專利名稱：重組血小板源生長因子的水凝膠制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥物的水凝膠制劑，具體地，本發(fā)明涉及一種重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑。
背景技術：
糖尿病是全球性高發(fā)疾病之一。1998年的統(tǒng)計數(shù)字顯示，全球糖尿病患者約有1.43億人。美國目前大約有1600萬人患有糖尿病，中國糖尿病人更是高達4000多萬，并且還以每年1‰的速度遞增。據(jù)WHO專家估計，到2025年全球糖尿病患者將達3億，其中75％的糖尿病人在印度、中國等發(fā)展中國家。
糖尿病人的一個特殊問題是足部及下肢發(fā)生潰瘍，簡稱糖尿病足(干性壞疽)。周邊神經(jīng)病變、肢端缺血和感染是三個主要的致病因素。其發(fā)病率隨著患者年齡增加而增大，多發(fā)于40歲以上的患者中。糖尿病足很難治愈，目前臨床主要有維持、預防感染和營養(yǎng)神經(jīng)三種治療方法，但都無法從根本上使組織再生，促進創(chuàng)面愈合。病人的潰瘍長期不能愈合，甚至遲遲無皮膚生長的現(xiàn)象，并發(fā)感染，最終的結果是截肢。據(jù)統(tǒng)計，美國每年由各種類型糖尿病導致截肢的有5.6萬人，單是住院治療和截肢的總費用平均每人就需要4萬美元，為此美國每年支出的醫(yī)療費用超過22億美元，給家庭和社會帶來極大負擔。而血小板源生長因子可以促進創(chuàng)面組織再生，增加糖尿病足的治愈率，降低截肢的危險。
血小板源生長因子(Platelet-Derived Growth Factor，以下簡稱PDGF)是一種通常儲存于血小板α顆粒中的堿性蛋白質，由血小板、趨化到受損部位的巨噬細胞、受損血管附近的平滑肌細胞和受損部位的血管內皮細胞等多種細胞所分泌，具有促進中胚層源細胞分裂；刺激白細胞、平滑肌細胞、單核細胞和成纖維細胞的趨化作用；參與創(chuàng)傷修復過程中的炎癥的反應，參與組織和細胞的分化與增殖過程；對正常和病理狀態(tài)下的創(chuàng)傷修復有促進作用等。
PDGF是由A、B兩種單體構成的二聚體結構，其分子量為28-31KDa，可形成PDGF-AA，BB和AB三種異構體，在人類血小板來源中約85％-90％為AB型(分子量為22.5KDa，其中A鏈為13.3KDa，B鏈為12.2KDa)，約10％-15％為BB型。老年人的血小板也可含有多量的PDGF-BB，高達30％，而新鮮的血小板也可含有高達27％PDGF-AA。PDGF亞型的濃度是直接與創(chuàng)口愈合過程相關的。本發(fā)明涉及的重組血小板源生長因子為PDGF-BB型(以下簡稱為rhPDGF-BB)。
大量研究表明，慢性傷口如糖尿病足部潰瘍、壓迫性潰瘍的微環(huán)境中缺乏活性生長因子是造成它們難以愈合的主要原因。因此在這一領域中生長因子的潛在治療作用開始受到人們的廣泛關注。有關PDGF，EGF，TGF等生長因子的治療作用迅速展開。實驗表明PDGF是創(chuàng)傷愈合過程中較早出現(xiàn)的生長因子之一，在創(chuàng)面愈合的全過程中起重要作用，參與創(chuàng)口愈合的全過程。特別是針對慢性難愈性疾病如糖尿病潰瘍，慢性靜脈性潰瘍，褥瘡，放射性潰瘍等效果顯著。另外，血小板是進入創(chuàng)口的第一個細胞成分，通過釋放生長因子促進平滑肌細胞膠原蛋白的合成來啟動創(chuàng)口愈合過程。因此理論上說，PDGF應該對所有創(chuàng)面愈合均有促進作用，包括燒傷、燙傷、手術創(chuàng)口、皮外傷等急性創(chuàng)傷及對慢性靜脈潰瘍、褥瘡、放射性潰瘍等均有促進愈合作用。
在各種疤痕的治療方面，PDGF也顯示了良好的效果，現(xiàn)在已經(jīng)有一系列基于PDGF的用于治療痤瘡等留下的疤痕的修復用化妝品相繼問世。
到目前為止，PDGF是國外唯一一個在三期臨床上證明有效并已作為藥物上市的生長因子。1997年12月16日，美國食品及藥品管理局批準Ortho-McNeil公司生產的REGRANEX藥物上市，Regranex的有效活性成分是Becaplermin(0.01％)，即人重組血小板源生長因子(PDGF-BB)。Becaplermin由重組DNA技術在酵母菌中表達生產，原料Becaplermin由美國Chiron公司生產(U.S.LicenseNo.1106，Emeryville，CA 94608)；Regranex由Ortho-McNeilPharmaceutical公司推向市場(U.S.License No.1196，San German，Puerto Rico 00683)，用來治療皮下深層、有充足血管供應的糖尿病足部潰瘍。Regranex是一種羧甲基纖維素型軟膏，為無色或淡粉色，1g含100ug Becaplermin，有2g，7.5g和15g的包裝，限于外用。是目前唯一的一種PDGF劑型。
在向中國知識產權局申請的專利中有一個申請?zhí)枮?6198773.1的專利申請含生長因子的凝膠制劑，其權利要求書的所要求保護的也是PDGF的凝膠制劑，其有效藥物成分為血小板生成生長因子PDGF為PDGF-B的同二聚體，凝膠基質為纖維素聚合物，及可藥用的帶電荷化學物質，選自包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、魚精蛋白、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、色氨酸、氨基胍、鋅和鎂的組合，其中組合物為粘度在室溫下約1000-500,000cps范圍內的水性凝膠。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑，它基本上含有1)、藥物成份重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)；2)、水凝膠基質；3)、一種穩(wěn)定劑；4)、一種等滲劑；5)、一種PH調節(jié)劑。
本發(fā)明的目的之二是提供一種制備新的重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑的方法。
本發(fā)明提供的重組血小板源生長因子的水凝膠制劑，是根據(jù)rhPDGF-BB藥物自身的特點即主要是用于治療糖尿病患者潰瘍傷口的外用藥而制備的，其特點在于在潤濕的環(huán)境下，有利于傷口的愈合，使傷口不會結痂；基質本身具有彈性和柔軟性，同時外觀呈透明狀，有利于對傷口愈合情況的觀察，且與皮膚創(chuàng)面有較好的接觸性能；同時藥物需要通過凝膠層進行釋藥，具有緩慢持續(xù)釋放藥物的作用，因此藥效作用維持的時間長等等。
本發(fā)明的技術方案之一為是提供一種新的重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑，它基本上含有1)、藥物成份重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)；2)、水凝膠基質；3)、一種穩(wěn)定劑；4)、一種等滲劑；5)、一種PH調節(jié)劑。
本發(fā)明的技術方案之二為提供一種制備新的重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑的方法，包括如下步驟1)、取水凝膠基質適量，加注射用水，充分浸泡，使之溶漲完全。然后滴加適量的PH調節(jié)劑，使膠液的PH值達到5.0-9.0之間；加入一定量的等滲劑，攪拌至溶解，放于適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，制備得A液；2)、取一定量的穩(wěn)定劑，加水溶解，置于2-8℃保存，制備得B液；3)、取rhPDGF-BB藥液為C液；4)、取B液，使之通過0.22μm濾膜，在不斷攪拌A液的條件下加入到A液中，溫度控制在2-8℃，繼續(xù)攪拌至均勻，加入C液，保持上述溫度條件，至均勻。
5)分裝。
具體地，因為本發(fā)明提供的制劑是用于傷口創(chuàng)面，因此為了保證用藥的安全性、低刺激性和良好的順應性，本發(fā)明研制的rhPDGF-BB水凝膠制劑應具有無菌、等滲、PH值與皮膚接近等特點。在上述原則的指導下，我們對基質的種類、穩(wěn)定劑、防腐劑等賦形劑以及制備工藝進行了篩選，以確定產品的處方和制備工藝。
本發(fā)明采用的水凝膠基質為纖維素類聚合物材料，我們首選的是聚丙烯酸類的卡伯姆(Carbopol)?？ú肥且环N聚丙烯酸交聯(lián)樹脂，在很低的濃度下即可形成較高粘度的凝膠。卡伯姆在國外已經(jīng)廣泛用于化妝品和藥品的研究生產中，并且被多國藥典收載，在制劑中可作為凝膠基質、生物粘附材料等。常用的卡伯姆有Carbopol910NF、934NF、941NF、980NF、981NF、971NF、974NF，以上8個型號產品均取得中國大陸藥品注冊許可證，在市場均有出售。同時卡伯姆作為本實驗用基質具有外觀澄明、柔軟、吸附性強和生物粘附性質，因此本發(fā)明選用卡伯姆作為水凝膠基質。
可用于制備水凝膠的卡伯姆的型號較多，主要有兩類。其中Carbopol940的特點是分子鏈較短、粘度高，吸附能力適中，藥物釋放較慢。因此使用Carbopol940作為PDGF的基質時，該凝膠劑具具有藥物釋放緩慢、藥效作用持久的特點。經(jīng)過我們的摸索，發(fā)現(xiàn)當卡伯姆940的濃度為0.1％(W/W)-2％(W/W)，有較理想的活性結果，同時經(jīng)過粘度測定，粘度值適中。其中，優(yōu)選地，當卡伯姆940的濃度為0.4％時具有最好的穩(wěn)定性和藥效實驗結果。
而Carbopol981類分子鏈較長、粘度較低，用它作為PDGF藥物的基質時，該凝膠劑具有與皮膚吸附能力較強，藥物釋放較快的特點。經(jīng)過我們的摸索，發(fā)現(xiàn)當卡伯姆981的濃度為0.1％(W/W)-2％(W/W)，有較理想的活性結果，同時經(jīng)過粘度測定，粘度值適中。其中，優(yōu)選地，當卡伯姆981的濃度為1％時具有最好的穩(wěn)定性和藥效實驗結果。
本發(fā)明涉及的是rhPDGF-BB的水凝膠制劑，因此要求的實驗條件是無菌。同時由于rhPDGF-BB是細胞活性因子，所以整個操作過程應該保持在低溫狀態(tài)。
因此，本發(fā)明涉及的rhPDGF-BB水凝膠制劑的制備方法中，第一步是取水凝膠基質卡伯姆適量，加適量注射用水，使之充分浸泡，溶漲完全。滴加適量的PH調節(jié)劑，使膠液的PH值在5.0-9.0之間，加入一定的量的等滲劑，攪拌至溶解，放于適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，制備得A液；我們所制備的PDGF水凝膠制劑為外用藥物，因此要求在制劑配方中有等滲劑。在藥劑中可以作為等滲劑的常用材料為0.9％的氯化鈉、5％的葡萄糖及3％的甘露醇。
其中本發(fā)明中所涉及的PH調節(jié)劑為10％的NaOH溶液。
本發(fā)明涉及的第二步驟為取一定量的穩(wěn)定劑，加水溶解，置于2-8℃保存，制備得B液；這是由于rhPDGF-BB本身為細胞活性因子，因此要求加入一定量的穩(wěn)定劑進行活性保護。本發(fā)明是選擇了氨基酸作為穩(wěn)定劑。
本發(fā)明涉及的第三步驟為取rhPDGF-BB藥液為C液，其中該rhPDGF-BB藥液為通過基因工程技術，構建重組人的PDGF-BB菌株，通過擴大培養(yǎng)，發(fā)酵、純化過程，從而得到蛋白質純度大于97％、蛋白含量為1mg/ml的rhPDGF-BB藥液樣品。本發(fā)明中，rhPDGF-BB的濃度為在1μg/g-1000μg/g范圍內。
本發(fā)明涉及的第四個步驟為取上述B液，使之通過0.22μm濾膜，在攪拌下加入到A液中，溫度控制在2-8℃，繼續(xù)攪拌至均勻，加入C液，保持上述溫度條件，至均勻。即為制備好的rhPDGF-BB水凝膠制劑。
另外，由于rhPDGF-BB本身具有一定的疏水性，加入一定的離子有助于增加其在水中的溶解性能，同時可以更好地保持活性，經(jīng)過實驗我們發(fā)現(xiàn)在rhPDGF-BB的藥液中加入濃度為20mM的醋酸鈉，可以使藥物更好地發(fā)揮活性。
同時創(chuàng)面外用藥劑的特點決定了該制劑在一定時間內應該處于無菌狀態(tài)，因此可以處方中加入一定的防腐劑，在藥劑學中常用的防腐劑有水溶性的苯甲酸鈉和尼泊金類，優(yōu)選的為0.8％的尼泊金乙酯。另外加入金屬離子絡合劑可以起到穩(wěn)定的作用，優(yōu)選的為0.3％的EDTA-Na。
通過對本發(fā)明提供的重組血小板源生長因子的水凝膠制劑進行的動物藥效學實驗研究表明，本發(fā)明提供的水凝膠制劑對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面具有明顯的促修復作用，其劑量效應與國外同類制品的促創(chuàng)面愈合療效相似。
通過對本發(fā)明提供的重組血小板源生長因子的水凝膠制劑進行動物(獼猴)藥代動力學試驗研究表明，獼猴皮膚缺損涂抹了rhPDGF-BB后，各猴血漿抗原濃度隨時間的變化，循環(huán)血中rhPDGF-BB抗原濃度均在動物本底水平波動，與本底水平相比沒有統(tǒng)計意義上的升高。各組相同時間點抗原濃度對比也無統(tǒng)計意義的差別。獼猴全層皮膚缺損局部用藥后的生物利用度表明，全層皮膚潰瘍創(chuàng)面局部敷用rhPDGF-BB水凝膠制劑后，各時間點血漿樣品抗原濃度均在本底水平波動，各樣品抗原濃度水平與本底水平相比均無統(tǒng)計意義差別。生物利用度計算值為-15.8％。本發(fā)明提供的水凝膠制劑局部應用后全身吸收可以忽略不計。
具體實施例方式
實施例1 rhPDGF-BB藥液的制備本發(fā)明涉及的rhPDGF-BB藥液，是通過用通用的基因工程技術，構建重組人的PDGF-BB菌株，通過擴大培養(yǎng)，發(fā)酵、純化過程，從而得到蛋白質純度大于97％、蛋白質含量為1mg/ml的rhPDGF-BB藥液樣品。
實施例2 rhPDGF-BB的水凝膠制劑的制備下述整個過程是在無菌條件下進行操作的。
1)、空白基質的制備取4.0克的Carbopol940，加水約900毫升，使之充分浸泡，溶漲完全。在機械攪拌的條件下，滴加10％NaOH溶液適量，使膠液的PH值在5.0-9.0之間，然后加入30克的甘露醇、0.3克的EDTA-Na、0.8克的尼泊金乙酯，攪拌直到溶解，放置到適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，置冰箱中冷藏保存，備用。
2)、賴氨酸溶液的配置取5.0克的賴氨酸，加入適量的注射用水，待溶解后，放置冰箱中冷藏(2-8℃ )保存，備用。
3)、水凝膠的制備將第1)步的空白基質置于冰水浴中，用機械攪拌的方法攪拌空白基質，然后將配好的賴氨酸溶液通過0.22μm濾膜的濾器，加入到空白基質中，繼續(xù)攪拌直到均勻；然后在不斷攪拌的條件下，加入100毫克的rhPDGF-BB藥液，加注射用水至1000毫升。
實施例3 rhPDGF-BB的水凝膠制劑的制備下述整個過程是在無菌條件下進行操作的。
1)、空白基質的制備取10克的Carbopol981，加水約900毫升，使之充分浸泡，溶漲完全。在機械攪拌的條件下，滴加10％NaOH溶液適量，使膠液的PH值在5.0-9.0之間，然后加入30克的甘露醇、0.3克的EDTA-Na、0.8克的尼泊金乙酯，攪拌直到溶解，放置到適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，置冰箱中冷藏保存，備用。
2)、賴氨酸溶液的配置取5.0克的賴氨酸，加入適量的注射用水，待溶解后，放置冰箱中冷藏(2-8℃)保存，備用。
3)、水凝膠的制備將第1)步的空白基質置于冰水浴中，用機械攪拌的方法攪拌空白基質，然后將配好的賴氨酸溶液通過0.22μm濾膜的濾器，加入到空白基質中，繼續(xù)攪拌直到均勻；然后在不斷攪拌的條件下，加入100毫克的rhPDGF-BB藥液，加注射用水至1000毫升。
權利要求
1.重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑，它基本上含有1)、藥物成份重組血小板源生長因子(rhPDGF-BB)；2)、水凝膠基質；3)、一種穩(wěn)定劑；4)、一種等滲劑；5)、一種PH調節(jié)劑。
2.如權利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑，其中rhPDGF-BB的濃度在1μg/g-1000μg/g范圍內。
3.如權利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑，其中所述的水凝膠基質為卡伯姆。
4.如權利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑，優(yōu)選的水凝膠基質為卡伯姆940。
5.如權利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑，優(yōu)選的水凝膠基質為卡伯姆981。
6.如權利要求1所述的水凝膠制劑，其中水凝膠基質的濃度為0.1％(W/W)-2％(W/W)。
7.如權利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑，其中穩(wěn)定劑為氨基酸。
8.如權利要求7所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑，優(yōu)選的穩(wěn)定劑為賴氨酸。
9.如權利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑，其中等滲劑為0.9％的氯化鈉或5％的葡萄糖或3％的甘露醇。
10.如權利要求1所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑，其中還可以加入防腐劑，優(yōu)選的為水溶性的苯甲酸(鈉)及尼泊金類。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物的水凝膠制劑，具體地，本發(fā)明涉及重組血小板源生長因子(rhPDGF－BB)的水凝膠制劑，它基本上含有藥物成分重組血小板源生長因子(rhPDGF－BB)、水凝膠基質、穩(wěn)定劑等滲劑及pH調節(jié)劑。
文檔編號A61P3/00GK1506112SQ0215395
公開日2004年6月23日 申請日期2002年12月9日 優(yōu)先權日2002年12月9日
發(fā)明者卓冰, 卓 冰 申請人:北京金賽獅生物制藥技術開發(fā)有限責任公司, 北京金賽獅生物制藥技術開發(fā)有限責任