專利名稱：：可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可轉(zhuǎn)形穴位注射藥及其制備方法。
背景技術(shù)：
：殼聚糖基溫敏凝膠是2000年后才被提出的一種新型的可注射型水凝膠，具有良好的生物相容性，生物可降解性，且降解產(chǎn)物(寡聚糖和單糖)無毒性[1_3]。目前，殼聚糖基溫敏凝膠廣泛應(yīng)用于組織工程修復(fù)和藥物釋放載體的研究中。常用殼聚糖水凝膠包載一些比較敏感的蛋白類藥物如胰島素，或者生物半衰期比較短，口服不穩(wěn)定，以及全身毒副作用比較大的藥物[4_5]，從凝膠的內(nèi)部作用力分析，該凝膠主要受靜電和疏水作用力影響，不存在較強(qiáng)的共價作用力和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此藥物釋放初期，主要是通過擴(kuò)散作用而釋放，后期則是連接通過水凝膠的溶蝕作用而被緩慢釋放出來。如溫敏凝膠在抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用Μ，將腫瘤藥物包裹于溫敏水凝膠內(nèi)后以液體形式注射到體內(nèi)，溫敏水凝膠在體內(nèi)溫度下發(fā)生相變形成固態(tài)凝膠可以起到藥物儲庫的作用使藥物緩慢釋放，這就避免了患者頻繁的用藥，提高了患者的順應(yīng)性；眼部用藥，溫敏水凝膠可以以液體方式滴入眼內(nèi)，劑量準(zhǔn)確，給藥方便。在眼內(nèi)形成凝膠，可以延長藥物滯留時間，大大提高藥物利用度，因此可以降低藥物不良反應(yīng)，減少給藥次數(shù)，提高患者順應(yīng)性；牙周局部用藥，因殼聚糖本身具有抗酸、抗感染等作用，再將牙周用藥包裹在該水凝膠內(nèi)，殺菌、抑菌，具有作為牙周局部用藥的潛力。CS是胞外基質(zhì)類似物，CS水凝膠具有三維多孔結(jié)構(gòu)，它具有生物相容性好、成膠時間及體內(nèi)降解時間可調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，在軟骨組織工程等領(lǐng)域已經(jīng)得到應(yīng)用[7_8]，組織工程采用可注射原位形成水凝膠.與預(yù)成型支架相比具有特定的優(yōu)勢能填充任意形狀的缺損，并在很大程度上降低植入對機(jī)體組織的侵入性，且能與各種治療藥物混合。可注射性水凝膠材料是攜帶細(xì)胞的載體，具有攜帶細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞體內(nèi)移植區(qū)滯留及增殖與分化的作用。如將該凝膠與軟骨細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程化軟骨，用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。溫敏水凝膠，即溫度敏感型水凝膠，該凝膠的形成過程不涉及化學(xué)反應(yīng)，分子鏈間的交聯(lián)通過分子間相互作用力(范德華力、疏水相互作用、氫鍵等)形成。在此可注射水凝膠在水中經(jīng)過簡單的相轉(zhuǎn)變，不需要任何化學(xué)反應(yīng)，因而在體內(nèi)應(yīng)用時會更簡單、更安全。從凝膠的材料來看，能夠發(fā)生溶膠凝膠轉(zhuǎn)變的天然聚合物體系很多，如動物膠、聚多糖等，天然大分子中，殼聚糖是有相當(dāng)應(yīng)用前景的的生物材料，Chenitet3]等首次報道了用殼聚糖和多羥基磷酸鹽的水溶液作為溶膠體系。均聚和共聚的異丙基丙烯酰胺與聚氧化乙-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物是典型的溫敏水凝膠，但它們不能生物降解，這就限制了其應(yīng)用。從交聯(lián)劑來看，有用戊二醛或者聚乙烯醇作為物理交聯(lián)劑的，但因為戊二醛的毒性作用和聚乙烯醇的的過敏反應(yīng)，其應(yīng)用也受到限制。對水凝膠的分類、制備等目前已有研究[9]，溫敏水凝膠體系在從溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z的過程中，影響因素較多，主要是溫度、PH值等[10]。參考文獻(xiàn)[I]蔣挺大.殼聚糖[Μ].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2001。[2]RueIE，CheniteA，ChaputC，etal.Characterizationofthermosensitivechitosangelsforthesustaineddeliveryofdrugs[J].IntJPharmj2000，203(8):89-98。[3]CheniteA，ChaputCjWangD，etal.Novelinjectableneutralsolutionsofchitosanformbiodegradablegelsinsitu[J].Biomaterials,2000,21(21):2155-2161。[4]Ruel-Garie!pyE，etal.Thermosensitivechitosan-basedhy-drogelforthelocaldeliveryofpaditaxe.IEurJPharmBiop—harm，2004，57:53—63。[5]WuJ，SuZGjMaGH.Athermo-andpH-sensitivehydrogelcomposedofquaternizedchitosan/glycerophosphate.IntJPharm，2006，315:1-11。[6]YULjCHANGGT，ZHANGH，etal.Injectableblockcopoly-merhydrogelsforsustainedreleaseofaPEGylateddrug[J]·IntJPharm，2008，348(1-2):95-106。[7]YeoY，etal.Photocrosslinkablehydrogelformyocytecellcultureandinjection.JbiomedMaterRes.PartBj2007，81:312-322.[8]XuB，etal.DevelopmentofChitosanHydrogelandtheEffectofC2C12AdhesionandSupport.JBiomedEngRes,2008，27:121-124。[9]魏宏亮，王連才，張愛英，等.可注射水凝膠的制備與應(yīng)用.化學(xué)進(jìn)展，2004，16(6):1008-1015。[10]張雪雁，顧其勝.殼聚糖溫敏凝膠的制備及其影響因素.2006年上海市醫(yī)用生物材料研討會9-16。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥及其制備方法，為穴位注入藥治療疾病提供一種療效較好的新劑型藥，其操作簡單易行。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所釆取的技術(shù)方案是可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，其特征在于它由川芎嗪、殼聚糖醋酸溶液和磷酸氫二鉀溶液混合而成；各原料的配比為川芎嗪殼聚糖醋酸溶液磷酸氫二鉀溶液=2毫克ImLlmL。殼聚糖醋酸溶液的濃度為2wt%_2.5wt%(質(zhì)量)。磷酸氫二鉀溶液的濃度為14wt%-15wt%(質(zhì)量)。殼聚糖醋酸溶液的濃度為2.3wt%(質(zhì)量)。磷酸氫二鉀溶液的濃度為14.75wt%(質(zhì)量)O上述可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥的制備方法，其特征在于它包括如下步驟I)將殼聚糖溶于0.IM的醋酸溶液中，配制成濃度為2wt%_2.5wt%(質(zhì)量)的殼聚糖醋酸溶液(用磁力攪拌器攪拌約I小時，使之充分溶解于醋酸中)；2)用去離子水配制濃度為14wt%_15wt%(質(zhì)量)的磷酸氫二鉀溶液；3)上述殼聚糖醋酸溶液、磷酸氫二鉀溶液分別于4°C冰箱保存約0.5小時；4)按各原料的配比為川芎嗪殼聚糖醋酸溶液磷酸氫二鉀溶液=2毫克ImL:lmL，選取川芎嗪、殼聚糖醋酸溶液和磷酸氫二鉀溶液混合，得到可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥。隨著穴位埋線在臨床上的廣泛應(yīng)用，對埋線技術(shù)的要求也應(yīng)當(dāng)有所提高和革新，然而線體的改變可以很大程度上決定埋線的操作方法和技術(shù)，研制一種可以用簡單穴位注射的方法，將溫敏水凝膠川芎嗪藥埋植入穴位，其操作簡單易掌握，不僅可緩慢將藥物導(dǎo)入病變組織，藥物利用率高，且同時降低治療頻率，病人的依從性大大提高，由于綜合了針刺、留針、穴位注射藥物等多種治療方法，其臨床治療效果將有望提高。為穴位注入藥治療疾病提供一種療效較好、依從性高的新劑型藥?？赊D(zhuǎn)形穴位注射藥，因其在常溫(低于37度)為液體，在體溫環(huán)境或者高于37度為凝膠狀，可以用簡單的穴位注射的方法埋植于穴位而得名，其基礎(chǔ)是殼聚糖基溫敏凝膠，在此基礎(chǔ)上加入一定川芎嗪，埋植于穴位起到針?biāo)幗Y(jié)合、類似于埋線治療的效果。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明為穴位植入藥，而作用類似于穴位埋線，為穴位注入藥治療疾病提供一種療效較好、依從性高的新劑型藥，其操作簡單易行。圖I是本發(fā)明可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)MMP-9的影響圖(MMP-9X200);圖I中a-模型組，b_可轉(zhuǎn)形穴位注射藥線組，c_川芎嗪膠原藥線組，d-川芎嗪藥物羊腸線組。圖2是本發(fā)明可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)TIMP-I的影響圖(ΜΡ-1Χ200);圖2中a_模型組，b_可轉(zhuǎn)形穴位注射藥線組，c_川芎嗪膠原藥線組，d-川芎嗪藥物羊腸線組。具體實施例方式實施例I可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥的制備方法，它包括如下步驟I)將殼聚糖溶于O.IM的醋酸溶液中，配制成濃度為2.3wt%(質(zhì)量)的殼聚糖醋酸溶液(用磁力攪拌器攪拌約I小時，使之充分溶解于醋酸中)；2)用去離子水配制濃度為14.75wt%(質(zhì)量)的磷酸氫二鉀溶液；3)上述殼聚糖醋酸溶液、磷酸氫二鉀溶液分別于4°C冰箱保存約O.5小時；4)按各原料的配比為川芎嗪殼聚糖醋酸溶液磷酸氫二鉀溶液=2毫克ImL:lmL，選取川芎嗪、殼聚糖醋酸溶液和磷酸氫二鉀溶液混合，得到可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥(溶膠)。應(yīng)用該可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，目前被應(yīng)用于科研實驗研究中，觀察其對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)MMP-9、TIMP-I的影響。ΜΜΡ-9、ΜΡ_1實驗的過程及條件I、所有動物隨機(jī)分為4組，處理方法如下模型對照組10只，造模成功后，正常進(jìn)食及飲水，不給予任何治療，在觀察日24小時后取材。可轉(zhuǎn)形川芎嗪藥組(可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥組)10只，造模成功后，大鼠清醒活動O.5h后行穴位埋藥線治療。注射劑量為O.3ml和O.6ml(依據(jù)川芎嗪膠原藥線組同等藥物含量)，定準(zhǔn)穴位，用5ml注射器，斜刺內(nèi)關(guān)7mm深、直刺大椎13mm深，回抽無回血后，分別緩慢推入藥液O.3ml和O.6ml，邊退邊注入，使其在體內(nèi)形成半固體凝膠線狀，埋線處常規(guī)消毒。在觀察日24小時后取材。川芎嗪膠原藥線組10只，埋線治療時間和條件同上組，埋藥線方法自制藥線長約6mm和12mm，其中藥物含量約O.6mg和I.2mg(依據(jù)《實驗針灸學(xué)》[18]實驗動物與人用藥量的換算方法計算)。大鼠大椎、內(nèi)關(guān)穴備皮、常規(guī)消毒，藥線及埋線針具經(jīng)紫外照射消毒后，將6mm和12mm藥線分別裝入注射針頭，斜刺內(nèi)關(guān)7mm深，直刺大椎13mm深，輕推針灸針針柄將藥線埋入，然后將注射針頭緩慢退出，埋線處常規(guī)消毒。在觀察日24小時后取材。川芎嗪藥物羊腸線組10只，埋藥線方法同川芎嗪膠原藥線組。2、免疫組化法檢測大鼠腦皮質(zhì)區(qū)MMP-9和TIMP-I的表達(dá)在大鼠腦缺血O.5h再灌注7天，最后觀察日24小時后，用10%水合氯醛深度麻醉動物后開胸暴露心臟，剪開右心耳，經(jīng)左心室、升主動脈插入灌胃針并用動脈夾固定，經(jīng)灌胃針入口連接醫(yī)用輸液器快速沖洗生理鹽水約250mL，隨后用4%多聚甲醛(4°C，pH7.4)先快后慢灌注約80-100mL，斷頭取腦后，在4%多聚甲醛中固定6-8h，取視交叉后1-4_腦塊進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，片厚約4μm0MMP-9或ΜΡ-1免疫組化檢測的實驗步驟如下①石蠟切片從烤箱中拿出，用PBS(ΡΗ7.4)沖洗3次，每次3分鐘。②配置溶液(30%Η2021份+蒸餾水10份)混勻后將切片放入，室溫10分鐘以滅活內(nèi)源性酶，PBS液洗3次，每次3分鐘。③根據(jù)兩種抗體的要求，對組織抗原進(jìn)行修復(fù)，微波3檔15-20分鐘④滴加5%BSA封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體，不洗⑤滴加MMP-9(1:200稀釋)或TIMP-I(1:200稀釋)的第一抗體，每張切片滴入約50μI的稀釋液覆蓋到組織，4°C過夜。⑥次日37°C復(fù)溫45min，PBS(ρΗ7·4)洗3次，每次2分鐘。⑦滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37°C孵育20分鐘，PBS(pH7.4)洗3次，每次2分鐘。⑧滴加試劑SABC，37°C孵育20分鐘，PBS(pH7.4)洗4次，每次5分鐘。⑨每張切片滴入50-100μI新鮮配制的DAB溶液，室溫顯色，顯微鏡下觀察，蒸餾水洗漆。⑩蘇木素復(fù)染后，經(jīng)過梯度酒精(70-100%、無水酒精)脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。3、圖像分析圖象分析采用HPIAS2000型圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行，所有切片均用同一光強(qiáng)度，同一放大倍數(shù)(200倍)，觀察陽性細(xì)胞表達(dá)的多少(鏡下觀察見胞核或胞漿染成棕黃色或棕褐色為陽性)，并且每個標(biāo)本取3張連續(xù)切片觀察皮質(zhì)區(qū)相同面積，分析ΜΜΡ-9和ΜΡ-1光密度值。4、統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS17.O軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，組間比較均采用t檢驗，將P<O.05設(shè)為有顯著差異。實驗結(jié)果如圖I、圖2所示用免疫組化法檢測MMP-9和ΜΡ-1的表達(dá)顯示MMP-9.TIMP-1陽性細(xì)胞見胞核或胞漿呈黃褐色。模型組MMP-9陽性細(xì)胞明顯增多，可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥組可明顯下調(diào)MMP-9表達(dá)?？赊D(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥組、川芎嗪膠原藥線組和川芎嗪藥物羊腸線組同時與模型組比較，有顯著性差異(P<O.05);而可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥組(穴位注射可轉(zhuǎn)形川芎嗪藥組)的療效明顯優(yōu)于川芎嗪藥物羊腸線組和川芎嗪膠原藥線組(P<O.05);川芎嗪膠原藥線組與川芎嗪藥物羊腸線組比較無顯著性差異(P>O.05)。模型組和三個治療組均有ΜΡ-1表達(dá)，可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥組(穴位注射可轉(zhuǎn)形川芎嗪藥組)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與川芎嗪膠原藥線組、川芎嗪藥物羊腸線組比較有顯著性差異(P<O.05)，川芎嗪膠原藥線組與川芎嗪藥物羊腸線組比較無顯著性差異(P>·0.05)。見表I。表I各組大鼠皮質(zhì)ΜΜΡ-9、ΜΡ-1平均光密度值比較(％，土S)權(quán)利要求1.可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，其特征在于它由川芎嗪、殼聚糖醋酸溶液和磷酸氫二鉀溶液混合而成；各原料的配比為川芎嗪殼聚糖醋酸溶液磷酸氫二鉀溶液=2毫克ImL:ImL02.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，其特征在于，殼聚糖醋酸溶液的濃度為2wt%_2.5wt%。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，其特征在于，磷酸氫二鉀溶液的濃度為14wt%_15wt%。4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，其特征在于，殼聚糖醋酸溶液的濃度為2.3wt%。5.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，其特征在于，磷酸氫二鉀溶液的濃度為14.75wt%。6.一種制備權(quán)利要求I所述可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥的方法，其特征在于它包括如下步驟1)將殼聚糖溶于O.IM的醋酸溶液中，配制成濃度為2wt%-2.5wt%的殼聚糖醋酸溶液；2)用去離子水配制濃度為14wt%-15wt%的磷酸氫二鉀溶液；3)上述殼聚糖醋酸溶液、磷酸氫二鉀溶液分別于4°C冰箱保存約O.5小時；4)按各原料的配比為川芎嗪殼聚糖醋酸溶液磷酸氫二鉀溶液=2毫克ImL:lmL，選取川芎嗪、殼聚糖醋酸溶液和磷酸氫二鉀溶液混合，得到可轉(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥。全文摘要本發(fā)明涉及一種可轉(zhuǎn)形穴位注射藥及其制備方法?？赊D(zhuǎn)形穴位注射川芎嗪藥，其特征在于它由川芎嗪、殼聚糖醋酸溶液和磷酸氫二鉀溶液混合而成；各原料的配比為川芎嗪∶殼聚糖醋酸溶液∶磷酸氫二鉀溶液=2毫克∶1mL∶1mL。本發(fā)明為穴位注入藥治療疾病提供一種療效較好、依從性高的新劑型藥。文檔編號A61K9/06GK102716130SQ20121021948公開日2012年10月10日申請日期2012年6月29日優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日發(fā)明者劉本,孔立紅申請人:湖北中醫(yī)藥大學(xué)