專利名稱：作為制備抗癌藥物的反義miRNA-210的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種RNA小分子的用途，尤其是涉及作為制備抗癌藥物的反義 miRNA-210的用途，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近幾年來，從植物、線蟲到人的細(xì)胞中廣泛存在一種非編碼的單鏈RNA小分子 (microRNA, miRNA)，它們能以不完全互補(bǔ)的方式與其靶mRNA的3’非翻譯端特定區(qū)域相互作用，抑制蛋白質(zhì)的合成。1993年Lee等采用經(jīng)典克隆方法在線蟲中首次克隆了 lin_4基因，通過點(diǎn)突變的方法證實(shí)小分子RNA的存在。2000年Reinhart等在人和果蠅中發(fā)現(xiàn)了 let-7基因的存在，于是推測(cè)這類小分子可能是 類進(jìn)化上保守，在生命過程中起重要作用的調(diào)節(jié)分子。隨后人們?cè)谥参?、線蟲、果蠅和哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了一千多個(gè)miRNA基因。小 RNA的研究給我們帶來重要的啟迪是基因組非組蛋白編碼區(qū)蘊(yùn)含著重要的生命功能活動(dòng)信息?，F(xiàn)有研究表明生命的一些重要活動(dòng)如幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞的發(fā)生和分化、神經(jīng)系統(tǒng)的分化等都被一些非蛋白編碼小RNA的調(diào)控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我們更是知之甚少。長(zhǎng)期以來，有關(guān)基因的研究重點(diǎn)都在蛋白編碼基因上，而小RNA的發(fā)現(xiàn)和研究對(duì)揭示基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，讓我們更為深入的了解生命之奧秘?zé)o疑具有重大的科學(xué)價(jià)值。
據(jù)統(tǒng)計(jì)，miRNA在人類基因組中約占1%的數(shù)量，在不同的時(shí)空發(fā)育階段表達(dá)量存在顯著差異。Bartel 等(Ambros V, Bartel B, Bartel DP，Burge CB, Carrington JC，Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall Μ, Matzke Μ, Ruvkun G, Tuschl Τ.)提出，由于miRNA與靶mRNA互補(bǔ)程度不同，起著切割或微弱抑制作用。由于其作用靶點(diǎn)的多寡，miRNA表達(dá)量亦不同，通過基因芯片技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)所有miRNA時(shí)空表達(dá)的狀況。在此基礎(chǔ)上，尋找miRNA靶基因，揭示其作用機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)，也是后基因組時(shí)代需要解決的問題之一。全部miRNA基因功能的揭示可能會(huì)給人們對(duì)生命現(xiàn)象的理解帶來一場(chǎng)深刻的革命。
近幾年有關(guān)miRNA在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用研究已積累了大量的資料。研究表明，miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)亡，血細(xì)胞分化，神經(jīng)元的極性，胰島素分泌， 大腦形態(tài)形成，心臟發(fā)生，胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重大作用，而miRNA突變或者異位表達(dá)又與多種人類癌癥相關(guān)，具有腫瘤抑制基因或者癌基因的作用。一個(gè)起腫瘤抑制基因作用的miRNA表達(dá)下降或者缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤形成。成熟miRNA水平下降導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)陌械鞍椎谋磉_(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或去分化，引起腫瘤的形成。具有癌基因功能的miRNA的過表達(dá)也將導(dǎo)致腫瘤的形成，如miRNA-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增加表達(dá)量比正常組織高5-100倍，miRNA-155前體，miRNA_15，miRNA-16在惡性淋巴瘤中亦異常表達(dá)。
腦膠質(zhì)瘤源自神經(jīng)上皮，也稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，占顱腦腫瘤的40-50%，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤最主要的生物學(xué)特性是腦組織的終位性增殖和不斷增殖，根據(jù)病理又可分為星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、多形膠母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、少枝膠母細(xì)胞瘤等。目前，腦腫瘤的流行病學(xué)和病因?qū)W尚不完全清楚，但有證據(jù)表明膠質(zhì)瘤的形成可能與一定的內(nèi)環(huán)境改變和基因變異有關(guān)，是一個(gè)多因素、多步驟的多種癌基因和/或抑癌基因參與的協(xié)同積累過程。發(fā)病男性多于女性，大多在20-50歲發(fā)病，以30-40歲多見，10歲左右兒童為另一高發(fā)期。膠質(zhì)細(xì)胞癌的生長(zhǎng)特點(diǎn)為浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織無明顯界限，多數(shù)不限于一個(gè)腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞腦組織，偏良性者生長(zhǎng)緩慢，病程較長(zhǎng)，自出現(xiàn)癥狀至就診時(shí)間平均兩年，惡性者瘤體生長(zhǎng)快，病程短，自出現(xiàn)癥狀到就診時(shí)多數(shù)在3個(gè)月之內(nèi)， 70-80% 多在半年之內(nèi)。Chan 等(Chan JA, Krichevsky AM and Kosik KS. MicroRNA-21 Is an Antiapoptotic Factor in Human Glioblastoma Cells. Cancer Res 2005； 65: 6029-6033)的研究顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤強(qiáng)烈表達(dá)miRNA_21。與非腫瘤胚胎、成人腦組織以及培養(yǎng)的非腫瘤細(xì)胞相比，miRNA-21在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織以及六個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(A172, U87, U373, LN229, LN428以及LN308)的表達(dá)顯著升高。研究表明miRNA-21在培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的抑制性表達(dá)導(dǎo)致了 caspases的激活，進(jìn)而凋亡性細(xì)胞死亡增加。這些結(jié)果顯示，通過抑制關(guān)鍵的與凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，異常表達(dá)的miRNA-21可能與導(dǎo)致惡性月中瘤表型有關(guān)。Ciafre (Ciafre SA, Galardi etal, Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma, BBRC, 2005，1351—1358)等采用miRNA芯片(含245個(gè)人和鼠miRNA探針)對(duì)9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和10種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株進(jìn)行分析表明miRNA-221在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯著上調(diào)，而一組腦中富有的miRNAs，如miRNA_128， miRNA-181a, miRNA-181b, miRNA-181c則在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)量顯著下調(diào)。
由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認(rèn)為miRNA的功能是參與生命的一些基本過程，如發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝等。腫瘤是一種遺傳物質(zhì)改變導(dǎo)致的惡性疾病，它嚴(yán)重地威脅人類的健康。為了研究參與腫瘤的miRNA分子，首先就要確定miRNA究竟在那些腫瘤細(xì)胞或組織中表達(dá)及其表達(dá)水平。 在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示異常表達(dá)的miRNA在腫瘤細(xì)胞中所起的生物學(xué)功能。但是到目前為止還沒有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)關(guān)于反義miRNA-210作為制備治療人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株侵襲的藥物的用途。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過miRNA芯片技術(shù)提供反義miRNA-210的新用途。
本發(fā)明提供反義miRNA-210作為制備治療人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株侵襲的藥物的用途。
雖然miRNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)研究已有報(bào)道，但本發(fā)明所采用的miRNA芯片整合了 476個(gè)人和鼠的miRNA探針，遠(yuǎn)比2005年Ciafre等采用的2M個(gè)miRNA芯片數(shù)量多。本發(fā)明采用同樣的方法對(duì)大量恒河猴腦組織及人神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照研究，有助于探尋年齡相關(guān)表達(dá)miRNA基因在腦腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的特點(diǎn)與規(guī)律，為蛋白組學(xué)研究提供更為深層次的研究資料。本發(fā)明采用miRNA芯片研究了三例腦膠質(zhì)瘤miRNA表達(dá)情況， 并用Northern和q-PCR等方法對(duì)芯片結(jié)果對(duì)9例腦膠質(zhì)瘤樣品和四株腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明還從Ambion公司購(gòu)買有人正常腦RNA (成人腦總RNA混合樣品)作為對(duì)照。本發(fā)明研究結(jié)果表明，miRNA-210不僅在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，也在人神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)。為了驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果，本發(fā)明采用Northern和q_PCR方法對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。本發(fā)明在Northern分析的基礎(chǔ)上，采用q_PCR方法進(jìn)一步確證miRNA-210在人腦膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中呈高表達(dá)。其次探討了是否miRNA-210像miRNA-21 -樣具有促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用，遺憾的是該項(xiàng)研究結(jié)果顯示，反義miRNA-210在這方面的作用不顯著。再次，本發(fā)明采用Evasion Assay kit (細(xì)胞侵襲檢測(cè)試劑盒)對(duì)U251和TJ905兩種細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的miRNA定量PCR和Northern驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明采用傳統(tǒng)的wound assay，進(jìn)一步驗(yàn)證了反義miRNA-210具有顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的作用。


圖1. miRNA芯片雜交2. miRNA芯片分析聚類結(jié)果。A顯示miRNA聚類總體情況。B顯示在腦膠質(zhì)瘤中顯著高表達(dá)的miRNA。C顯示在腦膠質(zhì)瘤中顯著下調(diào)的miRNA。
圖3.采用Northern和miRNA定量PCR方法檢測(cè)miR-210在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。定量PCR發(fā)現(xiàn)miR-210的拷貝數(shù)在腦膠質(zhì)瘤中(glioma樣品1_3)較正常對(duì)照組(NHBH)顯著增高(A)。與癌旁組織的平均值比較，miR-210在腦膠質(zhì)瘤中的拷貝數(shù)增高2. 00士0. 10倍，表達(dá)顯著上調(diào)(B)。對(duì)更多的glioma樣品及癌旁組織進(jìn)行Northern 分析結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)芯片結(jié)果的可靠性(C)。
圖4.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明反義nuRNA-210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。與正常對(duì)照組(U251NC和TJ905NC)及堿基錯(cuò)配序列組(U251SC和TJ905SC)比較， 反義miRNA-210能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲作用(A)。定量PCR和Northern檢定細(xì)胞轉(zhuǎn)染合成的miRNA核苷酸結(jié)果。
具體實(shí)施方式
1. RNA抽提每WOmg組織加入1 ml Trizol，用液氮研磨充分研碎組織塊。加入約 1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。4°C，12, OOOrpm離心 15分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清液入新的1. 5 ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4°C，12000 rpm離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70%乙醇，4°C，12000 rpm離心洗滌沉淀5分鐘。
去上清，將沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶的水充分溶解，測(cè)定0D260和0擬80 值。采用無RNA酶的DNA酶I處理，QIAGEN RNeasyi試劑盒純化總RNA，詳細(xì)操作原理和方法見試劑盒說明書。瓊脂糖膠電泳評(píng)價(jià)總RNA質(zhì)量，在凝膠成像儀上觀測(cè)、拍照，保存圖像，一般認(rèn)為28S: 18S>2可以初步判定總RNA質(zhì)量較好。
2. MicroRNA 芯片的制備首先從 miRNA 信息登錄網(wǎng)站 http //microrna. sanger. ac. uk ( 2005. 09)上獲取制備miRNA探針的序列，其中包括313條人的及34條小鼠的miRNA 序列對(duì)應(yīng)的探針序列。同時(shí)，我們也將XIE發(fā)表在2005年Nature上的文章(Xie X，Lu J, Kulbokas EJ, et al. Systematic discovery of regulatory motifs in humanpromoters and 3 UTRs by comparison of several mammals[J]. Nature, 2005, 434(7031):338)中所提及的122條預(yù)測(cè)中的miRNA對(duì)應(yīng)的探針也整合到其中，最終在我們的miRNA芯片上集中了 469種不同的miRNA對(duì)應(yīng)的探針。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制，本發(fā)明在芯片上設(shè)置了陰性及陽性對(duì)照。陰性對(duì)照我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種，一種是空白點(diǎn)樣液體；另外一種就是沒有摻入Y2對(duì)應(yīng)的RNA，因此Y2就是 個(gè)最合適的陰性對(duì)照。陰性對(duì)照預(yù)期的雜交信號(hào)是很弱的，它們的信號(hào)值不足以進(jìn)入到后續(xù)的數(shù)據(jù)分析當(dāng)中。陽性對(duì)照分為三種(1)固定化陽性對(duì)照5，-GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATC-3，。
在芯片實(shí)驗(yàn)最后檢測(cè)雜交結(jié)果時(shí)，此序列應(yīng)該在cy3的激發(fā)波長(zhǎng)下有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，掃描信號(hào)值在8000以上，表明芯片上的核酸固定是沒有問題的。
(2)雜交的陽性對(duì)照我們選擇了組織內(nèi)源的，RNA堿基長(zhǎng)度在WOnt 左右的U6和tRNA作為miRNA芯片的內(nèi)源陽性對(duì)照；U6對(duì)應(yīng)的探針序列是 5，-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3， ； tRNA 對(duì)應(yīng)的探針序列是 5，-GGGTTA TGGGCCCAGCACGCTTCCGCTGCGCCACTCTGCT-3 ’ ；它們的雜交信號(hào)也應(yīng)該是比較高的，一般都超過5000信號(hào)值。
(3)芯片系統(tǒng)的陽性對(duì)照為了避免受到實(shí)驗(yàn)RNA樣品的干擾，在芯片上還點(diǎn)有與實(shí)驗(yàn)樣品沒有關(guān)系的核酸序列，以檢查芯片系統(tǒng)的有效性。本發(fā)明把這種對(duì)照稱為外標(biāo)(exogenous controls)。在miRNA芯片上，本發(fā)明設(shè)計(jì)了 8條與所有的RNA序列不具同源性的寡核苷酸序列作為外標(biāo)，名字和序列見下表。經(jīng)過blast比較，這8個(gè)核酸序列和人的全部基因序列沒有同源性。本發(fā)明用Ambion公司的miRNA Probe Construction kit (Cat#. 1550)合成了此8條探針對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)度類似miRNA的RNA序列Q0-30nt)，然后在反應(yīng)的時(shí)候摻入到實(shí)際檢測(cè)的RNA樣品中去，一同進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)摻入RNA量的不同，這些外標(biāo)點(diǎn)可以呈現(xiàn)不同的雜交信號(hào)；除了 Y2以外，一般信號(hào)值都在5000以上。芯片系統(tǒng)的陽性對(duì)照見表1。
3. miRNA芯片檢測(cè)用于miRNA芯片檢測(cè)的RNA樣品制備先使用Trizol抽提方法得到總 RNA，再使用 Ambion 公司的 mirVana miRNA isolation kit (catalog#1560)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行純化，去除占總RNA主要成分的較大片段，留下包括miRNA在內(nèi)的小片段部分。 具體純化步驟詳見試劑盒使用手冊(cè)。miRNA芯片檢測(cè)按常規(guī)方法進(jìn)行。
4.生物信息學(xué)分析由于microRNA也是通過基因芯片的手段進(jìn)行研究，所以將兩者并列說明。首先，采用的芯片是Affymetrix U133 Plus 2. Oarray，這種芯片是目前同類產(chǎn)品中覆蓋基因數(shù)目最多的一種在一張芯片上，覆蓋了 47，000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表38，500 個(gè)明晰的人類基因，來自下列公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank，dbEST，and RefSeq.其中的6，500個(gè)更新的基因來自最新的數(shù)據(jù)庫(kù)Build 159 Of the UniGene database (2003年1月25日)。 U133主要適用于研究基因的表達(dá)情況并了解基因發(fā)揮功能的網(wǎng)絡(luò)。包括1)基因表達(dá)的組織特異性和細(xì)胞特異性；2)誘導(dǎo)基因表達(dá)譜研究；3)基因表達(dá)分化和4)腫瘤表達(dá)譜研究。 在基因芯片的結(jié)果中，采用T-Test的方法來檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的顯著性差異以求得其可信度，而用不同年齡階段的數(shù)據(jù)兩兩相比的方法來求得某些蛋白質(zhì)的表達(dá)是否具有年齡特異性，使用clusterf. 0程序來進(jìn)行聚類分析。
5. Northern blotting分析使用Trizol抽提培養(yǎng)細(xì)胞或組織的總RNA，定量并質(zhì)檢。取30-50ug總RNA進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為15%。電泳結(jié)束后進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，將樣品轉(zhuǎn)至帶正電荷的尼龍膜上。將所要檢測(cè)的miRNA對(duì)應(yīng)的探針用同位素進(jìn)行末端標(biāo)記，并在適宜條件下與膜進(jìn)行雜交。雜交完成后進(jìn)行壓片掃描。再以TO基因的探針與膜進(jìn)行雜交，得到U6的雜交信號(hào)，并以此作為上樣量的衡量標(biāo)準(zhǔn)。最后使用成像系統(tǒng)讀出雜交信號(hào)的強(qiáng)度，比較各組不同的樣品間的差異。
6. qPCR檢測(cè)方法miRNA的qPCR檢測(cè)使用invitrogen的Trizol抽提總RNA，定量并質(zhì)檢。取50-100ng總RNA為模板，使用針對(duì)特定miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物及invitrogen的SuperScript ⑩ ni First-Strand Synthesis System 試劑盒合成 cDNA ο 以 cDNA 為模板，使用針對(duì)目標(biāo)miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R) Premix Ex TaqTM熒光定量PCR體系， 在stratagen MX3000P定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)得樣品的Ct值。將所得Ct值通過代入測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的公式，采用絕對(duì)定量的計(jì)算方法得出樣品中的目標(biāo)miRNA的含量。U6 基因作為內(nèi)照對(duì)miRNA qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。對(duì)于預(yù)測(cè)中的目標(biāo)基因的qPCR檢測(cè)使用invitrogen的Trizol抽提總RNA，定量并質(zhì)檢。取3ug總RNA為模板，以隨機(jī)寡核苷酸為弓I物，使用 invitrogen 的 SuperScript ⑩ III First-Strand Synthesis System試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對(duì)目標(biāo)基因的特異引物及Takara的STOR(R) Premix Ex TaqTM熒光定量PCR體系，在stratagen MX3000P定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)得樣品的 Ct值。同時(shí)測(cè)定待測(cè)樣品中的看家基因(如:B-actin, GAPDH)的Ct值，以此來校正各組樣品之間上樣量差別，將所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行比較各組之間目的基因的變化(即相對(duì)定量法)。
7.細(xì)胞培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TJ905 (由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科饋贈(zèng))培養(yǎng)在含10%FBS (蘭州民海)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251MG (購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)在含10%FBS (蘭州民海)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)箱、5%C02，2 天傳代一次。人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SHG-44 (購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)在含10%FBS (蘭州民海)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)箱、5%C02，2天傳代一次。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y (ATCC號(hào)購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)在含15%FBS (蘭州民海)的MEM-F12培養(yǎng)基中，置 37°C培養(yǎng)箱、5%C02，3-4天傳代一次。
8.細(xì)胞轉(zhuǎn)染甲氧基寡核苷酸由上海吉瑪公司化學(xué)合成，microRNA前體購(gòu)自美國(guó) Ambion 公司(Ambion Pre_mir. rM miRNA precursor CaU No. 17100)，轉(zhuǎn)染共設(shè)正常對(duì)照組，miRNA前體組，miRNA反義鏈組(anti sense), nuRNA堿基錯(cuò)配序列組(scramble)和 miRNA通用陰性對(duì)照組(EGFP)。細(xì)胞于鋪板18_24h后至70%_80%融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為L(zhǎng)ipofectamine 2000 Gnvitrogen)。轉(zhuǎn)染按本室常規(guī)方法并參照說明書進(jìn)行。寡核苷酸的工作濃度均為50nmol/L。DDRl siRNA組和siRNA通用陰性對(duì)照組(Negative)。細(xì)胞于鋪板18-24h后至70%-80%融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為L(zhǎng)ipofectamine 2000 (Invitrogen). 具體轉(zhuǎn)染方法參照說明書進(jìn)行，寡核苷酸及siRNA的工作濃度均為50nmol/L。細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的核苷酸序列見表2。
表2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用核苷酸序列表mi RXAS* ti sxlg s oi 3Antisense hss-mir210iCAGCCGCITtlCACACGCACAGScrambled hsa~mir2i0A GAA C GC GCL Al C t CG CACGCCtbrr antisenseACGGMGClGACCClGMGI79.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取無菌12孔板，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TJ905培養(yǎng)在含10%FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251MG培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)箱、 5%C02，2天傳代一次。轉(zhuǎn)染miRNA 24h后，用200ul吸頭劃出兩條十字交叉細(xì)胞刮除帶。轉(zhuǎn)染miRNA 48h后開始觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
10.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所用試劑盒為QCMTM Collagen Cell Invasion Assay kit (Chemicon Cat. #ECM551 )。轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)至80%匯合，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓18- 小時(shí)。用0. 25%胰酶消化細(xì)胞并用含5% BSA的DMEM終止反應(yīng)。細(xì)胞離心后重懸于含5%BSA的DMEM中(0.5 χ 106 cells/mL)。將250ul細(xì)胞懸液加入Boyden小室的上室中，下室加入500ul含10%FBS的DMEM，37°C培養(yǎng)箱5%C02培養(yǎng)。 48h后將小室浸入400ul細(xì)胞染液中染色20min并漂洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，之后將膜剪下于200倍顯微鏡下成像。將聚碳酸酯微孔濾膜浸入染料提取液中反應(yīng)lOmin， IOOul細(xì)胞染液轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板在560nm處讀取吸光值。
11. Caspase-3/7酶活性檢測(cè)將細(xì)胞接種于96孔板中.培養(yǎng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng) 48 小時(shí)。采用 Apo-ONETM Homogeneous Caspase-3/7 kit (Promega Cat No. G7790) 試劑盒，按說明書操作。將caspase底物和Apo-ONETM caspase3/7 buffer混合，配成 Apo-ONETM試劑。按Apo-ONETM試劑和培養(yǎng)基體積比為1 1的比例加入Apo-ONETM試劑， 300rpm-500rpm搖至少30秒，使Ap0-ONETM試劑和培養(yǎng)基充分混勻。使用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)485 士 20nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 士 25nm條件下讀取OD值。CaSpaSe3酶活性檢測(cè)也可利用化學(xué)發(fā)光法(CalbiochenuCat No. 235400)的活性。細(xì)胞計(jì)數(shù)，收集培養(yǎng)細(xì)胞，PBS 洗兩遍。加適量裂解緩沖液，液氮/37°C反復(fù)凍融三次，每次5分鐘。10，000xg，4°C離心 10分鐘。吸取上清備用。準(zhǔn)備caspase3底物溶液QmM，Calbiochem, Cat No. 235400)), caspase3抑制劑溶液(500nM)，按照如下表格的量向96孔板中加入樣品，按說明書操作。、 37°C預(yù)熱酶標(biāo)板，加入細(xì)胞裂解液和caSpaSe3抑制劑，置于37°C孵育10分鐘。加入IOul caspase3底物開始反應(yīng)，0. 5-2小時(shí)后在405nm下測(cè)OD值。
12.蛋白質(zhì)印跡分析在樣品中加入裂解液，置于液氮中反復(fù)凍融數(shù)次后，再超聲徹底破碎樣品，離心分離出蛋白質(zhì)，對(duì)取得的蛋白樣品進(jìn)行定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，煮沸3-5分鐘后，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流20mA。待前沿指示劑恰好跑出凝膠后，停止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將樣品轉(zhuǎn)至膜上后，再與所要研究的蛋白的單抗共同孵育，最終進(jìn)行顯色，得到印跡信號(hào)。同時(shí)以beta-actin為參照，對(duì)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，之后在成像系統(tǒng)中讀出信號(hào)密度，進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)miRNA-210的過度表達(dá)顯著。在芯片分析的基礎(chǔ)上，采用Northern， q-PCR方法進(jìn)一步確證miRNA-210在人腦膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中呈高表達(dá)。本發(fā)明采用 Invasion Assay kit (細(xì)胞侵襲檢測(cè)試劑盒)對(duì)U251和TJ905兩種細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。采用woimdassay，進(jìn)一步驗(yàn)證了反義miRNA-210具有顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的作用。侵襲性和轉(zhuǎn)移性是癌細(xì)胞最主要的生物學(xué)特性，也是惡性腫瘤的重要標(biāo)志。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miRNA-210可作為一種癌基因促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲作用。
權(quán)利要求
1.作為制備抗癌藥物的反義miRNA-210的用途，其特征在于作為制備治療人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株侵襲的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1說述的作為制備抗癌藥物的反義miRNA-210的用途，其特征在于 本發(fā)明所采用的miRNA芯片整合了 476個(gè)人和鼠的miRNA探針。
全文摘要
發(fā)明涉及作為制備抗癌藥物的反義miRNA-210的用途，尤其是涉及反義miRNA-210的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。 本發(fā)明采用miRNA芯片研究了三例腦膠質(zhì)瘤miRNA表達(dá)情況，并用Northern和q-PCR等方法對(duì)芯片結(jié)果對(duì)9例腦膠質(zhì)瘤樣品和四株腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102475892SQ20101055343
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者王爽 申請(qǐng)人:大連創(chuàng)達(dá)技術(shù)交易市場(chǎng)有限公司