專利名稱：一種壁虎抗癌提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種壁虎抗癌提取物。
背景技術(shù)：
壁虎是我國傳統(tǒng)的治療腫瘤的中藥材。大量的臨床報(bào)道顯示，壁虎治療惡性腫瘤效果顯著，干、鮮壁虎、含壁虎的血清、壁虎復(fù)方制劑、壁虎蛋白酶水解液等對(duì)腫瘤均有較好的療效。謝爽、王學(xué)美等(謝爽，王學(xué)美， 謝東澤.鮮壁虎提取物抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增值和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.腫瘤防治研究，2003，30 :458-461)用不同濃度的鮮壁虎提取液(取活體無蹼壁虎冷凍處死，清水洗浄，粉碎勻漿，凍融10次，自然沉淀取上清，低溫離心10000r/min,離心20min,取上清)對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行研究,結(jié)果鮮壁虎提取液在64mg/L、128mg/L、256mg/L濃度時(shí)，可以顯著抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，且有明顯的量-效關(guān)系。楊麗華、王學(xué)美等(楊麗華，楊金霞，王學(xué)美等.壁虎多糖對(duì)鼠源肝癌H22體內(nèi)外作用研究.天津中醫(yī)藥，2008，25 :494-496)進(jìn)行了壁虎多糖對(duì)鼠源肝癌H22體內(nèi)外作用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)壁虎多糖在體外作用很強(qiáng)，但對(duì)體內(nèi)移植瘤無作用，因此對(duì)壁虎多糖的抗腫瘤作用提出了質(zhì)疑。李耀輝、耿秀芳等(李耀輝，盛繼文，耿秀芳等.無蹼壁虎藥用成分抗腫瘤效果.陜西中醫(yī)，2009，30 :899-901)把鮮壁虎置入酒精致死，搗碎勻漿，こ醇溶液浸泡，蒸發(fā)除こ醇，再除脂類，得到水提物，最后冷凍干燥，得到干燥物。然后該干燥物以こ醇溶解，經(jīng)Al2O3柱層析，得到15個(gè)層析藥物樣品。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，這些樣品中的第3到第9部分有抑制H印G-2的作用，其余部分作用不明顯。而李耀輝等(李耀輝，劉冬梅，盛繼文等.無蹼壁虎抗腫瘤成分的提取及其對(duì)CT-26小鼠結(jié)腸腺癌的抑制作用.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30 :1103-1106)在無蹼壁虎抗腫瘤成分的提取及其對(duì)CT-26小鼠結(jié)腸腺癌的研究中，報(bào)道有19個(gè)層析成分，其中第11到第19個(gè)樣品無作用，第I到第10樣品均有一定的抗腫瘤作用其中第I到第6樣品作用最強(qiáng)?？到ü?、李耀輝等(康建功，張仕狀，李耀輝等.鮮無蹼壁虎抗腫瘤活性成分抑制CT-26腫瘤細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)研究.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27 441-444)還比較了鮮壁虎活性成分及其脂質(zhì)體對(duì)CT-26的作用，發(fā)現(xiàn)活性成分脂質(zhì)體在體內(nèi)的作用較強(qiáng)。上述大量的研究結(jié)果表明，壁虎提取物具有肯定的抗腫瘤作用，并且在實(shí)體瘤治療方面有良好的應(yīng)用前景，但目前的壁虎提取物的提取方法較為復(fù)雜，而且壁虎提取物對(duì)腫瘤的抑瘤效果很難達(dá)到氟尿嘧啶和阿霉素的抑瘤水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑瘤效果好的壁虎抗癌提取物。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種壁虎抗癌提取物，其采用如下方法提取而成I)將壁虎清洗、晾干，破碎成粉末，置于pH為7. 4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的緩沖溶液中，浸泡12小吋；
2)浸泡后破碎，離心取上清液加入無水こ醇至こ醇終濃度為55%進(jìn)行提取，然后離心取上清液即得壁虎醇提液；3)將壁虎醇提液蒸發(fā)濃縮，加入硫酸銨至其濃度為25%，調(diào)整pH至7，4°C靜置3 4小時(shí)，每隔30min攪拌一次，然后離心取上清得上清液；將得到的上清液加入硫酸銨至其濃度為50%，調(diào)整PH至4. 6，4°C靜置3 4小吋，每隔30min攪拌一次，然后離心得到沉淀；4)將沉淀裝入截留分子量為3. 5KDa透析袋中，將透析袋置于(TC蒸餾水中進(jìn)行透析，直至透析袋中出現(xiàn)白色絮狀物；
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5)取出透析袋將白色絮狀物進(jìn)行真空冷凍干燥，得到壁虎抗癌提取物。步驟2)和步驟3)中所述離心為7000g離心20分鐘。步驟2)所述破碎為超聲細(xì)胞破碎、膠體磨勻漿。步驟2)所述加入無水こ醇后，于4°C靜置3 4小吋，每隔30分鐘攪拌一次。步驟3)所述調(diào)整pH采用的是鹽酸。本發(fā)明的壁虎抗癌提取物，采用醇提、鹽析、透析的方法，從壁虎中提取出具有抗腫瘤作用的多肽分子，使提取物具有很強(qiáng)的抗腫瘤效果，可以作為高效、低毒的抗腫瘤新藥物的活性成分。經(jīng)過試驗(yàn)證明本發(fā)明的壁虎抗癌提取物具有很好的抗癌作用，達(dá)到了常規(guī)抗癌藥物氟尿嘧啶和阿霉素的抗癌水平，可以提高機(jī)體的免疫力，而且壁虎提取物中含有天然的壁虎多肽，具有毒性低、副作用小的優(yōu)點(diǎn)。另外本發(fā)明的制備方法簡單，易于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、壁虎晾干與粉碎把清洗過的干無蹼壁虎IOOOg晾干后，用粉碎機(jī)粉碎為粗粉。2、浸泡、破碎與勻漿置于4000mL Tris-HCl緩沖液中(pH = 7. 4)，浸泡過夜，超聲細(xì)胞破碎，膠體磨勻漿并收集勻漿液。3、離心與醇提7000g (IIOOOrpm)離心，20min，得上清液3800ml，向上清溶液中邊緩慢加入無水こ醇(99. 7%)4676ml使こ醇終濃度為55%，4°C靜置3 4小時(shí)，每隔30min攪拌一次，然后7000g (IIOOOrpm)離心，20min，取上清即得壁虎醇提物水溶液。4、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮55°C，0. 085-0. IMPa下濃縮醇提物水溶液至200ml。5、鹽溶與鹽析向壁虎醇提物水溶液中緩慢加入66. 7ml飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨飽和濃度為25%，用HCl溶液調(diào)PH至7，4°C靜置3 4小吋，每隔30min攪拌一次，然后7000g (I IOOOrpm)離心,20min,取上清得上清夜260ml ;向所得上清溶液中加入133ml飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨飽和濃度為50%，再用HCl調(diào)PH至4. 6，4°C靜置3 4小吋，每隔30min 攪拌一次,然后 7000g (IIOOOrpm)離心，20min,得沉淀 222. 6g。6、透析使用截留分子量為3. 5KDa透析袋，裝入適量鹽析物置于(TC蒸餾水中，磁カ攪拌，每30min換一次蒸餾水，直至內(nèi)溶物中出現(xiàn)大量白色絮狀物。7、凍干取透析袋內(nèi)溶液放于凍干瓶，在真空度為20Pa，溫度為_50°C條件下在真空冷凍干燥機(jī)上在干燥48H，得到干燥物62. lg。實(shí)驗(yàn)例
I、不同濃度的壁虎抗癌提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞H印G2的增殖抑制作用MTT法檢測(cè)壁虎抗癌提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制將RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞H印G2每孔IX 104/mL接種于96孔板，用不同濃度(O. 625,0. 75、I. 5、3mg/ml)的壁虎抗癌提取物，分別處理24、48、72h。結(jié)束前4h每孔加入新鮮配制5mg/mLMTT液20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入ニ甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，待完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長處測(cè)定各孔的吸光度Α，并按下式計(jì)算抑制率。抑制率(％ ) = [1_(A實(shí)驗(yàn)組/A陰性對(duì)照)]X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見表I表I不同濃度的壁虎抗癌提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞H印G2的增殖抑制作用(^ ±s, η =
5)
權(quán)利要求
1.一種壁虎抗癌提取物，其特征在于其采用如下方法提取而成 1)將壁虎清洗、晾干，破碎成粉末，置于pH為7.4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的緩沖溶液中，浸泡12小時(shí)； 2)浸泡后破碎，離心取上清液加入無水こ醇至こ醇終濃度為55%進(jìn)行提取，然后離心取上清液即得壁虎醇提液； 3)將壁虎醇提液蒸發(fā)濃縮，加入硫酸銨至其濃度為25%，調(diào)整pH至7，4°C靜置3 4小時(shí)，每隔30min攪拌一次，然后離心取上清得上清液；將得到的上清液加入硫酸銨至其濃度為50%，調(diào)整PH至4. 6，4°C靜置3 4小時(shí)，每隔30min攪拌一次，然后離心得到沉淀； 4)將沉淀裝入截留分子量為3.5KDa透析袋中，將透析袋置于0°C蒸餾水中進(jìn)行透析，直至透析袋中出現(xiàn)白色絮狀物； 5)取出透析袋將白色絮狀物進(jìn)行真空冷凍干燥，得到壁虎抗癌提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在干所述步驟2)和步驟3)中離心為7000g離心20分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在于步驟2)所述破碎為超聲細(xì)胞破碎、膠體磨勻漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在于步驟2)所述加入無水こ醇后，于4°C靜置3 4小吋，每隔30分鐘攪拌一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在于步驟3)所述調(diào)整pH采用的是鹽酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種壁虎抗癌提取物，首先將壁虎晾干粉碎，在pH為7.4的緩沖溶液中浸泡12小時(shí)，然后加入無水乙醇進(jìn)行乙醇提取，并對(duì)提取液蒸發(fā)濃縮，再將濃縮液加入硫酸銨鹽析，最后經(jīng)過透析得到白色絮狀物沉淀，將其干燥得到壁虎抗癌提取物。本發(fā)明的壁虎抗癌提取物，采用醇提、鹽析、透析的方法，從壁虎中提取出具有抗腫瘤作用的多肽分子，使提取物具有很強(qiáng)的抗腫瘤效果，可以作為高效、低毒的抗腫瘤新藥物的活性成分。經(jīng)過試驗(yàn)證明本發(fā)明的壁虎抗癌提取物具有很好的抗癌作用，達(dá)到了常規(guī)抗癌藥物氟尿嘧啶和阿霉素的抗癌水平，可以提高機(jī)體的免疫力，而且壁虎提取物中含有天然的壁虎多肽，具有毒性低、副作用小的優(yōu)點(diǎn)。另外本發(fā)明的制備方法簡單，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102688475SQ20121001085
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月14日
發(fā)明者宋 瑩, 崔朝初, 李瑞芳, 段冷昕, 王建剛 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)