專利名稱：一種抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小鵝瘟是由小鵝瘟病毒(GPV)引起的雛鵝和雛番鴨一種急性或亞急性的敗血癥，小腸發(fā)生急性卡他性或纖維素壞死性炎癥，主要侵害4-20日齡雛鵝，傳染快、發(fā)病率與死亡率都高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大損失。本病是1956年由我國(guó)方定一在揚(yáng)州發(fā)現(xiàn)，1965年來(lái)，歐洲很多國(guó)家報(bào)道有本病的存在。轉(zhuǎn)移因子(TF，Transfer Factor)又稱傳輸因子，可以作為細(xì)胞免疫促進(jìn)劑，是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復(fù)合物，這種物質(zhì)將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，提 高受體的細(xì)胞免疫功能；同時(shí)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌作用，能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放干擾素和白介素，從而增強(qiáng)受體的抵抗力，這種轉(zhuǎn)移因子是一種小分子生物活性物質(zhì)，不含蛋白質(zhì)、可溶性好，具有純度高，免疫活性強(qiáng)，作用時(shí)間長(zhǎng)，療效良好，安全無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，以制備天然純生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移因子抑制小鵝瘟病毒，保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受小鵝瘟病毒的感染，達(dá)到根本的預(yù)防目的。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，將小鵝瘟病毒接種于鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，提取病毒制備抗原；然后將提取的病毒抗原免疫健康豬，再?gòu)谋幻庖哓i的免疫器官中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子，具體制備步驟如下
O小鵝瘟病毒抗原的制備將小鵝瘟病毒接種于12-14日齡鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，35°C，培養(yǎng)3-5天，提取尿腔液和絨尿膜，研磨超聲波處理后，經(jīng)6000-800()r/min離心，棄沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2)純化抗原將病毒粗抗原液加入到不連續(xù)梯度密度為20-60%的蔗糖離心管上，經(jīng)過(guò)超速心處理，根據(jù)小鵝瘟病毒粒子的大小確定病毒帶所在離心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到純病毒抗原備用；
3)病毒抗原免疫豬隨機(jī)選取健康的豬，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點(diǎn)注射接種方式，免疫3次，每次間隔一周，然后從宰殺豬中無(wú)菌取其脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
4)從被免疫豬中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過(guò)無(wú)菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PH為6. 8-7. 2的PBS緩沖液清洗干凈；
②將洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機(jī)中，再加入2-3倍預(yù)冷的O.85%生理鹽水，1500-2000r/min轉(zhuǎn)速，每次2 min,制得勻漿液；③勻漿液經(jīng)過(guò)-60__80°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過(guò)4-5次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細(xì)胞破碎儀中破碎3s停3s，經(jīng)過(guò)20min破碎，得到精細(xì)的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過(guò)低溫7000-8000r/min離心lOmin，取上清液，經(jīng)過(guò)濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液酸度值調(diào)PH至5.4-5. 6，凈化濾液，將凈化后的濾液用O. 22um濾膜過(guò)濾后收集，再將上述的濾液經(jīng)過(guò)截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，收集濾液再次用濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。步驟2)所述的蔗糖溶液分為4個(gè)遞增的蔗糖濃度梯度，分別為20-25%、30-35%、40-45%、55-60%。步驟3)所述取免疫豬的脾臟、胸腺、淋巴等組織之前，根據(jù)免疫學(xué)的方法檢測(cè)抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)后，再取豬的免疫組織。
本發(fā)明制備的抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子是天然純生物活性物質(zhì)，能夠有效的抑制小鵝瘟病毒，對(duì)雛鵝和雛番鴨由小鵝瘟病毒引起的小鵝瘟起到治療和預(yù)防作用，從根本上保護(hù)正常機(jī)能細(xì)胞免受小鵝瘟病毒感染和侵害。脾臟、胸腺、淋巴組織等都是免疫器官，是產(chǎn)生免疫反應(yīng)的場(chǎng)所，從這些組織中提取的多肽核酸復(fù)合物具有較好的特異性。本發(fā)明提供的小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法簡(jiǎn)單、操作行強(qiáng)、生產(chǎn)原料充足，可以在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)完成，主要技術(shù)包括病毒的增殖、健康豬的免疫和特異性抗體效價(jià)的檢測(cè)、轉(zhuǎn)移因子的提取、轉(zhuǎn)移因子的除菌處理和保存等，這種方法生產(chǎn)成本低，主要具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例I
一種抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下
O小鵝瘟病毒抗原的制備將小鵝瘟病毒接種于12日齡鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，35 V，培養(yǎng)3天，提取尿腔液和絨尿膜，研磨超聲波處理后，經(jīng)6000r/min離心，棄沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2)純化抗原將O.5ml病毒粗抗原液加入到不連續(xù)梯度密度為20%、30%、40%、55%的蔗糖離心管上，每個(gè)梯度I. Iml蔗糖溶液，經(jīng)過(guò)超速心處理，根據(jù)小鵝瘟病毒粒子的大小確定病毒帶所在離心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到純病毒抗原備用；
3)病毒抗原免疫豬隨機(jī)選取健康的豬，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點(diǎn)注射接種方式，免疫3次，每次間隔一周，根據(jù)免疫學(xué)的方法檢測(cè)抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)后，然后從宰殺豬中無(wú)菌取其脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
4)從被免疫豬中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過(guò)無(wú)菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PH為6. 8的PBS緩沖液清洗干凈；
②將洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機(jī)中，再加入2倍預(yù)冷的O.85%生理鹽水，1500r/min轉(zhuǎn)速,每次2 min,制得勻衆(zhòng)液；
③勻漿液經(jīng)過(guò)_60°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過(guò)4次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細(xì)胞破碎儀中破碎3s停3s，經(jīng)過(guò)20min破碎，得到精細(xì)的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過(guò)低溫7000r/min離心lOmin，取上清液，經(jīng)過(guò)濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液酸度值調(diào)PH至5. 4，凈化濾液，將凈化后的濾液用O. 22um濾膜過(guò)濾后收集，再將上述的濾液經(jīng)過(guò)截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，收集濾液再次用濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。實(shí)施例2
一種抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下
O小鵝瘟病毒抗原的制備將小鵝瘟病毒接種于14日齡鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，35 V，培養(yǎng)5天，提取尿腔液和絨尿膜，研磨超聲波處理后，經(jīng)8000r/min離心，棄沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2)純化抗原將O.5ml病毒粗抗原液加入到不連續(xù)梯度密度為25%、35%、45%、60%的蔗糖離心管上，每個(gè)梯度I. Iml蔗糖溶液，經(jīng)過(guò)超速心處理，根據(jù)小鵝瘟病毒粒子的大小確定病毒帶所在離心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到純病毒抗原備用；
3)病毒抗原免疫豬隨機(jī)選取健康的豬，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點(diǎn)注射接種方式，每次間隔一周，免疫3次，根據(jù)免疫學(xué)的方法檢測(cè)抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)后，然后從宰殺豬中無(wú)菌其取脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
4)從被免疫豬中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過(guò)無(wú)菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PH為7. O的PBS緩沖液清洗干凈；
②將洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機(jī)中，再加入3倍預(yù)冷的O.85%生理鹽水,2000r/min轉(zhuǎn)速,每次2 min,制得勻衆(zhòng)液；
③勻漿液經(jīng)過(guò)_80°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過(guò)4次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細(xì)胞破碎儀中破碎3s停3s，經(jīng)過(guò)20min破碎，得到精細(xì)的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過(guò)低溫8000r/min離心lOmin，取上清液，經(jīng)過(guò)濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液酸度值調(diào)PH至5.5，凈化濾液，將凈化后的濾液用O. 22um濾膜過(guò)濾后收集，再將上述的濾液經(jīng)過(guò)截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，收集濾液再次用濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。實(shí)施例3
一種抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下
O小鵝瘟病毒抗原的制備將小鵝瘟病毒接種于13日齡鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，35°C，培養(yǎng)5天，提取尿腔液和絨尿膜，研磨超聲波處理后，經(jīng)7000r/min離心，棄沉淀留上清液，得到病毒粗抗原；
2)純化抗原將O.5ml病毒粗抗原液加入到不連續(xù)梯度密度為20%、35%、40%、60%的蔗糖離心管上，每個(gè)梯度I. Iml蔗糖溶液，經(jīng)過(guò)超速心處理，根據(jù)小鵝瘟病毒粒子的大小確定病毒帶所在離心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到純病毒抗原備用；
3)病毒抗原免疫豬隨機(jī)選取健康的豬，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點(diǎn)注射接種方式，免疫3次，每次間隔一周，根據(jù)免疫學(xué)的方法檢測(cè)抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)后，然后從宰殺豬中無(wú)菌取其脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
4)從被免疫豬中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子、①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過(guò)無(wú)菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用pH為7. 2的PBS緩沖液清洗干凈；
②將洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機(jī)中，再加入3倍預(yù)冷的O.85%生理鹽水，1800r/min轉(zhuǎn)速,每次2 min,制得勻衆(zhòng)液；
③勻漿液經(jīng)過(guò)_70°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過(guò)4次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細(xì)胞破碎儀中破碎3s停3s，經(jīng)過(guò)20min破碎，得到精細(xì)的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過(guò)低溫8000r/min離心lOmin，取上清液，經(jīng)過(guò)濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液酸度值調(diào)PH至5.6，凈化濾液，將凈化后的濾液用O. 22um濾膜過(guò)濾后收集，再將上述的濾液經(jīng)過(guò)截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，收集濾液再次用濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。試驗(yàn)例I :動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)
取300只12日齡健康雛鵝，隨機(jī)分成對(duì)照、試驗(yàn)、空白三組，每組100只，在新環(huán)境中適應(yīng)三天，自由采食，攻毒劑量為1.0 108CFU/只，攻毒后第三天試驗(yàn)組開始接種抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子，每只肌注O. 2ml/只，每天一次，對(duì)照組注射生理鹽，空白全程生理鹽水，觀察臨床癥狀和死亡率作為指標(biāo)反應(yīng)本品的臨床應(yīng)用效果。結(jié)果顯示對(duì)照組發(fā)病率100%和死亡率100%，空白組沒(méi)有變化,試驗(yàn)組發(fā)病率30%，而死亡率2%。試驗(yàn)例2 :動(dòng)物安全試驗(yàn)
取健康小白鼠150只，隨機(jī)分成空白、注射組、口服三組，每組50只，空白口服和注射蒸餾水2 ml/只，注射組注射本品5 ml/只，口服組灌服本品5 ml/只，觀察小白鼠的變化。結(jié)果顯示三組都無(wú)異常變化。說(shuō)明本品安全，無(wú)不良反應(yīng)。試驗(yàn)例3 :對(duì)本發(fā)明所述制備工藝提取抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的指標(biāo)檢測(cè)
I)蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用20%磺基水楊酸方法，提取液沒(méi)有發(fā)生渾濁和沉淀現(xiàn)象，呈陰性，不含蛋白質(zhì)。2)細(xì)菌檢測(cè)通過(guò)固體、液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察無(wú)渾濁現(xiàn)象。3)支原體檢測(cè)根據(jù)《2011版中華人民共和國(guó)獸藥典》操作，檢測(cè)無(wú)支原體。4)多肽含量檢測(cè)經(jīng)過(guò)雙縮脲法測(cè)定含量為I. 752mg/ml。5) E-玫瑰花結(jié)形成率比較鵝外周血淋巴細(xì)胞表面有鼠紅細(xì)胞受體，并能與之結(jié)合形成E-玫瑰花結(jié)。而轉(zhuǎn)移因子對(duì)淋巴細(xì)胞和大鼠紅細(xì)胞的結(jié)合有一定的促進(jìn)作用。本品的花結(jié)形成率平均為35. 5. 2%。6)皮膚刺激性試驗(yàn)
取30只小白兔，分成對(duì)照、皮下注射、皮內(nèi)注射2組，采用脫毛劑對(duì)家兔脊柱兩側(cè)被毛脫去，保證皮膚的完整性，然后注射本品O. 5 ml/只，對(duì)照組注射生理鹽水，分成單次給藥、多次給藥觀察皮膚的變化。結(jié)果顯示，注射生理鹽水的10只中，有5只發(fā)生紅腫，一天消腫，試驗(yàn)組中各有3只發(fā)生，12小時(shí)內(nèi)全部消腫。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)例，我們可以總結(jié)本發(fā)明所制備的抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子安全有效的抑制小鵝瘟病毒，保護(hù)正常的機(jī)體細(xì)胞免受小鵝病毒的感染，能夠起到很好的預(yù)防作用，本發(fā)明的制備方法是可行的，應(yīng)在臨床上廣泛推廣。
權(quán)利要求
1.一種抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于將小鵝瘟病毒接種于鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，提取病毒制備抗原；然后將提取的病毒抗原免疫健康豬，再?gòu)谋幻庖哓i的免疫器官中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子，具體制備步驟如下 1)小鵝瘟病毒抗原的制備將小鵝瘟病毒接種于12-14日齡鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，35°C，培養(yǎng)3-5天，提取尿腔液和絨尿膜，研磨超聲波處理后，經(jīng)6000-800()r/min離心，棄沉淀留上清液，得到病毒粗抗原； 2)純化抗原將病毒粗抗原液加入到不連續(xù)梯度密度為20-60%的蔗糖離心管上，經(jīng)過(guò)超速心處理，根據(jù)小鵝瘟病毒粒子的大小確定病毒帶所在離心管的位置，吸取病毒抗原，透析除去抗原中的蔗糖，得到純病毒抗原備用； 3)病毒抗原免疫豬隨機(jī)選取健康的豬，隨機(jī)選取，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點(diǎn)注射接種方式，免疫3次，每次間隔一周，然后從宰殺豬中無(wú)菌取其脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存； 4)從被免疫豬中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子 ①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過(guò)無(wú)菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PH為6. 8-7. 2的PBS緩沖液清洗干凈。
②將洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機(jī)中，再加入2-3倍預(yù)冷的0.85%生理鹽水，1500-2000r/min轉(zhuǎn)速，每次2 min,經(jīng)過(guò)不去次勻漿，制得勻漿液； ③勻漿液經(jīng)過(guò)_60__80°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過(guò)4-5次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細(xì)胞破碎儀中破碎3s停3s，經(jīng)過(guò)20min破碎，得到精細(xì)的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過(guò)低溫7000-8000r/min離心lOmin，取上清液，經(jīng)過(guò)濾處理，留濾液備用； ④用稀鹽酸將濾液酸度值調(diào)PH為5.4-5. 6，凈化濾液，將凈化后的濾液用0. 22um濾膜過(guò)濾后收集，再將上述的濾液經(jīng)過(guò)截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，收集后濾液再次用濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于步驟2)所述的蔗糖溶液分為4個(gè)遞增的蔗糖濃度梯度，分別為20-25%、30-35%、40-45%、55-60%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于步驟3)所述取免疫豬的脾臟、胸腺、淋巴等組織之前，根據(jù)免疫學(xué)的方法檢測(cè)抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)后，再取豬的免疫組織。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，將小鵝瘟病毒接種于鵝胚的尿囊腔中進(jìn)行增殖，提取病毒制備抗原；然后將提取的病毒抗原免疫健康豬，再?gòu)谋幻庖哓i中免疫器官中提取抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明所制備的轉(zhuǎn)移因子能夠有效抑制小鵝瘟病毒和保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受小鵝瘟病毒的感染，預(yù)防小鵝瘟疾病的發(fā)生。此外，本發(fā)明的制備方法在生產(chǎn)上設(shè)備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)時(shí)間短，易于操作。
文檔編號(hào)A61K35/26GK102697811SQ20121013630
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者吳紅云, 徐進(jìn), 郭俊清 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司