專利名稱：一種腫瘤化療藥物制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物制劑及其制備方法，尤其涉及一種腫瘤化療藥物制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，腫瘤作為一種嚴重威脅人們生命的疾病，其治療方法已成為眾多科研工作者致力于研究的課題，其中，通過化學(xué)藥物(化療藥物)來消滅腫瘤細胞，是治療腫瘤疾病過程中一種非常重要而常規(guī)的手段，然而施用化療藥物消滅腫瘤細胞的同時，會殺傷正常組織細胞，不但給患者帶來難以承受的毒副作用，而且往往導(dǎo)致化療失敗?；熕幬锏亩靖弊饔玫谋举|(zhì)是化療藥物對機體正常細胞的殺傷。為了避免化療藥物對正常細胞的非特異性殺傷，現(xiàn)有的方案為將化療藥物通過載體包裹起來，使其選擇性地在腫瘤部位釋放，甚至進入腫瘤細胞內(nèi)，從而將腫瘤細胞殺傷，常見的如由納米材料制成的微粒載體系統(tǒng)，已經(jīng)報道的可對化療藥物進行包裹進行靶向給藥的納米材料包括聚乙二醇-腦磷脂共聚物(PEG-PE)、聚乳醛乙醇酸共聚物(PLGA)等，并且已被證實可以用于包裹化療藥物，并可以將化療藥物輸送到腫瘤部位，提高化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。但是，由于納米材料是外源性物質(zhì)，其本身對生物機體存在一定的毒副作用，同時臨床使用的納米顆粒的粒徑規(guī)格也導(dǎo)致其容易穿過正常細胞的細胞膜，增加了其納米載體以及所攜帶的化療藥物對機體的毒副作用。此外，一些納米顆粒所采用的特殊材料以及工藝技術(shù)，大大增加了成本，不利于臨床推廣應(yīng)用。因此，如何針對性地降低化療藥物的毒副作用但又不降低甚至提高其對腫瘤細胞的殺傷效果，已成為腫瘤研究領(lǐng)域中亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種腫瘤化療藥物制劑，以源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡作為腫瘤化療藥物制劑的載體，包裹化療藥形成制劑，作為靶向藥，更利于達到腫瘤治療部位，提高化療藥的藥效發(fā)揮，同時克服了使用外源給藥載體給藥對機體有毒副作用的缺陷。本發(fā)明還提供了一種腫瘤化療藥物制劑的制備方法，實現(xiàn)將作為治療有效成分的化療藥包裹到源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡中。本發(fā)明提供的一種腫瘤化療藥物制劑，包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和被包裹在所述細胞囊泡內(nèi)作為有效成分的化療藥。作為本領(lǐng)域的基礎(chǔ)知識，細胞是由細胞膜包裹細胞內(nèi)容物構(gòu)成，而細胞膜是由磷脂雙分子層中間鑲嵌蛋白質(zhì)分子所組成，其球狀結(jié)構(gòu)則通過細胞內(nèi)被稱為細胞骨架的蛋白纖維絲所形成的向心牽拉力得以維持。當細胞受到外來信號(例如化療藥或紫外線等)刺激細胞發(fā)生凋亡時，細胞骨架附著細胞膜部位的部分蛋白纖維絲斷裂或失去附著， 向心牽拉力突然消失，使得局部細胞膜結(jié)構(gòu)在外向拉力作用下，向外膨脹、突出并包裹細胞內(nèi)容物以囊泡形式釋放到細胞外的介于細胞和分子之間的亞層次結(jié)構(gòu)中，其大小基本界于100-1000納米(nm)，即本發(fā)明所述的“細胞囊泡”。本發(fā)明提供的藥物制劑由于采用了上述細胞囊泡作為包裹化療藥的載體，成為一種微顆粒，更利于作為靶向藥穿過腫瘤毛細血管組織殺傷腫瘤細胞(一般對腫瘤而言，組成其血管的細胞之間的縫隙較正常組織會顯著增加，達到100-780nm大小)，而不能進入正常組織(其通透性一般在5-lOnm)，對正常組織不會產(chǎn)生任何損傷，也就避免了使用納米材料等外源載體構(gòu)成的靶向藥給藥對機體的毒害作用。本發(fā)明使用源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡包裹化療藥得到的制劑，相比于使用外源性載體的化療藥，更利于藥效的發(fā)揮，降低機體的抗藥性。因所述用于包裹化療藥的細胞囊泡源自腫瘤細胞，推薦的是源自與所要治療的腫瘤細胞同種類型的腫瘤細胞，所述細胞囊泡可以很容易地與患者體內(nèi)的腫瘤細胞的細胞膜融合，干擾腫瘤細胞細胞膜上原有的泵系統(tǒng)，減少對進入腫瘤細胞的化療藥的泵出，從而增強了腫瘤細胞對所述細胞囊泡內(nèi)包裹的化療藥的敏感性。再一方面，當所述細胞囊泡包裹了一定劑量的化療藥物，施用到腫瘤細胞時，會產(chǎn)生“連鎖反應(yīng)”即，包裹了化療藥的微顆粒殺傷了先進入的腫瘤細胞后，被殺傷而凋亡的腫瘤細胞繼續(xù)形成新的囊泡而包裹化療藥，對其他腫瘤細胞進行持續(xù)給藥直至藥效全部發(fā)揮，可以理解，相比于直接施用化療藥，包裹有同樣劑量的化療藥的微顆粒對腫瘤細胞的殺傷效果更加顯著，因此本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑在治療腫瘤的過程中可以根據(jù)需要適當降低該藥物制劑的給藥量或者選擇細胞囊泡包裹的化療藥量的規(guī)格較小的藥劑，以實現(xiàn)與直接施用化療藥時同樣的治療效果，從而本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑在一定程度上可減少化療藥使用量，并可使化療藥在體內(nèi)充分發(fā)揮藥效而避免沉積，減少化療藥對人體的傷害。本發(fā)明實際上提供了一種獲得靶向藥的新的思路和方案，該靶向藥組成中的具體化療藥可以是臨床使用的治療各種腫瘤的化療藥，例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、白血病和/或膠質(zhì)瘤等的化療藥，可以是一種化療藥，也可以是多種化療藥的組合，用于包裹化療藥的細胞囊泡(載體)則優(yōu)選來自與所要治療的腫瘤細胞同種類型的腫瘤細胞。根據(jù)本發(fā)明藥物制劑的優(yōu)選方案，該藥物制劑中所包含的化療藥為含有治療提供所述細胞囊泡的腫瘤的有效成分的化療藥；所包含的化療藥也可以是已經(jīng)在臨床上使用的藥物，可以是注射制劑，或口服制劑，如果是片劑、粉劑、顆粒劑，可以將其溶解后使用(即 溶解后與細胞囊泡進行孵育以包裹進細胞囊泡)。本發(fā)明提供的藥物制劑可以是常規(guī)的靶向藥劑型，例如注射制劑。作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，由所述細胞囊泡包裹化療藥所形成的腫瘤化療藥物制劑的粒度為100-1000納米。所述腫瘤化療藥物制劑中含有的化療藥的劑量受在制備過程中加入到腫瘤細胞培養(yǎng)液的化療藥的量的多少所控制，但最高含量取決于所使用的化療藥在作為載體的細胞囊泡中的最大飽和度。所以，在該最高含量范圍內(nèi)，可以得到不同規(guī)格的藥劑。本發(fā)明還提供了制備所述藥物制劑的方法，S卩，通過任何可行的方法將化療藥包裹進所述細胞囊泡，所使用的細胞囊泡通過使腫瘤細胞凋亡而得到。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供的所述的腫瘤化療藥物制劑的制備方法，包括對腫瘤細胞施用作為有效成分的化療藥使之凋亡，收集凋亡腫瘤細胞所釋放的微顆粒，該微顆粒即為細胞囊泡包裹化療藥后形成的所述藥物制劑；或者使用紫外線照射腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡，收集凋亡腫瘤細胞所釋放的細胞囊泡，然后將所述細胞囊泡與作為有效成分的化療藥進行孵育，使化療藥被細胞囊泡包裹，然后收集微顆粒，該微顆粒即為細胞囊泡包裹有化療藥后形成的所述藥物制劑，其優(yōu)選可以為注射制劑，例如注射液。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以控制化療藥的加入量獲得不同規(guī)格(有效成分的含量)的藥物制劑，方便對不同階段的腫瘤患者的給藥。所得到的藥物微顆粒中化療藥物含量可以根據(jù)所選擇的藥物的性質(zhì)、提供細胞囊泡的腫瘤種類，以及所要治療的腫瘤患者的患病階段，通過適當摸索而確定。一般的，控制所述腫瘤化療藥物制劑中含有的化療藥的藥量可以是接近該化療藥在作為載體的細胞囊泡中的最大飽和度的量，或者根據(jù)設(shè)定藥物制劑的規(guī)格控制化療藥的加入量。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)所要治療的腫瘤類型的不同，以及所使用的作為有效成分的化療藥的不同，根據(jù)以上描述的腫瘤化療藥物制劑的制備方法，選擇適合的腫瘤細胞的凋亡方法，收集微顆粒的方法，收集細胞囊泡的方法，以及細胞囊泡和治療腫瘤用化療藥的比例等條件，只要最終獲得的細胞囊泡內(nèi)包裹的作為有效成分的化療藥足以發(fā)揮所期望的治療效果即可。本發(fā)明的方案中，優(yōu)選使用紫外線或化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對于細胞囊泡的收集可使用超速離心機在低溫條件下或室溫條件下進行分離。優(yōu)選的，通過離心機，在低溫條件下左右)，以100-100000g的離心力，收集細胞囊泡。同樣的，對于微顆粒的收集也可使用超速離心機在低溫條件下進行。優(yōu)選的，通過離心機，在低溫條件下左右)，以100-100000g的離心力，收集微顆粒。對于使用紫外線照射腫瘤細胞獲得的細胞囊泡與化療藥的孵育，優(yōu)選的，化療藥以接近該化療藥在作為載體的細胞囊泡中的最大飽和度的量加入到細胞囊泡中，并在室溫條件下進行孵育，實現(xiàn)細胞囊泡對化療藥的包裹。對于所收集到的微顆粒，可以按照常規(guī)方法制成藥物制劑，尤其是注射制劑，例如，將收集到的微顆粒用生理鹽水懸浮后制成注射液。在本發(fā)明提供的腫瘤化療藥物制劑的制備方法中，在使所述腫瘤細胞凋亡之前還包括對腫瘤細胞進行培養(yǎng)。所述腫瘤細胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、白血病或膠質(zhì)瘤的細胞。上述細胞的培養(yǎng)方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。本發(fā)明提供的化療藥物制劑可以按照常規(guī)臨床治療方法給藥，例如對于卵巢癌腫瘤可以直接腹腔注射給藥，針對膀胱癌腫瘤可以經(jīng)尿道膀胱灌注將所述化療藥物制劑靶向給藥到膀胱癌腫瘤，給藥劑量可按照或者低于所施用的化療藥的常規(guī)劑量進行使用。本發(fā)明所述誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的判斷標準，例如觀察腫瘤細胞縮小、變暗，即可認為其已經(jīng)凋亡；將細胞囊泡與化療藥進行孵育使細胞囊泡包裹化療藥可以通過在室溫條件將添加了化療藥的細胞囊泡體系進行2-4小時的靜置來實現(xiàn)。本發(fā)明中所述的被包裹在細胞囊泡中“化療藥”，可以為本發(fā)明以前已經(jīng)被臨床應(yīng)用的化療藥物，也可以是本發(fā)明以前已經(jīng)被臨床應(yīng)用的化療藥物中的有效成分(可以不含有或不完全含有藥物輔料)，即，制備本發(fā)明的藥劑時，可以直接使用已經(jīng)臨床應(yīng)用的各種商購藥，也可以使用這些臨床用藥組成中的有效成分。所以，本發(fā)明中所涉及的藥物劑量， 均應(yīng)理解為該藥物的有效成分量。
本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下技術(shù)效果1、將來自腫瘤的細胞囊泡作為本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑的載體，解決了外源載體給藥對機體的毒副作用，并使作為有效成分的化療藥選擇性地在腫瘤部位釋放，在降低化療藥對正常細胞的毒副作用的同時，提高了化療藥對腫瘤細胞的殺傷效果。2、本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑施用到腫瘤細胞時，會產(chǎn)生“連鎖反應(yīng)”，被殺傷而凋亡的腫瘤細胞繼續(xù)形成新的囊泡而包裹化療藥，對其他腫瘤細胞進行持續(xù)給藥直至藥效全部發(fā)揮，在治療中可以降低給藥劑量，減少化療藥對人體的傷害。3、本發(fā)明提供的腫瘤化療藥物制劑的制備方法使所述細胞囊泡良好地包裹了化療藥，提供了一種靶向更好的腫瘤化療藥，利于提高化療藥對腫瘤細胞的殺傷效果。4、腫瘤細胞具有無限增殖的特性，培養(yǎng)方法成熟，根據(jù)本發(fā)明記載的方案可從腫瘤細胞獲得大量的細胞囊泡用于制備本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑，成本小，操作簡單。


圖1顯示了腫瘤細胞經(jīng)化療藥處理后產(chǎn)生了微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)。圖2顯示了腫瘤細胞經(jīng)紫外線處理后，釋放的細胞囊泡與化療藥孵育后，產(chǎn)生了微顆粒。圖3顯示了紫外線誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞系產(chǎn)生的細胞囊泡可被小鼠肝癌細胞攝取。圖4顯示了化療藥誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞系產(chǎn)生的微顆粒被小鼠肝癌細胞攝取后對小鼠肝癌細胞具有顯著的殺傷作用。圖5顯示了施用包裹有化療藥的微顆粒在殺傷腫瘤細胞后，進一步產(chǎn)生的包裹化療藥的微顆粒對剩余腫瘤細胞進行殺傷。圖6A-圖6C顯示了包裹化療藥的微顆粒對機體的毒副作用。圖7A-圖7D顯示了包裹化療藥的微顆粒抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的存活時間。圖8顯示了本發(fā)明方案對更多腫瘤細胞的應(yīng)用。圖9顯示了包裹化療藥的微顆粒體經(jīng)血液可靶向到實體腫瘤。
具體實施例方式為了證實腫瘤細胞來源的細胞囊泡能夠包裹化療藥，對腫瘤細胞能夠有效殺傷， 并且在體內(nèi)不產(chǎn)生明顯的毒副作用，下面結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明使用的術(shù)語“細胞囊泡”是由凋亡腫瘤細胞產(chǎn)生的，沒有包裹化療藥物，“微顆粒”由細胞囊泡包裹化療藥后形成。下述實施例中使用的各種腫瘤細胞、藥物及實驗動物H22小鼠肝癌細胞、A2780人卵巢癌細胞、人乳腺癌細胞系MCF-7、人肺癌細胞系 A549、人胃癌細胞系SNU1、人結(jié)腸癌Caco2、人肝癌細胞系H印G2、人膀胱癌細胞系T24、人白血病細胞系K562、以及人膠質(zhì)瘤細胞系U251，均可從美國ATCC公司或中國典型物保藏中心 CCTCC購買。BALB/c小鼠50只，購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，體重18克；嚴重聯(lián)合免疫缺陷SCID小鼠40只，購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，體重18克；
阿霉素、羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE) ,PKH26購自Sigma公司，甲氨蝶呤、順鉬購自同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院(武漢)。實施例1 使用化療藥誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞、人卵巢癌細胞凋亡產(chǎn)生了微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)1、實驗材料和試劑H22小鼠肝癌細胞，A2780人卵巢癌細胞，阿霉素(可商購獲得，臨床常用化療藥， 帶有紅色熒光)。2、實驗步驟1)在DMEM細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞，使細胞量達到2X107;培養(yǎng) A2780人卵巢癌細胞，使細胞量達到2 X IO7 ；將上述H22小鼠肝癌細胞培養(yǎng)液分為兩組，每組包括一半數(shù)量的H22小鼠肝癌細胞；同樣將A2780人卵巢癌細胞培養(yǎng)液分為兩組，每組包括一半數(shù)量的A2780人卵巢癌細胞。2)第1天，對取出的第一組H22小鼠肝癌細胞(帶細胞培養(yǎng)液)施用阿霉素，使阿霉素在培養(yǎng)液中的終濃度為100yg/ml ；對取出的從第二組H22小鼠肝癌細胞(帶細胞培養(yǎng)液)不做處理；對取出的第一組A2780人卵巢癌細胞(帶細胞培養(yǎng)液)施用阿霉素，使阿霉素在培養(yǎng)液中的終濃度為100μ g/ml ；對取出的第二組A2780人卵巢癌細胞(帶細胞培養(yǎng)液)不做處理。3)在施用阿霉素后的48小時，第一組H22小鼠肝癌細胞以及第一組A2780人卵巢癌細胞出現(xiàn)明顯變小、暗淡狀態(tài)，可以認為腫瘤細胞已經(jīng)因藥物誘導(dǎo)而凋亡。分別對兩組凋亡腫瘤細胞實施分離取上清進行逐步離心，即以500rpm、1000rpm、5000rpm的轉(zhuǎn)速各離心10分鐘，之后以14000g的離心力離心1分鐘，以除去細胞及碎片，取離心后的上清進一步離心，再以14000g的離心力離心1小時，分別得到來自第一組H22小鼠肝癌細胞和第一組A2780人卵巢癌細胞凋亡所產(chǎn)生的微顆粒，作為實驗組；對第二組H22小鼠肝癌細胞和第二組A2780人卵巢癌細胞同樣實施相同的離心步驟，獲得細胞囊泡(盡管對照組在正常培養(yǎng)條件下，但也會有由于細胞死亡而釋放的少量細胞囊泡)，作為對照組。3、實驗結(jié)果分別將上述實驗組的微顆粒和對照組的細胞囊泡使用0.9% (g/ml)的生理鹽水重懸后，分別涂片，然后在雙光子熒光顯微鏡下觀察，從圖IA-圖ID可以看出，作為對照組的，來自沒有施用阿霉素的第二組H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡涂片后沒有觀察到紅色 (見圖1A)，來自沒有施用阿霉素的第二組A2780人卵巢癌細胞的細胞囊泡涂片后也沒有觀察到紅色(見圖1C)；作為實驗組，來自施用阿霉素的第一組H22小鼠肝癌細胞的微顆粒， 涂片后觀察到紅色的微顆粒(見圖1B)，來自施用阿霉素的第一組A2780人卵巢癌細胞的微顆粒，涂片后觀察到紅色的微顆粒(見圖1D)，由于單個的阿霉素分子極小，無法使用熒光顯微鏡分辨，只有被包裹后才能聚集而被觀察到，而在熒光顯微鏡下觀察到的紅色，正是細胞囊泡包裹化療藥物阿霉素所發(fā)出的紅光，可以看出腫瘤細胞經(jīng)化療藥處理后，形成了由細胞囊泡包裹化療藥形成的微顆粒，大小在1 μ m左右，證實細胞囊泡包裹了化療藥。實施例2 分別使用紫外線誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞、人卵巢癌細胞凋亡產(chǎn)生細胞囊泡與化療藥孵育后獲得包裹化療藥的微顆粒
1.實驗材料和試劑使用的H22小鼠肝癌細胞以及A2780人卵巢癌細胞同實施例1，紫外線裝置為常規(guī)細胞超凈工作臺所有，阿霉素同實施例1。2、實驗步驟1)培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞，使細胞量分別達到2X107，培養(yǎng)方法同實施例1，將上述H22小鼠肝癌細胞培養(yǎng)液分為兩組，每組包括一半數(shù)量的H22小鼠肝癌細胞，同樣將A2780人卵巢癌細胞培養(yǎng)液分為兩組，每組包括一半數(shù)量的A2780人卵巢癌細胞。2)第1天，對所有的H22小鼠肝癌細胞(帶細胞培養(yǎng)液)和A2780人卵巢癌細胞 (帶細胞培養(yǎng)液)均使用紫外線照射30分鐘。3)在紫外線照射后的48小時，所有的H22小鼠肝癌細胞和所有的A2780人卵巢癌細胞出現(xiàn)明顯變小、暗淡的狀態(tài)，確認這些腫瘤細胞已經(jīng)被紫外線誘導(dǎo)凋亡，分別對兩種凋亡腫瘤細胞的培養(yǎng)液的上清進行逐步離心，方法同實施例1，分別得到來自兩種腫瘤細胞的細胞囊泡。4)將由第一組H22小鼠肝癌細胞和第一組A2780人卵巢癌細胞獲得的的細胞囊泡分別使用Iml的0.9% (g/ml)的生理鹽水進行重懸后，分別加入阿霉素，使阿霉素終濃度為200 μ g/ml阿霉素，然后在室溫孵育2小時，之后以14000g的離心力離心1小時，獲得微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)，作為實驗組；將來自第二組H22小鼠肝癌細胞和第二組 A2780人卵巢癌細胞獲得的細胞囊泡(沒有包裹化療藥)不做處理，作為對照組。3、實驗結(jié)果將來自上述實驗組的微顆粒和對照組的細胞囊泡使用0.9% (g/ml)的生理鹽水重懸后，分別涂片后在雙光子熒光顯微鏡下觀察，從圖2A-圖2D可以看出，作為對照組，來自沒有施用阿霉素的第二組H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡沒有觀察到紅色(見圖2A)，沒有施用阿霉素的第二組A2780人卵巢癌細胞的細胞囊泡，涂片后也沒有觀察到紅色(見圖 2C)；作為實驗組，來自施用阿霉素的第一組H22小鼠肝癌細胞的微顆粒，涂片后觀察到紅色的微顆粒(見圖2B)，來自施用阿霉素的第一組A2780人卵巢癌細胞的微顆粒，涂片后觀察到紅色的微顆粒(見圖2D)，證實腫瘤細胞經(jīng)紫外線處理后，釋放了細胞囊泡，大小在 Iy m左右，并且與化療藥孵育后，該細胞囊泡包裹了化療藥(可參考實施例1中的相關(guān)說明)，成為圖中顯示的微顆粒。實施例3 紫外線誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞系產(chǎn)生的細胞囊泡可被小鼠肝癌細胞攝取1、實驗材料和試劑使用的H22小鼠肝癌細胞以及紫外線裝置同實施例1，羧基熒光素琥珀酰亞胺酯 (CFSE)(綠色熒光染料，可商購獲得)，PKH26 (紅色熒光染料，可商購獲得)。2、實驗步驟1)培養(yǎng)2X107個的H22小鼠肝癌細胞，培養(yǎng)方法同實施例1，將上述培養(yǎng)好的H22 小鼠肝癌細胞分為相同量的兩組。2)對第一組細胞，采用綠色熒光染料CFSE按常規(guī)方法進行標記。對第二組細胞，采用紅色熒光染料ΡΚ 6按常規(guī)方法進行標記，標記后的H22小鼠肝癌細胞顯示紅色熒光(見圖3B)。
3)第1天，對上述標記好綠色熒光染料的第一組細胞使用紫外線照射30分鐘。4)在紫外線照射后的48小時，第一組H22小鼠肝癌細胞出現(xiàn)明顯變小、暗淡狀態(tài)， 對小鼠肝癌細胞的培養(yǎng)液的上清進行逐步離心，方法同實施例1，得到來自小鼠肝癌細胞的細胞囊泡，該細胞囊泡顯示綠色熒光(見圖3A)。5)將上述分離到的來自第一組H22小鼠肝癌細胞的綠色熒光細胞囊泡和第二組紅色熒光H22小鼠肝癌細胞進行孵育。3、實驗結(jié)果將綠色熒光細胞囊泡和紅色熒光H22小鼠肝癌細胞孵育4小時后，清洗小鼠肝癌細胞3次，對小鼠肝癌細胞進行涂片，然后在熒光顯微鏡下觀察，可見綠色熒光細胞囊泡進入紅色熒光小鼠肝癌細胞(見圖3C)，且紅色熒光和綠色熒光重疊顯示黃色(見圖3D)，表明細胞囊泡能夠被腫瘤細胞攝取。實施例4 化療藥誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞系產(chǎn)生的微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成) 被小鼠肝癌細胞攝取后對小鼠肝癌細胞具有顯著的殺傷作用1、實驗材料和試劑使用的H22小鼠肝癌細胞以及A2780人卵巢癌細胞同實施例1，化療藥甲氨蝶呤、 順鉬均可商購獲得。2、實驗步驟1)培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞，使細胞量分別達到3 X IO7個，培養(yǎng)方法同實施例1，將得到的H22小鼠肝癌細胞培養(yǎng)液分為三組，每組包括1/3數(shù)量的H22 小鼠肝癌細胞，同樣將A2780人卵巢癌細胞培養(yǎng)液分為三組，每組包括1/3數(shù)量的A2780人卵巢癌細胞。2)第1天，從第一組H22小鼠肝癌細胞中，取Iml 5X106H22小鼠肝癌細胞施用 IOyg化療藥甲氨蝶呤；同時從第一組H22小鼠肝癌細胞中取Iml 5X 106A2780人卵巢癌細胞施用100 μ g化療藥順鉬；從第二組H22小鼠肝癌細胞中取Iml 5 X 106H22小鼠肝癌細胞，使用紫外線照射 30分鐘；同時從第二組H22小鼠肝癌中取Iml 5X106A2780人卵巢癌細胞使用紫外線照射 30分鐘；對第三組H22小鼠肝癌細胞和第三組A2780人卵巢癌細胞，不進行任何處理。3)在施用化療藥后的48小時，按照實施例1的方法收集來自第一組H22小鼠肝癌細胞和第一組A2780人卵巢癌細胞的微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)，作為實驗組；在紫外線照射后的48小時，按照實施例2的方法收集來自第二組H22小鼠肝癌細胞和第二組 A2780人卵巢癌細胞的細胞囊泡(沒有包裹有化療藥)，作為對照組。4)從上述實驗組取一半量的微顆粒，并從對照組取一半量的細胞囊泡分別與從第三組細胞的各腫瘤細胞中取出的5X IO4腫瘤細胞在24-孔板中共同培養(yǎng)72小時，觀察腫瘤細胞的死亡，其中與腫瘤細胞共同培養(yǎng)的細胞囊泡應(yīng)為從同種類型腫瘤細胞獲得的細胞囊泡，與腫瘤細胞共同培養(yǎng)的微顆粒應(yīng)為從同種類型腫瘤細胞獲得的細胞囊泡包裹化療藥后形成的微顆粒；同時還從第三組H22小鼠肝癌細胞和第三組A2780人卵巢癌細胞中取出5X IO6個 H22小鼠肝癌細胞施用單純的化療藥甲氨蝶呤10 μ g，同時取出5X106fA2780人卵巢癌細胞施用單純的化療藥順鉬100 μ g，觀察腫瘤細胞的死亡，施用72小時后，觀察腫瘤細胞的死亡。3、實驗結(jié)果結(jié)果顯示，不含化療藥的對照組細胞囊泡不能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡(見圖4A和圖 4D)；單純的化療藥甲氨蝶呤、順鉬分別殺傷了 H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞，但仍有一定量的腫瘤細胞存活(見圖4B和圖4E)；而含化療藥的微顆粒則能夠使幾乎全部的腫瘤細胞死亡(見圖4C和圖4F)，證實本發(fā)明以細胞囊泡包裹化療藥形成的微顆粒為主要成分的腫瘤化療藥制劑在施用到腫瘤細胞后，大大提高了作為有效成分的化療藥的施用效果。
實施例5 包裹化療藥的微顆粒體殺傷腫瘤細胞后，被殺傷的腫瘤細胞可進一步產(chǎn)生包裹化療藥的微顆粒對剩余腫瘤細胞進行殺傷1、實驗材料和試劑使用的H22小鼠肝癌細胞以及A2780人卵巢癌細胞同實施例1，化療藥甲氨蝶呤、 順鉬均可商購獲得。2、實驗步驟1)培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞，使細胞量分別達到3 X IO8個， 培養(yǎng)方法同實施例1，將上述培養(yǎng)好的H22小鼠肝癌細胞培養(yǎng)液分為三組，每組包括1/3數(shù)量的H22小鼠肝癌細胞，同樣將A2780人卵巢癌細胞培養(yǎng)液分為三組，每組包括1/3數(shù)量的 A2780人卵巢癌細胞。2)第1天，從第一組H22小鼠肝癌細胞中，取IOml的5 X 107H22小鼠肝癌細胞施用IOOyg化療藥甲氨蝶呤；同時從第一組H22小鼠肝癌細胞中取IOml的5X10TA2780人卵巢癌細胞施用1000 μ g化療藥順鉬；從第二組H22小鼠肝癌細胞中取IOml的5X l(fH22小鼠肝癌細胞，使用紫外線照射30分鐘；同時從第二組H22小鼠肝癌中取IOml的5X 10TA2780人卵巢癌細胞使用紫外線照射30分鐘；對第三組H22小鼠肝癌細胞和第三組A2780人卵巢癌細胞，不進行任何處理。3)在施用化療藥后的48小時，按照實施例1的方法收集來自第一組H22小鼠肝癌細胞和第一組A2780人卵巢癌細胞的微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)，作為實驗組；在紫外線照射后的48小時，按照實施例2的方法收集來自第二組H22小鼠肝癌細胞和第二組 A2780人卵巢癌細胞的細胞囊泡(沒有包裹有化療藥)，作為對照組。4)將上述實驗組的微顆粒和對照組的細胞囊泡分別與從第三組H22小鼠肝癌細胞和第三組A2780人卵巢癌細胞的各腫瘤細胞中取出的第一批5 X IO6個H22小鼠肝癌細胞和5 X IO6個A2780人卵巢癌細胞腫瘤細胞在6-孔板中在DMEM細胞培養(yǎng)液共培養(yǎng)12小時， 更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，從培養(yǎng)液中分離新的實驗組微顆粒和新的對照組細胞囊泡，將所分離的新的實驗組微顆粒和新的對照組細胞囊泡分別與從第三組H22小鼠肝癌細胞和第三組A2780人卵巢癌細胞中再次取出的5X104fH22小鼠肝癌細胞和5 X IO4 個A2780人卵巢癌細胞在24-孔板中共同培養(yǎng)，采用PI染料分別對24-孔板培養(yǎng)好的施用實驗組微顆粒和對照組細胞囊泡的第二批腫瘤細胞進行染色，然后通過流式細胞儀觀察第二次取出的腫瘤細胞的死亡狀況，結(jié)果如圖5所示。
3、實驗結(jié)果由圖5可以看出，對第二次取出的腫瘤細胞施用新的實驗組微顆粒，對該腫瘤細胞仍具有高達90%的殺傷能力，而施用新的對照組細胞囊泡，對該腫瘤細胞基本沒有殺傷能力，表明被實驗組微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)殺傷的第一批腫瘤細胞可進一步產(chǎn)生新的包裹化療藥的實驗組微顆粒，并對第二次取出的腫瘤細胞進一步殺傷；沒有包裹化療藥的對照組細胞囊泡，則不具有上述功能。本發(fā)明的腫瘤化療藥制劑具有對腫瘤細胞的連續(xù)殺傷能力，針對所要獲得的腫瘤細胞的殺傷效果，以及不同類型的腫瘤細胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明描述的方法對化療藥的施用量進行適當?shù)倪x擇。實施例6 包裹化療藥的微顆粒對機體的毒副作用實驗1、實驗材料和試劑使用的H22小鼠肝癌細胞以及A2780人卵巢癌細胞同實施例1，化療藥甲氨蝶呤、 順鉬均可商購獲得，16只BALB/c小鼠和16只SCID (嚴重聯(lián)合免疫缺陷)小鼠購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心。2、實驗步驟1)培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞，使細胞量分別達到2X107，培養(yǎng)方法同實施例1。2)從上述培養(yǎng)的細胞中取Iml的5X l(fH22小鼠肝癌細胞培養(yǎng)液施用100 PgK 療藥甲氨蝶呤，取Iml的5X106A2780人卵巢癌細胞培養(yǎng)液施用ΙΟΟΟμ g化療藥順鉬。3)在施用化療藥后的48小時，按照實施例1的方法收集來自H22小鼠肝癌細胞和 A2780人卵巢癌細胞的微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)，將從Iml上清中所制備微顆粒定為1只小鼠的用量。4)將所制備的包裹化療藥(甲氨蝶呤)的H22小鼠肝癌細胞的微顆粒分別經(jīng)尾靜脈注射8只小鼠BALB/c小鼠，作為實驗組1，將所制備的包裹化療藥(順鉬)的A2780人卵巢癌細胞的微顆粒分別經(jīng)尾靜脈注射8只小鼠SCID小鼠，作為實驗組2 ；同時對另外8只小鼠BALB/c小鼠和8只小鼠SCID小鼠注射0. 9% (g/ml)的生理鹽水，分別作為對照組1， 對照組2 ；同樣的操作和給藥量，實驗組每天注射包裹化療藥的微顆粒一次，連續(xù)14天，對照組每天注射0.9% (g/ml)的生理鹽水一次，連續(xù)14天。5)第15天，分別對實驗組1，實驗組2和對照組1，對照組2小鼠取靜脈血，檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肌酐含量，并稱量小鼠體重。3、實驗結(jié)果由圖6A-圖6C可以看出，相比于注射生理鹽水的對照組小鼠，注射包裹化療藥 (甲氨蝶呤或順鉬)的微顆粒的實驗組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肌酐含量沒有明顯變化(見圖 6A和圖6B)，體重也無變化(見圖6C)?？梢姡瑢⒓毎遗葑鳛榘邢蛩幬镙d體包裹化療藥得到的腫瘤化療藥物制劑對機體基本沒有毒副作用。實施例7 包裹化療藥的微顆粒抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的存活時間1、實驗材料和試劑使用的H22小鼠肝癌細胞以及A2780人卵巢癌細胞同實施例1，化療藥甲氨蝶呤、 順鉬均可商購獲得，BALB/c小鼠，SCID小鼠。2、實驗步驟
1)培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞，使細胞量分別達到3 X IO7個， 培養(yǎng)方法同實施例1。2)從上述培養(yǎng)的細胞中取Iml的5Xl(fH22小鼠肝癌細胞(帶培養(yǎng)液)施用 IOOyg化療藥甲氨蝶呤，以及取Iml的5X 106A2780人卵巢癌細胞(帶培養(yǎng)液)施用 1000 μ g化療藥順鉬；在施用化療藥后的48小時，按照實施例1的方法收集來自H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞的微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)，將從Iml上清中所制備的所述微顆粒的量定為1只小鼠的用量。再從上述培養(yǎng)的細胞中取Iml的5Xl(fH22小鼠肝癌細胞(帶培養(yǎng)液)和 5X106A2780人卵巢癌細胞(帶培養(yǎng)液)給予紫外線照射48小時后，按照實施例2的方法分別收集H22小鼠肝癌細胞和A2780人卵巢癌細胞的細胞囊泡(沒有包裹有化療藥)，其量定為1只小鼠的用量。3)第1天，從上述培養(yǎng)的細胞中取1 X 105H22小鼠肝癌細胞腹腔接種到BALB/c小鼠，共注射小鼠32只，獲得患H22肝癌細胞腹水癌的BALB/c小鼠，隨機分為等數(shù)量的兩組； 從上述培養(yǎng)的細胞中取1X106A2780人卵巢癌細胞細胞腹腔接種嚴重聯(lián)合免疫缺陷SCID 小鼠，共注射小鼠32只，獲得患卵巢癌的SCID小鼠，也隨機分為等數(shù)量的兩組。4)第2天開始，將步驟2)制備得到的來自H22小鼠肝癌細胞的微顆粒按照確定劑量腹腔注射步驟幻獲得的患肝癌的第一組BALB/c小鼠，每天一次，連續(xù)7天，第8天起正常飼養(yǎng)，作為實驗組；對第二組患肝癌的BALB/c小鼠注射由步驟2)制備得到的細胞囊泡， 每天一次，連續(xù)7天，第8天起正常飼養(yǎng)，作為對照組；同樣的，從第2天開始，將步驟2、所制備得到的來自A2780人卵巢癌細胞的微顆粒劑按照確定劑量腹腔注射步驟幻獲得的患卵巢癌的第一組SCID小鼠，每天一次，連續(xù)7 天，第8天起正常飼養(yǎng)，作為實驗組；對第二組小鼠患卵巢癌的SCID小鼠注射由步驟2)制備得到的細胞囊泡，每天一次，連續(xù)7天，第8天起正常飼養(yǎng)，作為對照組。3、實驗結(jié)果將實驗組和對照組中的BALB/c小鼠都分為等數(shù)量的兩組，實驗組中第一組BALB/ c小鼠和對照組中第一組BALB/c小鼠分別于第10天處死，測量腹水體積(圖7A)，實驗組中第二組BALB/c小鼠和對照組中第二組BALB/c小鼠分別用于觀察存活時間(圖7B)；將實驗組和對照組中的SCID小鼠都分為等數(shù)量的兩組，實驗組中第一組SCID小鼠和對照組中第一組SCID小鼠分別于第30天處死，計算腹腔瘤結(jié)節(jié)形成數(shù)目(圖7C)，實驗組中的第二組SCID小鼠和對照組中第二組SCID小鼠分別用于觀察存活時間(圖7D)。結(jié)果表明，相比于對照組，實驗組中H22小鼠肝癌細胞來源的包裹甲氨蝶呤的微顆粒顯著抑制BALB/c小鼠的H22肝癌細胞的生長，并延長BALB/c小鼠的存活時間；同樣地，A2780人卵巢癌細胞細胞來源的包裹順鉬的微顆粒顯著抑制SCID小鼠的A2780卵巢癌細胞的生長，并延長SCID小鼠的存活時間。實施例8 本發(fā)明的方案對更多腫瘤細胞的應(yīng)用1、實驗材料和試劑不同腫瘤細胞系包括人乳腺癌細胞系MCF-7、人肺癌細胞系A(chǔ)549、人胃癌細胞系 SNU1、人結(jié)腸癌Caco2、人肝癌細胞系H印G2、人膀胱癌細胞系T24、人白血病細胞系K562、人膠質(zhì)瘤細胞系U251 ；
化療藥甲氨蝶呤可商購獲得。2、實驗步驟1)在DMEM培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)上述腫瘤細胞系，使細胞量分別達到2X IO8個，將培養(yǎng)好的上述各腫瘤細胞系分為兩組。2)對第一組，將100 μ g化療藥甲氨蝶呤分別加入到IOml的5X IO7上述培養(yǎng)好的各腫瘤細胞培養(yǎng)液中獲得源自各腫瘤細胞的含有甲氨蝶呤的微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)；對第二組，使用紫外線照射IOml的5 X IO7的各腫瘤細胞30分鐘，獲得源自各腫瘤細胞的不含甲氨蝶呤的細胞囊泡。3)在施用化療藥后的48小時，按照實施例1的方法收集來自第一組的各腫瘤細胞系的微顆粒，作為實驗組；按照實施例2的方法收集來自第二組的各腫瘤細胞系的細胞囊泡，作為對照組。4)取制備好的實驗組一半量的微顆粒和對照組一半量的細胞囊泡分別與5X IO6 相對應(yīng)的腫瘤細胞在6-孔板中共培養(yǎng)72小時后，采用PI染料分別對施用實驗組微顆粒和對照組細胞囊泡的腫瘤細胞進行染色，染色方法同實施例5，然后通過流式細胞儀觀察各腫瘤細胞的死亡狀況，結(jié)果如圖8所示。3、實驗結(jié)果由圖8可以看出，各腫瘤細胞來源的包裹化療藥的微顆粒針對其來源的腫瘤細胞系均具有90%左右的殺傷率，說明本發(fā)明提供的腫瘤化療藥制劑及其制備方法適用于多種腫瘤細胞，并且均可獲得良好的化療效果。實施例9 包裹化療藥的微顆粒體經(jīng)血液可靶向到實體腫瘤1、實驗材料和試劑使用的H22小鼠肝癌細胞同實施例1，化療藥阿霉素以及BALB/c小鼠均可商購獲得。2、實驗步驟 1)培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞，使細胞量達到3 X IO7,將上述H22小鼠肝癌細胞培養(yǎng)液分為兩組，每組包括一半數(shù)量的H22小鼠肝癌細胞；同樣將A2780人卵巢癌細胞培養(yǎng)液分為兩組，每組包括一半數(shù)量的A2780人卵巢癌細胞。2)對從第一組H22小鼠肝癌細胞(帶細胞培養(yǎng)液)取出的Iml的1 X 107H22小鼠肝癌細胞培養(yǎng)液施用300 μ g化療藥阿霉素；在施用化療藥后的48小時，按照實施例1的方法收集來自H22小鼠肝癌細胞的微顆粒(細胞囊泡包裹化療藥形成)，將從Iml上清中所制備的所述微顆粒的量定為1只小鼠的用量；對從第二組H22小鼠肝癌細胞(帶細胞培養(yǎng)液)取出的Iml的1 X 107H22小鼠肝癌細胞給予紫外線照射后的48小時，按照實施例2的方法收集H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡(沒有包裹有化療藥)，作為對照組，其量定為1只小鼠的用量。3)第1天，分別將2Χ1(^Η22小鼠肝癌細胞皮下接種到BALB/c小鼠，共注射小鼠 12只，獲得患皮下肝癌的BALB/c小鼠，隨機分為二組。4)第15天開始，將步驟幻制備得到的來自第一組H22小鼠肝癌細胞的微顆粒按照確定劑量尾靜脈注射步驟3)獲得的患肝癌的第一組BALB/c小鼠，作為實驗組；用步驟 2)制備得到的來自第二組H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡注射第二組患肝癌的BALB/c小鼠，作為對照組；6小時后，取腫瘤組織進行冰凍切片，熒光顯微鏡觀察。3、實驗結(jié)果由圖9A-圖9B可以看出，來自第一組H22小鼠肝癌細胞的包裹阿霉素的微顆粒經(jīng)血流被靶向到腫瘤組織，顯示出紅光(如圖9B所示)，而注射來自第二組H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡后的腫瘤組織未見熒光(如圖9A所示)，說明本發(fā)明提供的包裹化療藥物的微顆?？梢宰鳛榘邢蛩幎x擇性定位殺傷腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤化療藥物制劑，包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和被包裹在所述細胞囊泡內(nèi)作為有效成分的化療藥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤化療藥物制劑，其中，該藥物制劑中所包含的化療藥為含有治療提供所述細胞囊泡的腫瘤的有效成分的化療藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤化療藥物制劑，所述腫瘤化療藥物制劑包括注射制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤化療藥物制劑，其中，所述化療藥包括治療卵巢癌、 乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、白血病或膠質(zhì)瘤的化療藥中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤化療藥物制劑，其中，由所述細胞囊泡包裹所述化療藥所形成的腫瘤化療藥物制劑的粒度為100 1000納米。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述的腫瘤化療藥物制劑的制備方法，包括對腫瘤細胞施用作為有效成分的化療藥使之凋亡，收集凋亡腫瘤細胞所釋放的微顆粒，該微顆粒即為細胞囊泡包裹化療藥后形成的所述藥物制劑；或者使用紫外線照射腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡， 收集凋亡腫瘤細胞所釋放的細胞囊泡，然后將所述細胞囊泡與作為有效成分的化療藥進行孵育，使化療藥被細胞囊泡包裹，然后收集微顆粒，該微顆粒即為細胞囊泡包裹化療藥后形成的所述藥物制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤化療藥物制劑的制備方法，其中，在使腫瘤細胞凋亡之前還包括對腫瘤細胞進行培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的腫瘤化療藥物制劑的制備方法，所述腫瘤細胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、白血病和/或膠質(zhì)瘤的細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤化療藥物制劑的制備方法，其中，收集細胞囊泡的方法為通過離心機，以100-100000g的離心力，收集細胞囊泡。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤化療藥物制劑的制備方法，其中，收集微顆粒的方法通過離心機，以100-100000g的離心力，收集細胞囊泡。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腫瘤化療藥物制劑及其制備方法，所述腫瘤化療藥物制劑包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和被包裹在所述細胞囊泡內(nèi)作為有效成分的化療藥。該藥物制劑中所包含的化療藥為含有治療提供所述細胞囊泡的腫瘤的有效成分的化療藥。本發(fā)明還提供了所述腫瘤化療藥物制劑的制備方法。本發(fā)明提供的技術(shù)方案可使化療藥選擇性地在腫瘤部位釋放，使化療藥持續(xù)發(fā)揮藥效，提高化療藥對腫瘤細胞的殺傷效果，并降低化療藥對正常細胞的毒副作用。
文檔編號A61P35/02GK102302784SQ201110241369
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者黃波 申請人:湖北盛齊安生物科技有限公司, 黃波