的生理活性蛋白質(zhì)、糖類，也可使用任何一種。
在調(diào)制混合水溶液時，可使水溶性低分子物質(zhì)溶解于生理活性蛋白質(zhì)的水溶液中，也可使生理活性蛋白質(zhì)的水溶液和水溶性低分子物質(zhì)的水溶液混合。此外，在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，根據(jù)需要也可添加鹽酸、氫氧化鈉等pH調(diào)節(jié)劑、氯化鈉等滲透壓調(diào)節(jié)劑。這時，混合水溶液中的生理活性蛋白質(zhì)的濃度，只要在生理活性蛋白質(zhì)溶解的范圍中，就沒有特別限定，約為0.1-20mg/ml，較好約為1-10mg/ml，更好約為1-8mg/ml?；旌纤芤褐械奶穷惖臐舛龋灰谔穷惾芙?、且生理活性蛋白質(zhì)不沉淀的范圍內(nèi)，就沒有特別限定，約為1-150mg/ml，較好約為10-100mg/ml，更好約為20-70mg/ml。
噴霧干燥時的噴霧干燥室的送風(fēng)室的送風(fēng)入口溫度約在20-150℃的范圍，較好約為40-120℃，更好約為50-100℃。送風(fēng)出口溫度約在0-80℃的范圍，較好約為10-80℃，更好約為20-60℃。
作為使生理活性蛋白質(zhì)和糖類的噴霧干燥微粉末分散于生物降解性高分子物質(zhì)的方法，可選擇在噴霧干燥微粉末和生物降解性高分子物質(zhì)的混合物中添加有機(jī)溶劑、使生物降解性高分子物質(zhì)溶解、使噴霧干燥微粉末分散的方法；在生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液中使噴霧干燥微粉末分散的方法；在噴霧干燥微粉末的有機(jī)溶劑分散液中使生物降解性高分子物質(zhì)溶解的方法；使噴霧干燥微粉末的有機(jī)溶劑分散液與生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液混合的方法中的任何一種方法。使噴霧干燥微粉末分散于生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液中時，為了提高均勻性，也可進(jìn)行旋渦攪拌、均化、超聲波等的處理。有機(jī)溶劑中的生物降解性高分子物質(zhì)的濃度較好約為10-500mg/ml，更好約為50-250mg/ml。
作為本發(fā)明所使用的有機(jī)溶劑，只要是不溶解噴霧干燥微粉末、而溶解生物降解性高分子物質(zhì)的揮發(fā)性物質(zhì)，就沒有特別限定。作為有機(jī)溶劑具體可列舉乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲苯等，其中，以乙腈、二氯甲烷為宜。上述有機(jī)溶劑也可2種以上混合使用。
此外，根據(jù)需要，在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，也可添加賦形劑等。作為賦形劑可列舉制藥學(xué)上允許的鹽類、表面活性劑、糖類、氨基酸類、有機(jī)酸、其它水溶性物質(zhì)等，其摻和量相對于生物降解性高分子物質(zhì)的重量約為0.1-20％(w/w)，最好約為1-10％(w/w)。上述賦形劑可添加1種或2種以上。
上述賦形劑中，不溶解于有機(jī)溶劑的以粉末的形式添加，這時賦形劑的平均粒徑較好為20μm以下，更好為10μm以下。
作為具體的鹽類，可列舉L-谷氨酸鉀、L-谷氨酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、辛酸鈉、腎上腺素色素(carbazochrome)磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鈉、葡糖酸鎂、甲磺基苯甲酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鋁、氯化鉀、氯化鈣、氯化鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫納等。作為糖類，可列舉D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、肌醇、木糖醇、葡聚糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖等，作為氨基酸類，可列舉蛋氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、牛磺酸、組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸等，作為其它水溶性物質(zhì)，可列舉抗壞血酸、人血清白蛋白、硫酸軟骨素鈉鹽、明膠、明膠水解物、肝素鈉等。
作為溶解于有機(jī)溶劑的賦形劑，也可添加表面活性劑、有機(jī)酸類等。具體的表面活性劑，可列舉倍半油酸山梨糖醇酐、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油50、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、聚乙二醇(マクロゴ一ル)400、聚乙二醇4000、聚乙二醇600等，作為有機(jī)酸類，可列舉油酸、巰基乙酸、乳酸等。
作為固化有機(jī)溶劑中的生物降解性高分子物質(zhì)的方法，例如可列舉在油類中加入生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液，經(jīng)乳化調(diào)制O/O型乳劑，將得到的乳劑在液體中干燥的方法。作為油類，只要是不使噴霧干燥微粉末及生物降解性高分子物質(zhì)溶解、而與使生物降解性高分子物質(zhì)溶解的有機(jī)溶劑不相混合的油類，就沒有特別限定，例如以硅油、大豆油、芝麻油、棉子油、礦物油等為宜，其中更好為硅油、礦物油，特好為硅油。它們也可2種以上混合使用。
油類的體積以占生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液體積的1-1000倍左右為宜，特好為10-500倍左右。
通過在油類中除去有機(jī)溶劑，可容易內(nèi)包于生物降解性高分子物質(zhì)中，具有可實現(xiàn)高封入率的優(yōu)點(diǎn)。
此外，在油類中也可添加防凝聚劑。防凝聚劑只要可抑制在油類中的微球體的凝聚，就沒有特別限定，但以倍半油酸山梨糖醇酐為宜。
乳化操作時，可使用螺旋槳式攪拌機(jī)、渦輪型乳化機(jī)、超聲波分散裝置、高壓乳化機(jī)等合適的機(jī)器。
液體中的干燥可采用減壓法等常規(guī)方法實施，例如，一邊用螺旋槳式攪拌機(jī)以約10-1000rpm攪拌乳劑，一邊以約0.1-50mm/Hg蒸去有機(jī)溶劑，溫度約為0-25℃，更好約為10-20℃。用0.1-20μm篩眼的篩子除去油類。在除去油類的過程中，通過添加與油類混合的溶劑，可有效地除去油類。例如添加異丙醇、乙醇等。此外，根據(jù)需要也可通過減壓至1mmHg以下蒸去有機(jī)溶劑。溫度較好為0-約30℃，更好約為15-25℃。為了完全蒸去有機(jī)溶劑，較好是進(jìn)行約24-60小時的減壓處理，更好是約36-48小時。油類的除去也可通過添加油類溶解、而生物降解性高分子物質(zhì)不溶解的溶劑來實施。具體可添加n-己烷、異丙醇、乙醇、甲醇等。
根據(jù)需要，可在1mmHg以下減壓約1-2小時，除去油類溶解、而生物降解性高分子物質(zhì)不溶解的溶劑。將以如上所述的方法得到的微球體用篩眼大小較好為100-500μm、更好為150-300μm的篩子過篩，可得到粒徑整齊的微球體。還可根據(jù)需要對上述得到的微球體進(jìn)行加溫，進(jìn)一步除去微球體中殘留的有機(jī)溶劑。加溫也可在減壓下進(jìn)行。通過實施上述一系列的操作，可得到平均粒徑約為20μm-250μm的適用于注射劑的微球體。
以下對本發(fā)明的緩釋注射用組合物的制造方法進(jìn)行說明。
本發(fā)明組合物的制造是將生理活性蛋白質(zhì)水溶液和糖類水溶液混合，用噴霧式干燥器得到噴霧干燥微粉末。另外，使生物降解性高分子物質(zhì)(例如乳酸乙醇酸共聚物(PLGA))溶解于合適的有機(jī)溶劑(例如乙腈)后添加生理活性蛋白質(zhì)/糖類噴霧干燥微粉末，用ポリトロン使其分散。將分散有噴霧干燥微粉末的生物降解性高分子物質(zhì)溶液加至油中(例如硅油)，以400轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌、經(jīng)30分鐘10mmHg以下蒸去溶劑。添加異丙醇等，用篩眼大小為20μm的篩子回收微球體后，于0.1mmHg以下進(jìn)行一定時間的處理。用己烷洗凈除去油后，于0.1mmHg以下處理1小時，從而除去己烷。回收篩眼大小為250μm的篩子下面的微球體，得到本發(fā)明的組合物。
實施發(fā)明的最佳方式以下列舉實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明的范圍不限于此。
〔粒徑測定法〕在噴霧干燥微粉末中添加乙腈，用ポリトロン(KINEMATICA GmbH)以10,000轉(zhuǎn)，經(jīng)1分鐘處理使其分散。用激光衍射/散射式粒度分布測定裝置(HORIBALA-910)測定一部分或全部分散液。
〔生理活性試驗法〕用于噴霧干燥粉末中的活性測定的試料調(diào)制法使噴霧干燥微粉末溶解于含有7％(w/v)牛血清白蛋白的1/30M磷酸緩沖液pH7.0中之后，用0.22μm的濾器(MILLEX-GVMILLIPORE)過濾。用熒光光譜儀(F-4500日立)測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長495nm、熒光波長517nm)，從而算出FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1的濃度，制成試料溶液。
用于微球體中的活性測定的試料調(diào)制法通過向含有噴霧干燥微粉末的微球體添加丙酮使PLGA溶解，離心處理(2,000rpm、10分鐘)后，除去上清液。經(jīng)4次重復(fù)該操作回收噴霧干燥微粉末?；厥盏膰婌F干燥微粉末采用上述方法制成試料溶液。
效價測定法干擾素-α-Con1的效價測定通過抗病毒活性實施(參考文獻(xiàn)蛋白質(zhì)·核酸·酶、別冊25、355-363、1981年)。細(xì)胞使用人羊膜衍生株細(xì)胞(FL細(xì)胞、ATCC編號CCL-62，由國立預(yù)防衛(wèi)生研究所提供的株或同等物)及辛德畢斯(Sindbis)病毒(由國立預(yù)防衛(wèi)生研究所提供的株)。
〔釋放試驗法〕在含有熒光素異硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate)(FITC)標(biāo)記干擾素-α-Con1的PLGA微球體50mg中，添加1/30M磷酸緩沖液(pH7.0)10ml，以60沖程/分鐘、在37℃的水浴中保溫。于規(guī)定時間之后，在上清的一部分中添加等量的含有5％(w/v)十二烷基硫酸鈉的0.1N氫氧化鈉后，用熒光光譜儀(F-4500日立)測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長495nm、熒光波長517nm)，由此算出干擾素-α-Con1的釋放量。
〔封入率的測定法〕在含有FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1的PLGA微球體20mg中添加二甲亞砜10ml使之溶解。添加含有5％(w/v)十二烷基硫酸鈉的0.1N氫氧化鈉10ml后，用熒光光譜儀(F-4500日立)測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長495nm、熒光波長517nm)，由此算出干擾素-α-Con1的封入率。
實施例1〔干擾素-α-Con1的FITC標(biāo)記化〕在干擾素-α-Con1水溶液(19mg/ml)40ml中，添加pH9.5的碳酸緩沖液150ml，用0.1N氫氧化鈉水溶液調(diào)制成pH9.5，用冰冷卻。將熒光素異硫氰酸酯25mg溶解于碳酸緩沖液之后，添加在經(jīng)冰冷卻的干擾素-α-Con1水溶液中，以規(guī)定的時間攪拌。添加1N鹽酸調(diào)整至pH7.0后，經(jīng)使用Sephadex G-25的凝膠過濾精制FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1。每1分子干擾素-α-Con1標(biāo)記的FITC分子數(shù)約為0.2。
〔熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記干擾素-α-Con1/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的制造〕使FITC標(biāo)記的干擾素-α-Con1水溶液和甘露糖醇水溶液混合，最終濃度調(diào)整為FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1 5mg/ml、甘露糖醇50mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度95-105℃、液體的供給速度6g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為35-45℃。回收的粉末與硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是4.7μm、10μm以下的粒子所占的比例是98.1％。
〔封入FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的PLGA微球體的制造〕將PLGA500mg溶解于乙腈2.5ml后，添加FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1/甘露糖醇噴霧干燥微粉末10mg，用ポリトロン10,000轉(zhuǎn)，經(jīng)1分鐘的處理使其分散。將分散噴霧干燥微粉末的聚合物溶液加入硅油500ml中，以400轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌，在30分鐘10mmHg以下蒸去乙腈。添加異丙醇500ml，用篩孔大小為20μm的篩子回收微球體之后，在0.1mmHg以下處理36小時。用己烷洗凈除去硅油之后，在0.1mmHg以下經(jīng)1小時處理除去己烷?；厥蘸Y孔大小為250μm的篩子下的微球體，得到本發(fā)明含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射用組合物。
實驗例1實施例1調(diào)制的微球體中的FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的封入率以上述封入率的測定法算出的結(jié)果為90％。從微球體的FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1的釋放性以上述釋放試驗法測得的結(jié)果為初期到3小時為止的釋放度在5％以下。可持續(xù)釋放1個月以上。
因此，確認(rèn)了使用以本發(fā)明的甘露糖醇為載體的噴霧干燥微粉末、采用本發(fā)明的制造方法調(diào)制的微球體，有效地封入了生理活性蛋白質(zhì)、初期釋放得到抑制、且具有經(jīng)長時間持續(xù)釋放的特性。
實施例2〔FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末的制造〕使FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1水溶液和2-羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液混合，最終濃度調(diào)整為FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1 5mg/ml、2-羥丙基-β-環(huán)糊精50mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度95-105℃、液體的供給速度6g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為35-45℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是4.0μm、10μm以下的粒子所占的比例是99.4％。
〔封入FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末的PLGA微球體的制造〕將PLGA500mg溶解于乙腈2.5ml后，添加FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末10mg，用ポリトロン10,000轉(zhuǎn)，經(jīng)1分鐘的處理使其分散。將分散有噴霧干燥微粉末的聚合物溶液加入硅油500ml中，以400轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌，于10mmHg以下經(jīng)30分鐘蒸去乙腈。添加異丙醇500ml，用篩孔大小為20μm的篩子回收微球體之后，在0.1mmHg以下處理36小時。用己烷洗凈除去硅油之后，在0.1mmHg以下經(jīng)1小時處理除去己烷?；厥蘸Y孔大小為250μm的篩子下的微球體，得到本發(fā)明含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射用組合物。
實驗例2實施例1調(diào)制的PLGA微球體中的FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末的封入率以上述封入率的測定法測定的結(jié)果為85％。使PLGA微球體在pH7.0的磷酸緩沖液中浸漬時FITC標(biāo)記干擾素-α-Con1的釋放度以上述釋放試驗法測得的結(jié)果為初期到3小時為止的釋放度在10％以下?？沙掷m(xù)釋放3周以上。
因此，確認(rèn)了使用以本發(fā)明的2-羥丙基-β-環(huán)糊精為載體的噴霧干燥微粉末、采用本發(fā)明的制造方法調(diào)制的微球體，有效地封入了生理活性蛋白質(zhì)、初期釋放得到抑制、且具有經(jīng)長時間持續(xù)釋放的特性。
實施例3使干擾素-α-Con1水溶液和甘露糖醇水溶液混合，最終濃度調(diào)整為干擾素-α-Con1 0.5mg/ml、甘露糖醇50mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度45-55℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，送風(fēng)出口的溫度為23-28℃。使用回收的干擾素-α-Con1/甘露糖醇噴霧干燥微粉末，以與實施例1相同的制造方法調(diào)制含有干擾素-α-Con1的PLGA微球體。
實驗例3〔在含有干擾素-α-Con1的PLGA微球體的制造工序中的干擾素-α-Con1的穩(wěn)定性〕使用封入了實施例3所示的干擾素-α-Con1/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的PLGA微球體，評價干擾素-α-Con1在制造工序中的穩(wěn)定性。進(jìn)行使用FL細(xì)胞和辛德畢斯病毒的抗病毒活性測定。與干擾素-α-Con1溶液的活性值比較的結(jié)果表明，封入PLGA微球體的干擾素-α-Con1的活性為103.5％，確認(rèn)了在制造工序中未發(fā)生失活。保持著穩(wěn)定性。
比較例1〔共有序列(consensus)干擾素/聚乙二醇4000噴霧干燥微粉末的制造〕使共有序列干擾素水溶液和聚乙二醇4000水溶液混合，最終濃度調(diào)整為共有序列干擾素0.2mg/ml、聚乙二醇4000 20mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度47-52℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，送風(fēng)出口的溫度為26-31℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉的容器中。
〔在含有共有序列干擾素的PLGA微球體的制造工序中共有序列干擾素的穩(wěn)定性〕為了評價共有序列干擾素/聚乙二醇4000噴霧干燥微粉末在制造工序中的穩(wěn)定性，進(jìn)行使用FL細(xì)胞和辛德畢斯病毒的抗病毒活性測定。與共有序列干擾素溶液的活性值比較的結(jié)果表明，共有序列干擾素/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的活性為31.2％，確認(rèn)了在制造工序中失活。因此，與實施例比較的結(jié)果確認(rèn)了利用糖類可避免制造工序中的共有序列干擾素的失活。
比較例2〔FITC標(biāo)記共有序列干擾素/甘露糖醇冷凍干燥微粉末的制造〕使FITC標(biāo)記共有序列干擾素水溶液和甘露糖醇水溶液混合，最終濃度調(diào)整為FITC標(biāo)記共有序列干擾素3.9mg/ml、甘露糖醇50mg/ml、進(jìn)行冷凍干燥。對冷凍干燥粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是69.3μm、10μm以下的粒子所占的比例是3.3％。
〔封入FITC標(biāo)記共有序列干擾素/甘露糖醇冷凍干燥微粉末的PLGA微球體的制造〕將PLGA500mg溶解于乙腈2.5ml后，添加FITC標(biāo)記共有序列干擾素/甘露糖醇冷凍干燥微粉末10mg，用ポリトロン10,000轉(zhuǎn)，經(jīng)1分鐘的處理使其分散。將分散冷凍干燥微粉末的聚合物溶液加入硅油500ml中，以400轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌，于10mmHg以下經(jīng)30分鐘蒸去乙腈。添加異丙醇500ml，用篩孔大小為20μm的篩子回收微球體之后，在0.1mmHg以下處理36小時。用己烷洗凈除去硅油之后，在0.1mmHg以下經(jīng)1小時處理除去己烷?；厥蘸Y孔大小為250μm的篩子下的微球體，得到本發(fā)明含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射用組合物。
〔從封入FITC標(biāo)記共有序列干擾素/甘露糖醇冷凍干燥微粉末的PLGA微球體的初期釋放度的評價〕微球體中的FITC標(biāo)記共有序列干擾素/甘露糖醇冷凍干燥微粉末的封入率以上述封入率的測定法算出的結(jié)果為122％。從微球體的FITC標(biāo)記共有序列干擾素的釋放度以上述釋放試驗法測得的結(jié)果為初期到3小時為止的釋放度為68％。
因此，確認(rèn)了使用本發(fā)明的噴霧干燥微粉末的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射用組合物不僅有效地封入生理活性蛋白質(zhì)、初期釋放得到抑制、且具有長時間持續(xù)釋放的特性，而且生理活性蛋白質(zhì)的生理活性也得到保持。加之如果噴霧干燥微粉末的粒徑在10μm以下的占90％以上，則可得到封入率、初期釋放均良好的微球體。
實施例4〔BMP-2實驗方法〕用于噴霧干燥微粉末中的活性測定的試料調(diào)制法將噴霧干燥微粉末溶解于稀釋用的緩沖液(0.01％吐溫80甘氨酸緩沖液pH4.5，采用微羅利(マイクロロ一リ一)法測定BMP-2的濃度，使用含有10％胎牛血清的杜爾貝科(ダルベッコ)改良的MEM培養(yǎng)基(pH7.4)，由用稀釋用緩沖液調(diào)制的BMP-2溶解液制成BMP-2濃度約為0.488-1380ng/mL的稀釋系列，作為試料溶液使用。
用于微球體中的活性測定的試料調(diào)制法在含有噴霧干燥微粉末的微球體中添加丙酮，使PLGA溶解，經(jīng)離心處理后(2000rpm、10分鐘)后，除去上清液。經(jīng)4次重復(fù)該操作回收噴霧干燥微粉末。
回收的噴霧干燥微粉末采用與上述相同的方法制作試料溶液。
效價測定法BMP-2的效價是測定依賴于BMP-2濃度的亢進(jìn)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性(參考文獻(xiàn)內(nèi)分泌學(xué)130卷、1992年1318-1324頁)。細(xì)胞是使用骨髓基質(zhì)細(xì)胞的W20細(xì)胞(由遺傳學(xué)研究院(現(xiàn)為Wyeth公司)提供的細(xì)胞株)。
〔BMP-2/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的制造〕使BMP-2水溶液和甘露糖醇水溶液混合，最終濃度調(diào)整為BMP-2 0.5mg/ml、甘露糖醇50mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度48-53℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為26-31℃。回收的粉末與硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是4.9μm、10μm以下的粒子所占的比例是97.9％。
實施例5〔BMP-2/甘露糖醇/吐溫80噴霧干燥微粉末的制造〕使BMP-2水溶液和甘露糖醇/吐溫80水溶液混合，最終濃度調(diào)整為BMP-20.5mg/ml、甘露糖醇50mg/ml、吐溫80 1mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度48-53℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為27-32℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是6.2μm、10μm以下的粒子所占的比例是90.2％。
實施例6〔BMP-2/甘露糖醇/甘氨酸噴霧干燥微粉末的制造〕使BMP-2水溶液和甘露糖醇/甘氨酸水溶液混合，最終濃度調(diào)整為BMP-20.5mg/ml、甘露糖醇45mg/ml、甘氨酸5mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度48-53℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為26-31℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是4.6μm、10μm以下的粒子所占的比例是98.3％。
實施例7〔BMP-2/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末的制造〕使BMP-2水溶液和2-羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液混合，最終濃度調(diào)整為BMP-2 0.5mg/ml、2-羥丙基-β-環(huán)糊精50mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度48-53℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為26-31℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是4.7μm、10μm以下的粒子所占的比例是98.3％。
實施例8〔BMP-2/2-羥丙基-β-環(huán)糊精/吐溫80噴霧干燥微粉末的制造〕使BMP-2水溶液和2-羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液混合，最終濃度調(diào)整為BMP-2 0.5mg/ml、2-羥丙基-β-環(huán)糊精50mg/ml、吐溫80 1mg/mL。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度47-52℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為26-31℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是6.3μm、10μm以下的粒子所占的比例是90.1％。
實施例9〔BMP-2/2-羥丙基-β-環(huán)糊精/甘氨酸噴霧干燥微粉末的制造〕使BMP-2水溶液和2-羥丙基-β-環(huán)糊精/甘氨酸水溶液混合，最終濃度調(diào)整為BMP-2 0.5mg/ml、2-羥丙基-β-環(huán)糊精45mg/ml、甘氨酸5mg/mL。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度48-53℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為25-30℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是5.8μm、10μm以下的粒子所占的比例是97.2％。
實施例10〔封入含有BMP-2的噴霧干燥微粉末的PLGA微球體的制造〕將PLGA500mg溶解于乙腈2.5ml后，添加BMP-2/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末10mg，用ポリトロン10,000轉(zhuǎn)，經(jīng)1分鐘的處理使其分散。將分散噴霧干燥微粉末的聚合物溶液加入硅油500ml中，以400轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌，在30分鐘10mmHg以下蒸去乙腈。添加異丙醇500ml，用篩孔大小為20μm的篩子回收微球體之后，在0.1mmHg以下處理36小時。用己烷洗凈除去硅油之后，在0.1mmHg以下經(jīng)1小時處理除去己烷?；厥蘸Y孔大小為250μm的篩子下的微球體，得到本發(fā)明含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射用組合物。
實驗例4〔含有BMP-2的噴霧干燥粉末及PLGA微球體中的BMP-2的穩(wěn)定性〕為了評價含有BMP-2的噴霧干燥粉末及PLGA微球體中封入的BMP-2在制造工序中的穩(wěn)定性，進(jìn)行使用W20細(xì)胞的活性測定。與BMP-2溶液的活性值比較的結(jié)果表明，BMP-2-甘露糖醇噴霧干燥微粉末及使用BMP-2-2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末的PLGA微球體中封入的BMP-2的活性分別保持為高活性的105.7％、103.9％。確認(rèn)了在制造工序中未失活而保持穩(wěn)定狀態(tài)。
實施例11〔氯化溶菌酶實驗方法〕用于噴霧干燥微粉末中的活性測定的試料調(diào)制法將噴霧干燥微粉末用精制水溶解，采用微羅利法測定氯化溶菌酶的濃度，使用pH6.2的磷酸緩沖溶液稀釋，使蛋白濃度為1μg/mL，作為試料溶液使用。
用于微球體中的活性測定的試料調(diào)制法在含有噴霧干燥微粉末的微球體中添加丙酮，使PLGA溶解，經(jīng)離心處理(2000rpm、10分鐘)后，除去上清液。經(jīng)4次重復(fù)該操作回收噴霧干燥微粉末。
回收的噴霧干燥微粉末采用與上述相同的方法制作試料溶液。
效價測定法氯化溶菌酶的效價是以依從于氯化溶菌酶的濃度而變化的底物溶解性為指標(biāo)進(jìn)行測定(參考文獻(xiàn)日本藥局方外醫(yī)藥品規(guī)格，1997，P352-353)。底物使用溶壁微球菌的干燥菌體。
〔氯化溶菌酶/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的制造〕使氯化溶菌酶水溶液和甘露糖醇水溶液混合，最終濃度調(diào)整為氯化溶菌酶5mg/ml、甘露糖醇50mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度48-53℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為24-30℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是4.9μm、10μm以下的粒子所占的比例是96.6％。
實施例12〔氯化溶菌酶/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末的制造〕使氯化溶菌酶水溶液和2-羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液混合，最終濃度調(diào)整為氯化溶菌酶10mg/ml、甘露糖醇50mg/ml。噴霧干燥條件為送風(fēng)入口的溫度49-50℃、液體的供給速度3g/分鐘、噴霧壓2kg/cm2，其結(jié)果是送風(fēng)出口的溫度為27-29℃?；厥盏姆勰┡c硅膠一同保存在密閉容器中。對噴霧干燥微粉末的粒徑測定的結(jié)果為平均粒徑是5.8μm、10μm以下的粒子所占的比例是90.9％。
〔封入含有氯化溶菌酶的噴霧干燥微粉末的PLGA微球體的制造〕將PLGA500mg溶解于乙腈2.5ml后，添加含有氯化溶菌酶的噴霧干燥微粉末10mg，用ポリトロン10,000轉(zhuǎn)，經(jīng)1分鐘的處理使其分散。將分散有噴霧干燥微粉末的聚合物溶液加入硅油500ml中，以400轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌，在30分鐘10mmHg以下蒸去乙腈。添加異丙醇500ml，用篩孔大小為20μm的篩子回收微球體之后，在0.1mmHg以下處理36小時。用己烷洗凈除去硅油之后，在0.1mmHg以下經(jīng)1小時處理除去己烷?；厥蘸Y孔大小為250μm的篩子下的微球體，得到含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射用組合物。
實驗例5〔在含有氯化溶菌酶的PLGA微球體的制造工序中的氯化溶菌酶的穩(wěn)定性〕為了評價氯化溶菌酶溶液、含有氯化溶菌酶的噴霧干燥微粉末、PLGA微球體中封入的氯化溶菌酶在制造工序中的穩(wěn)定性，進(jìn)行使用溶壁微球菌干燥菌體的活性測定。與氯化溶菌酶溶液的活性值比較的結(jié)果表明，使用氯化溶菌酶/甘露糖醇噴霧干燥微粉末的PLGA微球體中氯化溶菌酶的活性值為90.1％，使用氯化溶菌酶/2-羥丙基-β-環(huán)糊精噴霧干燥微粉末的PLGA微球體中氯化溶菌酶的活性為92.6％。均顯示不小于90％的活性。確認(rèn)了在制造工序中保持不失活的穩(wěn)定狀態(tài)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明，通過使用糖類，干燥溫度可不需設(shè)定為高溫即可實施噴霧干燥，從而可避免由于熱而導(dǎo)致的生理活性蛋白質(zhì)的變性和失活，調(diào)制粒徑得到控制的蛋白質(zhì)微粉末變得極為容易。此外，使用保持有生理活性、粒徑得到充分控制的蛋白質(zhì)微粉末，可均勻分散于生物降解性高分子溶液中，保持內(nèi)包于微球體內(nèi)的生理活性蛋白質(zhì)的生理活性、還可實現(xiàn)在微球體中的高封入率、抑制初期釋放。
因此本發(fā)明可以高封入率將噴霧干燥微粉末封入緩釋微球體中，同時，可抑制自微球體的初期釋放及達(dá)到持續(xù)的釋放，在制劑的過程中一般難以保持生理活性蛋白質(zhì)的生理活性，本發(fā)明可提供生理活性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性高的緩釋注射用組合物。
權(quán)利要求
1.含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，將粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的由生理活性蛋白質(zhì)和糖類組成的噴霧干燥微粉末均勻地分散于生物降解性高分子物質(zhì)的基質(zhì)中而制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，粒徑在6μm以下的噴霧干燥微粉末所占的比例為50％以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，糖類為甘露糖醇及/或環(huán)糊精類。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，環(huán)糊精類為2-羥丙基-β-環(huán)糊精。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，生物降解性高分子物質(zhì)為乳酸-乙醇酸的共聚物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，生理活性蛋白質(zhì)為干擾素類。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，干擾素類為干擾素-α-Conl。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，組合物為微球體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，微球體的平均粒徑約為20-250μm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，生理活性蛋白質(zhì)的含有量相對于糖類約為0.01-80％(w/w)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，噴霧干燥微粉末的濃度相對于生物降解性高分子物質(zhì)約為0.01-20％(w/w)。
12.含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，使以生理活性蛋白質(zhì)和糖類為實質(zhì)性的組成成分、且粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的噴霧干燥微粉末分散于生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液中之后，在油類中除去該有機(jī)溶劑而制得。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，使粒徑在6μm以下的噴霧干燥微粉末所占的比例為50％以上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，糖類為甘露糖醇及/或環(huán)糊精類。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，環(huán)糊精類為2-羥丙基-β-環(huán)糊精。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，生物降解性高分子物質(zhì)為乳酸-乙醇酸的共聚物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，生理活性蛋白質(zhì)為干擾素類。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，干擾素類為干擾素-α-Conl。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，油類為硅油、大豆油、芝麻油、棉子油、礦物油。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，油類為硅油。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，組合物為微球體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，微球體的平均粒徑約為20-250μm。
23.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，生理活性蛋白質(zhì)的含有量相對于糖類約為0.01-80％(w/w)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物，其特征在于，噴霧干燥微粉末的濃度相對于生物降解性高分子物質(zhì)為10％(w/w)以下。
25.含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，使以生理活性蛋白質(zhì)和糖類為實質(zhì)性的組成成分、且粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的噴霧干燥微粉末分散于生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液中之后，在油類中除去該有機(jī)溶劑而制得。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，使粒徑在6μm以下的噴霧干燥微粉末所占的比例為50％以上。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，糖類為甘露糖醇及/或環(huán)糊精類。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，環(huán)糊精類為2-羥丙基-β-環(huán)糊精。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，生物降解性高分子物質(zhì)為乳酸-乙醇酸的共聚物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，生理活性蛋白質(zhì)為干擾素類。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，干擾素類為干擾素-α-Conl。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，油類為硅油、大豆油、芝麻油、棉子油、礦物油。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，油類為硅油。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，組合物為微球體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，微球體的平均粒徑約為20-250μm。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，噴霧干燥微粉末的濃度相對于生物降解性高分子物質(zhì)為10％(w/w)以下。
37.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物的制造方法，其特征在于，生理活性蛋白質(zhì)的含有量相對于糖類約為0.01-80％(w/w)。
全文摘要
本發(fā)明提供以保持生理活性蛋白質(zhì)的生理活性的狀態(tài)進(jìn)行噴霧干燥，高效率地將其封入生物降解性高分子物質(zhì)中，且達(dá)到初期釋放得到抑制、長時間持續(xù)釋放的緩釋注射用組合物。本發(fā)明還涉及使以生理活性蛋白質(zhì)和糖類為實質(zhì)性的組成成分、且粒徑在10μm以下的粒子占90％以上的噴霧干燥微粉末分散于生物降解性高分子物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶液中之后，在油類中除去該有機(jī)溶劑而制得的含有生理活性蛋白質(zhì)的緩釋注射劑用組合物。
文檔編號A61K9/56GK1523998SQ0281351
公開日2004年8月25日 申請日期2002年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月9日
發(fā)明者真榮田篤, 希, 高石勇希, 中西貴代, 代, 實, 齋藤勝實, 山下升, 高木彰 申請人:山之內(nèi)制藥株式會社